趙云霞，崔芳芹

（蚌埠醫(yī)學院病理生理學教研室，蚌埠 233030）

血管內皮生長因子-D在乳腺癌淋巴轉移中的臨床意義

趙云霞*，崔芳芹

（蚌埠醫(yī)學院病理生理學教研室，蚌埠 233030）

目的 探討乳腺癌中血管內皮生長因子-D（VEGF-D）對淋巴管生成的作用及其與臨床病理指標和預后的關系。方法 應用免疫組織化學S-P法檢測120例乳腺癌組織中VEGF-D的免疫反應性，同時以D2-40、podoplanin標記微淋巴管，計數微淋巴管密度（LVD），分析其與臨床病理指標及預后的關系。結果 乳腺癌組織中VEGF-D蛋白免疫反應陽性率、LVD值均明顯高于乳腺纖維腺瘤組織；乳腺癌組織中VEGF-D蛋白免疫反應與淋巴結轉移呈正相關，且LVD值與VEGF-D表達呈線性相關。結論 VEGF-D參與乳腺癌淋巴管生成，影響乳腺癌的預后。

乳腺癌；血管內皮生長因子D；微淋巴管密度

乳腺癌轉移以淋巴轉移為主，是乳腺癌進展中較早發(fā)生的事件。乳腺癌的淋巴道侵襲和轉移是導致病人預后不良的重要因素，因此抗淋巴道轉移成為乳腺癌治療的新方向。腫瘤新生淋巴管在淋巴轉移過程中起著重要作用［1-3］。血管內皮生長因子-D（vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D）與其受體結合，通過酪氨酸激酶信號轉導通路促進淋巴道內皮的增生和遷移［4］。有研究表明VEGF-D可促進瘤內淋巴管的生成和淋巴結轉移［5］。Podoplanin是目前較特異的淋巴管標記物之一，D2-40特異性表達于淋巴管內皮細胞，而不表達于血管內皮細胞，因此目前被認為是淋巴管內皮細胞特異性標記物。腫瘤微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LVD）可反映腫瘤淋巴管的生成，是腫瘤淋巴轉移獨立的危險因子［6］。為揭示VEGF-D在乳腺癌淋巴轉移中的作用，本研究觀察了乳腺癌中VEGFD的反應性和LVD變化及其與臨床病理指標的關系。

材料和方法

1 標本

收集2008年6月至2012年6月間蚌埠醫(yī)學院病理學教研室（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科）存檔的手術切除的乳腺癌石蠟標本120例。術前患者未接受放、化療及內分泌治療，所有標本再次復查確認?；颊吣挲g31～85歲，平均年齡53歲（中位年齡50歲）。標本中浸潤性導管癌98例，其他22例。病理分級：Ⅰ級 18例；Ⅱ級78例；Ⅲ級 24例。參照TNM分期［7］，將標本按腫瘤大小分為3組：最大直徑≤2.0cm者12例，直徑為2.0～5.0cm者88例，最大直徑＞5.0cm者20例。76例有淋巴結轉移，44例無淋巴結轉移。另隨機選取同期乳腺纖維腺瘤標本30例作為對照。

2 試劑和方法

所有標本均經10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚4μm），分別行HE染色和S-P法免疫組織化學染色，用已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。兔抗人VEGF-D、鼠抗人D2-40單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發(fā)公司，鼠抗人podoplanin單克隆抗體購自上海晶美生物技術有限公司，工作濃度分別為1：500、1：70和1：200。

3 結果判斷

VEGF-D在乳腺癌細胞的免疫反應陽性產物定位于細胞質。用染色強度、陽性細胞比例兩個指標評定VEGF-D陽性表達水平。按染色強度評分：不著色0分，著色弱1分，著色清晰為2分，著色強3分。按陽性細胞所占的百分率評分：無細胞著色0分，著色細胞0～10%1分，10%～30%2分，30%～50%3分，50%以上4分。染色強度與陽性細胞比例相加，0～2分為陰性，3分（＋），4～5分（＋＋），6分（＋＋＋），7分（＋＋＋＋）。

D2-40、Podoplanin免疫反應陽性產物均定位于淋巴管內皮細胞，以胞質或胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽性表達。本研究中D2-40、podoplanin標記均以表達陽性的淋巴管作為有意義的淋巴管，以此計算LVD值。淋巴管密度計數的方法參照文獻［8］：先于低倍鏡（×10物鏡）下確定3個淋巴管數目最多的熱點，然后在高倍鏡（×40物鏡）下計數，每個熱點計數5個高倍鏡視野的淋巴管數目，最終取3個熱點格5個高倍鏡下淋巴管平均數目作為腫瘤LVD值。

