馮瑞，趙玫

鈣蛋白酶及其抑制劑對心肌肥厚模型大鼠心肌肥厚作用的研究

馮瑞，趙玫

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽 110004）

目的研究鈣蛋白酶calpain及其抑制劑MDL28170與心肌肥厚的關(guān)系，探討心肌肥厚可能的作用機(jī)制。方法50只280～350 g成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC組，n=5）、假手術(shù)組（SO組，n=5）、手術(shù)組（AO組，n=20）、手術(shù)+治療組（AO+T組，n=20）。對AO組及AO+T組大鼠施行腹主動脈縮窄術(shù)建立心肌肥厚大鼠模型。4周后行心臟彩超檢查。AO+T組大鼠MDL28170治療2周后再行心臟彩超檢查。取心臟稱重，計(jì)算心重指數(shù)。Western blot檢測心肌中calpain1、calpain2、CaN A的表達(dá)。結(jié)果心臟彩超證實(shí)4周后AO組及AO+T組大鼠心肌肥厚模型建立成功。藥物干預(yù)后，AO+T組大鼠心肌肥厚得到控制，進(jìn)展延緩，與AO組相比差距明顯（P＜0.05）。AO組、AO+T組大鼠心臟質(zhì)量、心重指數(shù)較NC組和SO組增加，AO組增加更明顯（均P＜0.05）。與NC組相比，calpain1、calpain2、CaN A表達(dá)量在其余3組均有增加；而AO+T組與AO組比較calpain1、calpain2、CaN A表達(dá)量降低（P＜0.05）。結(jié)論鈣蛋白酶calpain與心肌肥厚關(guān)系密切，CaN途徑是其作用機(jī)制之一；calpain抑制劑MDL28170對實(shí)驗(yàn)條件下的心肌肥厚具有明顯阻遏作用。

心肌肥厚；大鼠；鈣蛋白酶；calpain；抑制劑；MDL28170；信號通路；CaN

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細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增加是心肌肥厚的基本信號［1?3］。目前大量研究［4?6］表明，鈣蛋白酶calpain與心肌肥厚關(guān)系密切。calpain活性可影響諸多與心肌肥厚、重構(gòu)有關(guān)的信號通路［鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calci?neurin，CaN）信號通路、核因子κB（nuclear factor?kappa B，NF?κB）信號通路］。這些信號通路激活后可從轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)心肌肥厚［7-8］。DOUILLARD等［9］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)calpain內(nèi)源性抑制劑calpastatin的大鼠與對照組相比可明顯減輕藥物介導(dǎo)的骨骼肌肥厚程度；LI等［10］發(fā)現(xiàn)在Ⅰ型糖尿病大鼠模型中，通過過表達(dá)calpastatin，心肌肥厚、纖維化得到明顯改善。本研究通過縮窄大鼠腹主動脈的方法建立心肌肥厚大鼠模型，同時采用calpain抑制劑MDL28170對發(fā)生心肌肥厚的大鼠進(jìn)行治療，旨在探討calpain與心肌肥厚的關(guān)系及其作用機(jī)制，為以calpain為靶點(diǎn)的心肌肥厚治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

主要包括50只280～350 g成年雄性Wistar大鼠（SPF級，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心），MDL28170（英國Tocris Bioscience公司），兔抗大鼠calpain1單克隆抗體、兔抗大鼠calpain2單克隆抗體、兔抗大鼠CaN A單克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.2方法

1.2.1分組、建模、給藥、取材：將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC組，5只）、假手術(shù)組（SO組，5只）、手術(shù)組（AO組，20只）、手術(shù)+治療組（AO+ T組，20只），稱重標(biāo)記。AO組及AO+T組大鼠用7號針頭及3?0絲線將其腹主動脈在雙側(cè)腎動脈以上約1 cm水平處縮窄到管徑為0.7 mm左右的管腔，繞線結(jié)扎。SO組大鼠只繞線不結(jié)扎。NC組大鼠不做任何處理。所有大鼠正常飼養(yǎng)4周后行心臟彩超檢查，AO+T組大鼠腹腔注射MDL28170［20mg/（kg·d）］，連續(xù)用藥2周。其余3組大鼠按體質(zhì)量給予同等劑量的含5%DMSO的生理鹽水。6周時再次行心臟彩超檢查，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)后麻醉，開胸，冰生理鹽水持續(xù)心臟灌流。取心臟稱重后-80℃凍存。

