馮艷,魏芳
槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制
馮艷,魏芳
(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科,遼寧 大連 116011)
目的研究槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)的影響,并初步探討其作用機(jī)制。方法槲皮素灌胃預(yù)處理10月齡小鼠2周后,進(jìn)行丙泊酚麻醉和腹腔探查術(shù),術(shù)后繼續(xù)槲皮素灌胃處理1周(槲皮素組),同時(shí)設(shè)置對(duì)照組、麻醉組(丙泊酚麻醉)、手術(shù)組(丙泊酚麻醉后行腹腔探查術(shù))。應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)定小鼠處理前后的定位航行能力和空間探索能力;分別應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR和Western blot檢測(cè)小鼠海馬晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比,麻醉組和手術(shù)組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05),原平臺(tái)停留時(shí)間百分比明顯下降(P<0.05),且手術(shù)組變化更為明顯;槲皮素組與對(duì)照組相比,小鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果無明顯差異。與對(duì)照組相比,麻醉組和手術(shù)組小鼠RAGEmRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高(P<0.05),而槲皮素組變化不明顯。RAGEmRNA及蛋白表達(dá)水平與逃避潛伏期呈正相關(guān),與原平臺(tái)停留時(shí)間百分比呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論槲皮素可改善丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的POCD,該作用可能與抑制RAGE表達(dá)有關(guān)。
槲皮素;丙泊酚;術(shù)后認(rèn)知功能障礙;晚期糖基化終末產(chǎn)物受體
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隨著人類預(yù)期壽命逐步提高,我國人口老齡化已逐步顯現(xiàn),接受手術(shù)治療的老年人群逐年增加。術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunc?tion,POCD)為老年人術(shù)后常見并發(fā)癥,輕者僅表現(xiàn)為認(rèn)知異常,中重度則會(huì)出現(xiàn)記憶受損,判斷能力和語言概括能力減弱,甚至癡呆。POCD雖然不會(huì)明顯影響患者外科疾病病程,但會(huì)造成患者生活質(zhì)量下降,延長(zhǎng)住院時(shí)間,增加醫(yī)療成本[1?2]。除與手術(shù)創(chuàng)傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性同發(fā)病、手術(shù)持續(xù)時(shí)間、術(shù)中出血量等相關(guān)外,目前認(rèn)為POCD與麻醉尤其全麻的關(guān)系非常密切[3?4]。有研究[5]顯示,全麻術(shù)后3 d,POCD發(fā)生率在65%左右。
丙泊酚是目前臨床上最常用的靜脈麻醉藥之一,廣泛用于麻醉誘導(dǎo)與維持、重癥患者鎮(zhèn)靜、門診小手術(shù)和內(nèi)鏡檢查等短時(shí)間麻醉。大劑量應(yīng)用丙泊酚常導(dǎo)致患者發(fā)生POCD[6?8],目前尚無有效的防治措施。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物,具有抗氧化、抗癌、抗感染、抗炎、降糖降壓、免疫調(diào)節(jié)多種藥理作用[9]。近年研究顯示,槲皮素還具有顯著改善學(xué)習(xí)記憶的功能[10?12]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product,RAGE)是一種具有多種重要功能的多配體膜受體,新近研究顯示海馬RAGE表達(dá)上調(diào)可能在丙泊酚麻醉導(dǎo)致的POCD中發(fā)揮重要作用[13?14]。因此,本研究采用老齡小鼠,探討槲皮素對(duì)因丙泊酚全麻后手術(shù)誘導(dǎo)POCD的作用及其與RAGE表達(dá)的關(guān)系。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
10月齡雄性昆明種小鼠80只,體質(zhì)量24~28 g,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠編號(hào)后,按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分組,每組20只,共4組,包括陰性對(duì)照組(對(duì)照組)、丙泊酚麻醉組(麻醉組)、丙泊酚麻醉手術(shù)組(手術(shù)組)、丙泊酚麻醉手術(shù)后槲皮素處理組(槲皮素組)。
1.2處理前水迷宮訓(xùn)練
應(yīng)用Morris迷宮(北京碩林苑生物科技有限公司)訓(xùn)練80只小鼠,每天2次,共訓(xùn)練5 d。第5天訓(xùn)練結(jié)束后,測(cè)定每只小鼠的逃避潛伏期(即定位航行能力)以及原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比(即空間探索能力)。
1.3模型建立與藥物處理
Morris水迷宮訓(xùn)練結(jié)束后,對(duì)照組、麻醉組、手術(shù)組小鼠正常飼養(yǎng),槲皮素組小鼠在正常飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上灌胃給予槲皮素(MB1938,大連美侖生物技術(shù)有限公司)1 mg/10 g體質(zhì)量,每日1次。2周后,對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水0.1 mL/10 g體質(zhì)量;麻醉組小鼠腹腔注射相同體積丙泊酚(D126608,美國Sigma?Aldrich公司)1 mg/10 g體質(zhì)量;手術(shù)組小鼠在腹腔注射同劑量丙泊酚產(chǎn)生麻醉效應(yīng)后,進(jìn)行腹腔探查術(shù),術(shù)后進(jìn)行抗感染處理;槲皮素組在丙泊酚麻醉并進(jìn)行腹腔探查術(shù)后次日開始,繼續(xù)灌胃給予槲皮素1 mg/10 g體質(zhì)量,每日1次,共7 d。
1.4認(rèn)知功能評(píng)價(jià)
槲皮素給藥結(jié)束后,應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)試各組小鼠定位航行能力和空間探索能力。
1.5小鼠海馬組織RAGEmRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)
Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后,頸椎脫位法處死小鼠,打開顱腔取出新鮮腦組織置于冰上,參照小鼠腦立體定位圖譜,切取海馬組織,-80℃保存,用于進(jìn)一步檢測(cè)。