4 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件對數據進行分析，LVD值兩種不同檢測方法間的比較采用t檢驗，VEGF-D免疫反應性與臨床病理指標間關系的比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗，VEGF-D免疫反應性與LVD值間關系的比較采用t檢驗及單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結　果

1 乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應性增強

VEGF-D免疫反應陽性產物為棕黃色或棕褐色的顆粒，位于細胞質中（圖1）。乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應性陽性率（82.50%）明顯高于同期乳腺纖維腺瘤組織（23.33%）。

圖1　VEGF-D免疫反應性在乳腺癌組織細胞質內的定位。比例尺，100μmFig.1　Localization of VEGF-D immunoreactivity in the cytoplasm of the mammary carcinoma tissue.Scale bar，100μm

2 乳腺癌組織中LVD增加

D2-40、podoplanin標記陽性的淋巴管管壁由單層內皮細胞排列而成，壁薄，管腔具有不規(guī)則形態(tài)，管腔中無紅細胞。在癌周組織中淋巴管豐富，壁薄管腔大；中心區(qū)淋巴管少且管腔狹窄或呈條索狀。以癌周組織中的淋巴管數目計數淋巴管密度，結果顯示，癌周組織中D2-40陽性標記（圖2A，圖2B）的LVD值（28.32±6.63）和podoplanin標記陽性（圖2C，圖2D）的LVD值（27.88±6.19）明顯高于同期乳腺纖維腺瘤組織，兩者同時陽性的LVD值26.66 ±6.56。D2-40、podoplanin標記淋巴管數目的陽性率具有一致性（表1）。

圖2　乳腺癌癌旁組織淋巴管的D2-40（A和B）和podoplanin（C和D）免疫組織化學標記。比例尺，100μmFig.2　D2-40（A and B）and podoplanin（C and D）immunohistochemical labelling of lymphatic vessels in the tissue adjacent to the breast carcinoma.Scale bar，100μm

表1　乳腺癌癌旁組織中　D2-40與　Podoplanin標記的微淋巴管密度Table 1　D2-40-and podoplanin-labelled LVD in the tissue adjacent to the breast carcinoma

3 乳腺癌中VEGF-D免疫反應性與淋巴結轉移呈正相關

76例有淋巴結轉移的乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應陽性率為88.16%，高于無淋巴結轉移組，VEGF-D免疫反應性與淋巴結轉移呈正相關，而與腫瘤病理類型、腫瘤分級及大小等其他多個病理指標間無相關性（表2）。

4 VEGF-D免疫反應性與LVD值的關系

120例乳腺癌患者中，99例VEGF-D免疫反應陽性病例中LVD值為28.66±4.90，高于陰性組的LVD值17.24±5.07，兩者之間呈線性相關（表3）。

表2　VEGF-D免疫反應性與乳腺癌臨床病理指標的關系Table 2　Correlation between VEGF-D-immunoreactivity and clinicopathological features in breast carcinoma

表3　乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應性與LVD值的關系Table 3　Relationship between VEGF-D-immunoreactivity and LVD in breast carcinoma

討　論

長期以來人們試圖阻斷腫瘤的血道轉移以改善腫瘤預后，但效果并不理想。而臨床觀察證實，淋巴轉移是多種腫瘤發(fā)展過程中的早期事件。淋巴轉移也是決定乳腺癌分期和治療方案的關鍵因素之一，是影響乳腺癌療效和預后的重要因素。因此阻斷腫瘤淋巴轉移成為改善腫瘤預后的可能途徑。D2-40目前被認為是特異性較強的淋巴管內皮細胞標記物，它在成熟的淋巴管上不表達，但在多種腫瘤新生淋巴管內皮呈免疫反應陽性［9］，例如，在胃癌［10］、前列腺癌、和腎癌［11］等腫瘤的淋巴管內皮都呈D2-40免疫反應陽性。本研究發(fā)現，D2-40標記的乳腺癌組織中的微淋巴管在癌周區(qū)域管腔大，密度高，而癌中心區(qū)僅為裂隙狀或條索狀微淋巴管結構，且數量少。由此提示，腫瘤的淋巴轉移可能是通過癌周的新生淋巴管實現的。Podoplanin亦被認為是較特異的淋巴管內皮標記物之一，是檢測腫瘤內部新生的淋巴管較可靠的指標［12］。本研究中采用D2-40和podoplanin標記同一乳腺癌組織中的淋巴管內皮細胞并分別計數LVD值，發(fā)現兩者免疫反應性相似，用兩種方法標記乳腺癌組織測得的LVD值相近，且都與對照組有顯著差異。因此認為兩種標記物在淋巴管內皮細胞的表達無差異，均能客觀地反應腫瘤組織內部淋巴管新生情況，均為可靠的特異性的淋巴管內皮細胞標記物。此結果與文獻報道一致［13］。