1.2.2心肌肥厚的判定：第4周及第6周末行心臟彩超檢查。記錄舒張末期室間隔厚度（interventricu?lar septum thickness at end?diastole，IVSTd）、左心室內(nèi)徑（left ventricular end?diastolic diameter，LVEDD）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thick?ness at end?diastole，LVPWTd）、左心室舒張末期容積（left ventricular end?diastolic volume，LVEDV）、收縮末期容積（left ventricular end?systolic volume，LVESV）、短軸縮短率（left ventricular fractional short?ening，LVFS）、射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection frac?tion，LVEF）等指標(biāo)，判斷大鼠心肌肥厚情況及心功能情況。

1.2.3心重指數(shù)（heart mass index，HMI）的測定：6周末取心臟稱重，HMI（mg/g）=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.4Western blot檢測：取-80℃凍存的心臟標(biāo)本，剪取室間隔及左心室組織塊（約0.1 g），檢測cal?pain1、calpain2、CaN A的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參。利用圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況及體質(zhì)量、心質(zhì)量、心重指數(shù)比較

入組時（0周）各組大鼠體質(zhì)量無明顯差別（P＞0.05），經(jīng)過一段時間不同處理后，各組大鼠體質(zhì)量增幅相似，不同時間（4周、6周）體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明腹部手術(shù)對存活下來的動物一般生長情況不構(gòu)成明顯影響。在AO組和AO+T組，動物一般狀態(tài)明顯較NC組和SO組差。AO組及AO+T組的心臟質(zhì)量、心重指數(shù)明顯高于NC組及SO組（P＜0.05）；AO+T組心肌肥厚情況較AO組好轉(zhuǎn)，心臟質(zhì)量及心重指數(shù)降低（P＜0.05）。見表1。

表1　不同時間大鼠體質(zhì)量及心臟質(zhì)量、心重指數(shù)比較Tab.1　Comparison of body weight and heart weight at different time and calculation of heart mass index

表1　不同時間大鼠體質(zhì)量及心臟質(zhì)量、心重指數(shù)比較Tab.1　Comparison of body weight and heart weight at different time and calculation of heart mass index

1）P＜0.05 vs NC group；2）P＜0.05 vs AO group.HMI，heart mass index.

Group　Body weight（g）　Heart weight（6 weeks，g）　HMI（mg/g）0 week　4 weeks　6 weeks NC　306.60±21.09　423.40±45.36　446.20±31.03　1.13±0.19　2.52±0.26 SO　319.00±15.16　442.80±23.39　464.60±16.27　1.25±0.10　2.70±0.17 AO　312.81±17.96　425.54±39.97　439.27±30.19　1.96±0.191）　4.45±0.231）AO+T　319.00±14.97　436.33±23.16　453.41±17.20　1.49±0.071），2）　3.29±0.131），2）

2.2各組大鼠心肌肥厚及左心功能比較

心臟彩超檢查顯示，第4周末，與NC組、SO組比較，AO組、AO+T組大鼠室間隔、左心室壁明顯增厚（P＜0.05）；心腔大小、左心功能等指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），證明大鼠心肌肥厚建模成功。第6周末AO組大鼠較2周前心肌肥厚進(jìn)一步加重，表現(xiàn)為室間隔、左心室壁心肌進(jìn)一步增厚，與NC組及SO組差別明顯（P＜0.05）；而AO+T組大鼠與NC組相比仍有心肌肥厚表現(xiàn)（P＜0.05），但肥厚程度與AO組相比有所減輕；室間隔、左心室壁厚度AO+T組與AO組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。而其他指標(biāo)4組大鼠表現(xiàn)出不同趨勢，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2　術(shù)后4周、6周各組大鼠心肌肥厚及左心功能指標(biāo)比較Tab.2　Comparison of indicators of myocardial hypertrophy and left ventricular function 4 weeks/6 weeks after the abdominal operation

