鄭暉，周麗，顏亞暉，2，曹盼盼

（1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院病理科，長沙 410078；2中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，長沙 410078）

微小組織冰凍快速制片技術(shù)

鄭暉1，2*，周麗1，顏亞暉1，2，曹盼盼1

（1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院病理科，長沙 410078；2中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，長沙 410078）

目的 摸索提高微小組織冰凍快速制片質(zhì)量的方法。方法 針對小組織冰凍切片中常常出現(xiàn)組織切完、多粒組織切片不全、冰晶、染色不均勻等問題，采用預(yù)先制作冷凍平臺(tái)、快速冷凍等方法來制作優(yōu)質(zhì)的冰凍切片。結(jié)果 組織鋪平可使組織切片完整，快速冷凍可減少冰晶形成，使組織結(jié)構(gòu)更清晰，及時(shí)固定和加溫染色可使細(xì)胞核染色更鮮艷，核、質(zhì)對比明顯。結(jié)論 組織鋪平、速凍、固定、染色等都是提高微小組織制片質(zhì)量的關(guān)鍵。

微小組織，冰凍快速制片

隨著冰凍快速制片技術(shù)在病理診斷中的廣泛應(yīng)用及各種內(nèi)鏡穿刺檢查的廣泛開展，微小組織冰凍快速制片病例越來越多。由于纖維內(nèi)鏡和穿刺組織細(xì)小，黏液、纖維成分較多，給制片和診斷帶來一定的困難，常出現(xiàn)組織切完、多粒組織切片不全、冰晶、染色不均勻等現(xiàn)象，為解決上述問題，提高微小組織冰凍切片的質(zhì)量，我們經(jīng)過反復(fù)實(shí)踐和摸索，獲得了一些經(jīng)驗(yàn)。

材料和方法

1 微小組織來源

微小組織來源于湘雅醫(yī)院臨床穿刺活檢標(biāo)本，包括乳腺、腎穿、胃腸鏡、喉鏡、膀胱鏡、肝穿、胰腺、甲狀腺等穿刺標(biāo)本。

2 儀器

冰凍切片機(jī)（LEICA CM 195），工作前將溫度設(shè)置為-20～-25℃。

3 試劑

酒精福爾馬林冰醋酸（alcohol formalin glacial acetic acid，AAF）混合固定液：95%酒精80mL＋福爾馬林15 mL＋冰醋酸5 mL混合。

4 標(biāo)本前期處理

先在冷凍頭上平鋪薄層冰凍切片包埋劑（普通膠水），凍硬后修平，用吸水紙吸干微小組織中的水分，如果是胃腸鏡、喉鏡、膀胱鏡獲取的多粒新生組織，須將組織一點(diǎn)一點(diǎn)快速平放于剛修好的冷凍頭上；如為腎穿、肝穿、乳腺穿刺的長條形組織，則須一條一條整齊的排列于剛備好的冷凍頭上，不要互相重疊，再補(bǔ)加少量包埋劑使組織全部被包裹，按下速凍鍵，加上速凍器速凍幾秒即可。

5 切片染色

將鋒利無缺口的刀片預(yù)冷；切片前調(diào)整好組織與刀片的角度，這是微小組織冰凍切片準(zhǔn)備中極為重要的步驟。對于穿刺條索狀組織應(yīng)與刀片垂直或成60度角，這樣易使切片拉平，含脂肪的組織脂肪放在最后接觸刀口；切片時(shí)使用螺旋扭慢慢修切，待組織剛暴露時(shí)切一張4～5μm薄片，貼于載玻片的左邊，稍修切，待組織充分暴露時(shí)再深切一張同樣的薄片貼于玻片右邊，這樣每張載玻片上都貼有深淺各一的組織一片，用AAF固定液立即固定，常規(guī)HE染色，注意染色前蘇木素染液須預(yù)溫到60℃。待病理醫(yī)生報(bào)告結(jié)果后將剩余組織洗干凈膠水，再用擦鏡紙包好放入10%中性福爾馬林固定液中固定做石蠟切片。

結(jié) 果

為了解決微小組織冰凍制片中常常出現(xiàn)切片不全、冰晶、染色不均勻等問題，采用預(yù)凍包埋平臺(tái)、吸水、速凍組織等方法制作出優(yōu)質(zhì)的冰凍切片。我們發(fā)現(xiàn)預(yù)先制作冷凍平臺(tái)平鋪組織可使多粒組織切全且組織不會(huì)切完（圖1A，圖1B）；用吸水紙吸干小組織中的水分和快速冷凍可以減少組織中的冰晶（圖1C），由此解決了過去微小組織冰凍制片中常常出現(xiàn)切片不全、冰晶孔隙擠壓周圍組織而改變組織原來的形態(tài)結(jié)構(gòu)等問題（圖1D）

圖1　微小組織冰凍制片。A，組織包裹在膠水中；B，組織切片后肉眼觀；C，HE染色微小組織冰凍切片光鏡觀；D，冰晶擠壓周圍組織HE染色光鏡觀；比例尺，100μmFig.1　Preparation of frozen sections of small tissues.A，tissues embedded in glue；B，naked eye view of the tissue sections prepared；C，light microscopic view of an HE stained frozen section of small tissue；D，light microscopic view of HE stained tissue extruded by ice crystals；scale bar，100μm