提取各組海馬組織總RNA并定量后,于M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)條件為30℃10 min,50℃30 min,95℃5 min,4℃5 min。然后以cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增RAGE基因片段。RAGE上游引物5′?GTGGCTCGAATCCTCCCCAAT?3′,下游引物5′?CCTTCCCTCGCCTGTTAGTTG?3′;GAPDH上游引物5′?GTTAGTGGGGTCTCGCTCTG?3′,下游引物5′?GGCAAATTCAACGGCACA?3′;反應(yīng)條件:95℃5 min后,按照95℃30 s,58℃45 s,72℃30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算海馬組織中RAGEmRNA表達(dá)水平。
提取海馬總蛋白并定量后,每例樣本各取30 μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS?PAGE電泳,并將目的蛋白條帶轉(zhuǎn)移在PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后,加入兔抗RAGE多克隆抗體(1∶1 000稀釋,ab30381,上海Abcam)4℃孵育過夜,次日洗膜后,二抗(1∶1 000稀釋,BA1080,武漢博士德生物工程有限公司)室溫孵育2 h,洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)RAGE蛋白表達(dá),同一樣本重復(fù)3次,以條帶灰度值進(jìn)行分析。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
各組小鼠間學(xué)習(xí)記憶能力、RAGEmRNA和蛋白表達(dá)水平等變量均采用表示,采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,對(duì)各組間上述變量進(jìn)行單因素方差分析,應(yīng)用Pearson相關(guān)分析對(duì)上述變量間的相關(guān)性進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠認(rèn)知功能的影響
應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)定各組小鼠在處理因素施加前后定位航行能力(表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)前小鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)后,與對(duì)照組和槲皮素組相比,麻醉組和手術(shù)組的潛伏期明顯增加(P<0.05);與實(shí)驗(yàn)前相比,實(shí)驗(yàn)后對(duì)照組和槲皮素組潛伏期無明顯變化,而麻醉組和手術(shù)組潛伏期明顯增加(P<0.05),并且手術(shù)組增加更明顯。
表1 槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期的影響Tab.1 Effects of quercetin on the escape latency of mice after propofol anesthesia
應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)定各組小鼠在處理因素施加前后空間探索能力(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)前小鼠原平臺(tái)停留時(shí)間百分比各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)后,與對(duì)照組和槲皮素組相比,麻醉組和手術(shù)組的原平臺(tái)停留時(shí)間百分比明顯減少(P<0.05);與實(shí)驗(yàn)前相比,實(shí)驗(yàn)后對(duì)照組原平臺(tái)停留時(shí)間百分比無明顯變化,而麻醉組、手術(shù)組和槲皮素組原平臺(tái)停留時(shí)間百分比明顯降低(P<0.05),并且手術(shù)組降低最明顯,槲皮素組降低幅度最小。
表2 槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠空間探索試驗(yàn)原平臺(tái)停留時(shí)間百分比的影響Tab.2 Effects of quercetin on the percentage of the primary platform in the space exploration experiment of mice af?ter propofol anesthesia
2.2槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠海馬組織中RAGEmRNA表達(dá)水平的影響
實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,與對(duì)照組小鼠相比,麻醉組和手術(shù)組小鼠海馬組織中RAGEmRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),且手術(shù)組RAGEmRNA表達(dá)水平較麻醉組顯著升高(P<0.05);槲皮素組小鼠RAGEmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組無顯著變化,且比麻醉組和手術(shù)組顯著降低(P<0.05)。見表3。
表3 槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠海馬組織中RAGE mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響Tab.3 Effects of quercetin on the expression of RAGE mRNA and protein in the hippocampus of mice after propofol anesthesia
2.3槲皮素對(duì)丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠海馬組織中RAGE蛋白表達(dá)水平的影響
Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組小鼠相比,麻醉組和手術(shù)組小鼠海馬組織中RAGE蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),且手術(shù)組RAGE蛋白表達(dá)水平較麻醉組顯著升高(P<0.05);槲皮素組小鼠RAGE蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組無顯著變化,且比麻醉組和手術(shù)組顯著降低(P<0.05)。見表3,圖1。
圖1 丙泊酚麻醉術(shù)后小鼠海馬組織中RAGE蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of RAGE protein in the hippocampus of mice after propofol anesthesia
2.4小鼠認(rèn)知功能與海馬RAGE表達(dá)水平的相關(guān)性
全部80只小鼠施加處理因素后,應(yīng)用Pearson相關(guān)分析對(duì)定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期及空間探索試驗(yàn)原平臺(tái)停留時(shí)間百分比與海馬組織中RAGE mRNA及蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,RAGE蛋白表達(dá)水平與逃避潛伏期呈正相關(guān)(r=0.276,P=0.034),與原平臺(tái)停留時(shí)間百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.299,P=0.031)。