表2　術(shù)后4周、6周各組大鼠心肌肥厚及左心功能指標(biāo)比較Tab.2　Comparison of indicators of myocardial hypertrophy and left ventricular function 4 weeks/6 weeks after the abdominal operation

1）P＜0.05 vs NC group；2）P＜0.05 vs NC group；3）P＜0.05 vs AO group.LVEDD，left ventricular end?diastolic diameter；LVEDV，left ventricular end?diastolic volume；LVESV，left ventricular end?systolic volume；LVFS，left ventricular fractional shortening；LVEF，left ventric?ular ejection fraction；IVSTd，interventricular septum thickness at end?diastole；LVPWTd，left ventricular posterior wall thickness at end?dias?tole.

Item 4 weeks NC（n=5）　SO（n=5）　AO（n=11）　AO+T（n=12）LVEDD（mm）　6.48±0.45　6.62±0.38　6.65±0.58　6.85±0.54 LVEDV（mL）　0.47±0.12　0.47±0.15　0.56±0.12　0.60±0.13 LVESV（mL）　0.14±0.02　0.17±0.14　0.13±0.03　0.14±0.03 LVFS（%）　39.48±3.83　37.56±1.56　36.59±3.38　36.87±2.37 LVEF（%）　75.66±4.34　73.08±1.80　73.20±4.79　73.45±2.92 IVSTd（mm）　1.10±0.07　1.16±0.15　1.56±0.131）　1.55±0.081）LVPWTd（mm）　1.04±0.04　1.10±0.05　1.57±0.091）　1.55±0.061）Item　6 weeks NC（n=5）　SO（n=5）　AO（n=11）　AO+T（n=12）LVEDD（mm）　6.40±0.55　6.50±0.25　6.79±0.43　6.81±0.41 LVEDV（mL）　0.49±0.14　0.54±0.09　0.59±0.13　0.61±0.07 LVESV（mL）　0.12±0.02　0.18±0.13　0.14±0.03　0.15±0.03 LVFS（%）　38.80±2.75　40.00±3.81　36.35±3.55　37.95±2.27 LVEF（%）　75.22±2.40　74.22±3.11　73.04±4.04　73.87±2.28 IVSTd（mm）　1.24±0.05　1.26±0.08　1.77±0.092）　1.63±0.032），3）LVPWTd（mm）　1.24±0.04　1.27±0.05　1.77±0.072）　1.64±0.042），3）

2.3Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

檢測結(jié)果表明，SO組出現(xiàn)了calpain1、calpain2、CaN A表達(dá)上調(diào)；AO組calpain1、calpain2、CaN A的表達(dá)較NC組及SO組明顯升高（P＜0.05）；AO+T組3種蛋白呈現(xiàn)出弱表達(dá)，與AO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示手術(shù)應(yīng)激可能對calpain、CaN的表達(dá)產(chǎn)生了影響，calpain1、calpain2、CaN表達(dá)受到了特異性抑制劑的強(qiáng)力抑制作用。見圖1、表3。

圖1　各組大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig.1　Expression of related proteins in myocardial tissue from the 4 groups

3　討論

calpain是一類存在于細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，分為組織特異性和非特異性兩大類。非特異性calpain包括u?calpain（calpain1）和m?calpain（calpain2），在人體內(nèi)廣泛表達(dá)。u?calpain和m?calpain均是由1個28×103亞基和1個80×103亞基組成的異二聚體，2種蛋白酶之間序列同源性達(dá)50%～60%，區(qū)別只在于被激活時所需要的Ca2+濃度不同：前者在微摩爾水平，后者在毫摩爾水平。由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度通常波動在微摩爾水平，因此推測在生理狀態(tài)下主要是calpain1在發(fā)生作用。研究［11］表明，calpain可通過介導(dǎo)以下2條主要的信號通路影響心肌肥厚的表達(dá)：通過水解CaN生成活性片段和水解CaN的內(nèi)源性抑制劑Cain/Cabin1激活CaN信號通路；通過降解胞質(zhì)中與NF?κB結(jié)合的抑制因子IκBα激活NF?kB信號通路等。

表3　各組大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)比較Tab.3　Expression of related proteins in myocardial tissue from the 4 groups

表3　各組大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)比較Tab.3　Expression of related proteins in myocardial tissue from the 4 groups

1）P＜0.05 vs NC group；2）P＜0.05 vs AO group.