討 論

對于微小組織制作冰凍快速制片，要做到既要將每一點(diǎn)小組織切全，又不將組織切完。在取材前，預(yù)先在冷凍頭上平鋪薄層膠水凍好并修平，可墊高組織并使小組織平鋪于包埋劑中，便于組織切全且不使組織切完，否則容易出現(xiàn)有的組織已切完而有的組織還沒切到，同時(shí)可防止刀刃切到冷凍頭而造成機(jī)器損傷。在冰凍快速制片中如何消除冷凍組織內(nèi)的冰晶是病理技術(shù)人員要解決的一個(gè)難點(diǎn)。生物體內(nèi)細(xì)胞中水分占80%～90%，水在各種組織中含量都很多，冷凍過程中組織中的水分常會(huì)形成冰晶孔隙擠壓周圍組織，改變甚至破壞組織原來的形態(tài)結(jié)構(gòu)而影響制片質(zhì)量。為了減少組織內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，我們用吸水紙吸干組織中的水分，立即按下速凍鍵，加上速凍器快速冷凍可大大減少了冰晶形成，因使組織溫度急速下降到冷凍切片所需要的溫度，是防止冰晶形成最簡便易行且效果最確切的好辦法［1］，所以在制片時(shí)必須使組織在極短的時(shí)間內(nèi)驟冷速凍，才能避免冰晶的干擾，組織結(jié)構(gòu)才能清晰，細(xì)胞形態(tài)才能完好。

為了制作出高質(zhì)量的冰凍切片，除嚴(yán)格按上述方法外，應(yīng)注意如下幾點(diǎn)：①注意冷凍時(shí)間和溫度，不同組織需要冷凍的時(shí)間和溫度不同，普通小組織其冷凍溫度一般-20～-22℃，脂肪組織一般-25～-30℃，冷凍時(shí)間需更長［2］。冷凍不夠，組織會(huì)皺成一堆，細(xì)胞堆集。冷凍過度，會(huì)使組織變脆?？捎弥父怪糜诮M織塊表面使組織復(fù)溫。②及時(shí)固定切好的組織，在干凈的載玻片上貼附后應(yīng)立刻放入固定液中固定，勿使切片在空氣中干燥，否則會(huì)造成細(xì)胞核在空氣中發(fā)生退變，細(xì)胞著色力下降，導(dǎo)致染色后細(xì)胞核模糊不清［3］，影響鏡檢和診斷。③蘇木素預(yù)溫，可大大縮短染色時(shí)間，且加溫染色可使組織蛋白質(zhì)變性，細(xì)胞核染色更清晰透明，碳酸鋰返藍(lán)后水洗要充分，否則伊紅著色不均勻。

冰凍快速制片受時(shí)間的限制，要沉著冷靜，不要急于求成，否則適得其反。工作中加強(qiáng)責(zé)任心，注意發(fā)現(xiàn)問題，積累經(jīng)驗(yàn)。我們嚴(yán)格按照上述方法基本解決了微小組織制片中存在的問題，且整個(gè)制片過程只需7～8min，真正做到了快速、準(zhǔn)確。

［1］田玉旺，丁華野，李琳，等.一種減少冷凍切片組織內(nèi)冰晶的處理方法.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2002，18（5）：567-568.

［2］陳杰，鄭莉，張惠.淺談冷凍制片中常見問題與處理.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2010，26（4）：502-503.

［3］陳淑敏，李鳳朝，李琳琳，等.術(shù)中快速冷凍制片技術(shù)要點(diǎn).徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，33（1）：63-64.

Techniques for preparing quick frozen sections of small tissues

Zheng Hui1,2*,Zhou Li1,Yan Yahui1,2,Cao Panpan1
（1Department of Pathology，Xiangya Hospital，2Department of Pathology，Basic medical school，Central South University，Changsha 410078，China）

Objective To explore methods to improve the quality of quick frozen sections of small tissues.MethodsProblems occur frequently in the preparation of frozen sections for small pieces of tissue,such as tissue depletion,incomplete sectioning of multiple tissues,ice crystals and uneven staining.To make high quality frozen sections,several approaches were tried out including preparation of the frozen platform in advance and quick freezing.ResultsFlattering tissue on frozen platform helps to keep tissue section integrity；quick freezing helps to reduce ice crystals in tissue and produce nice sections；brighter cell nuclei and strong stain contrast between the nucleus and cytoplasm were obtained by fixing tissue in time and warming up the staining solution.Conclusion Tissue flattening,quick freezing,fixation and staining are all critical to improving the quality of frozen sections of small tissues.

Small tissue；quick frozen section

R329.33

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.015

2015-11-12

2016-10-10

鄭暉，女（1963年），漢族，高級實(shí)驗(yàn)師

（To whom correspondence should be addressed）：zhenghui7388＠163.com