近來的研究表明，腫瘤淋巴轉移并非是被動的，而是一個主動過程。某些因子刺激會促進淋巴管的生成，而新生淋巴管是導致淋巴轉移的先決條件［14］。目前研究最多的促淋巴轉移的因子就是血管內皮生長因子VEGF-C和VEGF-D及其受體。VEGF-D及其受體在直腸癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤中被認為與淋巴轉移密切相關，且被認為是腫瘤獨立的預后不良指標［13，15，16］，但對乳腺癌的預后價值仍存在較大爭議。目前研究表明，VEGF-D通過旁分泌和自分泌的形式發(fā)揮作用，腫瘤細胞合成和分泌的VEGF-D可誘導其受體 VEGFR-3表達，進而活化CRB2／ERX1／2及PI3K／AKT信號通路，觸發(fā)MAPK級聯反應，促使淋巴管內皮細胞增殖及淋巴管新生，為腫瘤淋巴轉移提供條件。前期研究已證實VEGF-3在乳腺癌的淋巴轉移中具有作用，是乳腺癌淋巴管生成的重要誘導因子［17］。本研究結果顯示，VEGF-D在乳腺癌腫瘤細胞中表達顯著增高，其表達與淋巴結轉移有關，且VEGF-D免疫反應陽性的乳腺癌組織中LVD值顯著高于陰性組，由此推斷在乳腺癌組織中VEGF-D合成和分泌增多，與其受體結合后通過相應的信號轉導通路促使腫瘤內部淋巴管的生成，導致淋巴轉移，而淋巴轉移是乳腺癌預后的重要影響因素，因此認為VEGF-D的高表達與乳腺癌的淋巴轉移和不良預后有關［18，19］。由此可見，VEGF-D在乳腺癌的淋巴管生成中具有重要作用，影響乳腺癌的侵襲和轉移，可作為乳腺癌重要的預后指標。

乳腺癌淋巴轉移往往發(fā)生較早且預后差，因此抗淋巴轉移治療是乳腺癌治療的重要方向。本研究結果提示腺癌組織中的D2-40、podoplanin和VEGFD的表達可以初步評估腫瘤的侵襲和轉移能力，為乳腺癌患者的下一步臨床治療提供參考，且 VEGF-D所涉及的信號轉導通路可能成為乳腺癌靶向治療的新路徑。

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The clinical significance of vascular endothelial growth factor-D in lymphatic metastasis of breast cancer

Zhao Yunxia*,Cui Fangqin
（Department of Physiopathology，Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

Objective To investigate the role of vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)in the lymphangiogenesis of breast cancer and to evaluate its relationship with the clinicopathological characteristics and prognosis.Methods The S-P immunohistochemical method was used to detect VEGF-D immunoreactivity in 120 cases of breast cancer,and lymphatic endothelial cells were marked with D2-40 and podoplanin simultaneously.Lymphatic vessel density(LVD)was then counted,and its relationship with the clinical pathological parameters and prognosis of breast cancer was analyzed.Results Both the positive rates of VEGF-D and LVD were significantly higher in breast cancer than in breast fibro-adenoma tissue.VEGF-D immunoreactivity was positively associated with the lymph node metastasis of breast cancer.LVD was linearly correlated with the expression of VEGF-D.Conclusion VEGF-D affects breast cancer prognosis through facilitating lymphangiogenesis.

Breast cancer；vascular endothelial growth factor-D；lymphatic vessel density

R73-37

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.011

2015-11-21

2016-10-08

安徽省教育廳高校自然科學基金項目（KJ2015B106by，KJ2016A867）

趙云霞，女（1977年），漢族，講師

（To whom correspondence should be addressed）：zhyx201312＠163.com