Group　Calpain1　Calpain2　CaN A NC　0.42±0.04　0.38±0.04　0.36±0.05 SO　0.86±0.051）　0.64±0.051）　0.60±0.071）AO　1.58±0.081）　0.96±0.051）　1.26±0.061）AO+T　0.78±0.041），2）　0.58±0.061），2）　0.52±0.051），2）

本研究心臟彩超證實(shí)，在發(fā)生心肌肥厚的基礎(chǔ)上對AO+T組大鼠應(yīng)用calpain特異性抑制劑—MDL28170 2周后，AO+T組大鼠心肌肥厚進(jìn)程得到控制，心肌肥厚程度較AO組明顯減輕。心臟標(biāo)本測算后提示AO+T組心臟質(zhì)量、心重指數(shù)較AO組有所減輕。證明calpain在試驗(yàn)條件下的心肌肥厚進(jìn)程中具有促進(jìn)作用，應(yīng)用其特異性抑制劑可明顯抑制此種條件下心肌肥厚的進(jìn)展，有一定治療效果。

Western blot檢測結(jié)果表明，手術(shù)應(yīng)激也可對calpain、CaN的表達(dá)產(chǎn)生影響，體現(xiàn)在SO組出現(xiàn)了calpain1、calpain2、CaN A表達(dá)上調(diào)。AO組3種蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)再次印證了calpain在心肌肥厚進(jìn)程中的重要作用。AO+T組3種目的蛋白呈現(xiàn)弱表達(dá)，與AO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示calpain1、calpain2、CaN表達(dá)均受到了特異性抑制劑的強(qiáng)力抑制作用。AO組蛋白表達(dá)量從大到小依次為：calpain1、CaN A、calpain2。由此推論CaN途徑是calpain致心肌肥厚進(jìn)程中的一條重要信號通路，其在心肌肥厚進(jìn)程中的作用不可忽視。而calpain的特異性抑制劑仍然可以通過抑制calpain的活性來抑制其下游CaN的激活。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了calpain與心肌肥厚進(jìn)程的關(guān)系，驗(yàn)證了特異性抑制劑的抑制與保護(hù)作用。然而抑制劑的應(yīng)用存在一個時間節(jié)點(diǎn)問題，本實(shí)驗(yàn)在心肌肥厚進(jìn)展到一定程度時才給予抑制劑治療，并未設(shè)立更早時間點(diǎn)來觀察。而且治療階段僅2周，抑制劑的長期作用效果如何不得而知。另外，入組實(shí)驗(yàn)動物數(shù)目基數(shù)較小，結(jié)論具有一定的局限性。

［1］MIZUKAMI K，YOKOSHIKI H，MITSUYAMA H，et al.Small?con?ductance Ca2+?activated K+current is upregulated via the phosphory?lation of CaMKⅡin cardiac hypertrophy from spontaneously hyper?tensive rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2015，309（6）：H1066-H1074.DOI：10.1152/ajpheart.00825.2014.

［2］HORTON JS，BUCKLEY CL，ALVAREZ EM，et al.The calcium re?lease?activated calcium channel orai1 represents a crucial compo?nent in hypertrophic compensation and the development of dilated cardiomyopathy［J］.Channels（Austin），2014，8（1）：35-43.DOI：10.4161/chan.26581.

［3］LUO X，HOJAYEV B，JIANG N，et al.STIM1?dependent store?oper?ated Ca2+entry is required for pathological cardiac hypertrophy［J］. J Mol Cell Cardiol，2012，52（1）：136-147.DOI：10.1016/j. yjmcc.2011.11.003.

［4］MEI M，TANG F，LU M，et al.AstragalosideⅣattenuates apoptosis of hypertrophic cardiomyocyte through inhibiting oxidative stress and calpain?1 activation［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2015，40（3）：764-773.DOI：10.1016/j.etap.2015.09.007.

［5］YE T，WANG Q，ZHANG Y，et al.Over?expression of calpastatin in?hibits calpain activation and attenuates post?infarction myocardial remodeling［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0120178.DOI：10.1371/ journal.pone.0120178.

［6］KUDO?SAKAMOTO Y，AKAZAWA H，ITO K，et al.Calpain?depen?dent cleavage of N?cadherin is involved in the progression of post?myocardial infarction remodeling［J］.J Biol Chem，2014，289（28）：19408-19419.DOI：10.1074/jbc.M114.567206.

［7］PENNANEN C，PARRA V，MORALES PE，et al.Mitochondrial fis?sion is required for cardiomyocyte hypertrophy mediated by a Ca2+?calcineurin signaling pathway［J］.J Cell Sci，2014，127（12）：2659-2671.DOI：10.1242/jcs.139394.

［8］GASPAR?PEREIRA S，F(xiàn)ULLARD N，TOWNSEND PA，et al.The NF?κB subunit c?Rel stimulates cardiac hypertrophy and fibrosis［J］.Am J Pathol，2012，180（3）：929-939.DOI：10.1016/j.aj?path.2011.11.007.

［9］DOUILLARD A，GALBES O，BEGUE G，et al.Calpastatin overex?pression in the skeletal muscle of mice prevents clenbuterol?in?duced muscle hypertrophy and phenotypic shift［J］.Clin Exp Phar?macol Physiol，2012，39（4）：364-372.DOI：10.1111/j.1440?1681.2012.05677.x.

［10］LI Y，MA J，ZHU H，et al.Targeted inhibition of calpain reduces myocardial hypertrophy and fibrosis in mouse models of type 1 dia?betes［J］.Diabetes，2011，60（11）：2985-2994.DOI：10.2337/ db10?1333.

［11］LI X，LUO R，CHEN R，et al.Cleavage of IκBα by calpain induces myocardial NF?κB activation，TNF?α expression，and cardiac dys?function in septic mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2014，306（6）：H833-H843.DOI：10.1152/ajpheart.00893.2012.

（編輯武玉欣）

Myocardial Hypertrophy Process in Rat Model of Myocardial Hypertrophy Mediated by Calpain and Its Inhibitor

FENG Rui，ZHAO Mei
（Department of Cardiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between calpain and myocardial hypertrophy，and further explore the underlying mecha?nism.MethodsA total of 50 adult male Wistar rats（280?350 g）were randomly divided into 4 groups：normal control group（NC，n=5），sham operation group（SO，n=5），abdominal aortic operation group（AO，n=20），abdominal aortic operation plus treatment group（AO+T，n=20）. AO group and AO+T group

the surgery of abdominal aortic coarctation.After 4 weeks，rats of AO+T group were given MDL28170 for ther?apy for 2 weeks.Then echocardiography examination was performed.The heart mass and calculate the ratio of heart mass and body weight in each group were recorded.The expression of calpain1，calpain2 and CaN A of myocardial tissue were determined by Western blot.ResultsThe myo?cardial hypertrophy model was successfully established in both AO and AO+T group 4 weeks after operation，as echocardiography indicated.After drug intervention，rats of AO+T group developed a much slower progress of myocardial hypertrophy and the progressing was under control，which showed a significant gap compared with AO group（P＜0.05）.The heart mass and the heart mass index（HMI）were increased significantly in AO and AO+T group than the other two groups，especially in AO group which was more serious（P＜0.05）.Compared with NC group，the expression level of calpain1，calpain2，and CaN A were increased in the other 3 groups，while AO+T group showed a reduced expression by contrast of AO group.The differences between these 2 groups were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionCalpain is closely related with myocardial hypertrophy，and CaN signaling pathway is one of the most important mechanisms；calpain inhibitor MDL28170 has an obvious inhibition effect on myocardial hypertrophy under the experimental conditions.

myocardial hypertrophy；rat；calpain；inhibitor；MDL28170；signaling pathway；CaN

R542.2

A

0258-4646（2016）09-0769-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.09.001

國家自然科學(xué)基金（81100161）

馮瑞（1988-），女，醫(yī)師，碩士.

趙玫，E-mail：zhaom1@sj?hospital.org

2015-12-23

網(wǎng)絡(luò)出版時間：