本研究以10月齡老齡雄性小鼠為研究對(duì)象,通過灌胃給予槲皮素預(yù)處理2周后,進(jìn)行丙泊酚麻醉并施行腹腔探查術(shù)(以模擬丙泊酚麻醉手術(shù)老年患者),并繼續(xù)給予槲皮素1周后,檢測(cè)小鼠的認(rèn)知功能。本研究發(fā)現(xiàn),與腹腔注射生理鹽水的對(duì)照組相比,腹腔注射丙泊酚的麻醉組以及麻醉后施行腹腔探查術(shù)的手術(shù)組小鼠的認(rèn)知功能明顯降低,表現(xiàn)為Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),而空間探索試驗(yàn)原平臺(tái)停留時(shí)間百分比明顯下降,并且手術(shù)組變化更為明顯。這與已有研究結(jié)果一致,說明丙泊酚麻醉手術(shù)可引起POCD。而槲皮素組小鼠Morris水迷宮檢測(cè)中表現(xiàn)的記憶認(rèn)知功能明顯改善。已有研究[10?12]發(fā)現(xiàn)槲皮素可改善糖尿病大鼠、D?半乳糖衰老模型小鼠、因高脂膳食誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶能力受損小鼠等動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力,本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了槲皮素具有改善認(rèn)知功能的作用,并且首次觀察到對(duì)丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的POCD的改善作用。
槲皮素改善認(rèn)知功能的機(jī)制尚不完全清楚,早期研究認(rèn)為可能與抗氧化活性相關(guān)。毛海芬等[11]認(rèn)為槲皮素可以增加海馬促生長(zhǎng)因子的含量,修復(fù)受損的突觸結(jié)構(gòu),上調(diào)突觸數(shù)量,從而改善糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;而孫紅等[13]認(rèn)為槲皮素可改善腦組織氧化還原狀態(tài),上調(diào)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá),從而改善小鼠的認(rèn)知功能。鑒于王君艷等[14]發(fā)現(xiàn)RAGE上調(diào)在丙泊酚誘導(dǎo)的POCD發(fā)揮重要作用,本研究檢測(cè)了小鼠海馬組織中RAGE mRNA和蛋白表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,麻醉組和手術(shù)組小鼠RAGEmRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增高,而槲皮素組該變化則被抑制。同時(shí)分析小鼠認(rèn)知功能與海馬RAGE表達(dá)水平的相互關(guān)系,發(fā)現(xiàn)RAGE蛋白表達(dá)水平與逃避潛伏期呈正相關(guān),與原平臺(tái)停留時(shí)間百分比呈負(fù)相關(guān),這提示槲皮素改善丙泊酚誘導(dǎo)的POCD作用可能是通過抑制RAGE表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。已有研究[15]報(bào)道,槲皮素脂質(zhì)體可減少糖尿病大鼠腎臟RAGE表達(dá),而發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用,并且槲皮素可下調(diào)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜RAGEmRNA表達(dá)水平。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致。
綜上,本研究結(jié)果提示槲皮素可改善丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的POCD,該作用可能與抑制RAGE表達(dá)有關(guān)。
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(編輯陳姜)
Effect and Mechanism of Quercetin on Cognitive Function in Mice after Propofol Anesthesia
FENG Yan,WEI Fang
(Department of Anesthesia,The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China)
ObjectiveTo investigate the effect of quercetin on the postoperative cognitive dysfunction(POCD)induced by propofol anesthesia,and further explore the mechanism of this effect.MethodsThe mice were randomly divided into control group(normal feeding),anesthesia group(propofol),operation group(abdominal exploration after propofol anesthesia),and quercetin group.In quercetin group,the mice were pre?treated with quercetin by irrigation gastric for 2 weeks,then narcotized with propofol and underwent exploratory laparotomy,following with querce?tin treatment for 1 week.Morris water maze was used to determine the ability of positioning navigation and space exploration of mice.Advanced gly?cation end products receptor(RAGE)mRNA and protein expression levels were detected by real?time PCR and Western blot,respectively.Re?sults Compared with the control group,mice in anesthesia group and operation group exhibited significantly prolonged escape latency(P<0.05),and the original platform residence time percentage decreased significantly(P<0.05).In addition,the changes in the surgical group is more obvi?ous.Quercetin group mice showed no significant difference compared to control group in the Morris water maze test.RAGEmRNA and protein ex?pression levels of anesthesia group and operation group mice were significantly increased(P<0.05)compared to control group,but not obviously in quercetin group.RAGEmRNA and protein expression levels were positively correlated with escape latency,but negatively correlated with the original platform residence time percentage.ConclusionQuercetin can improve the POCD induced by propofol anesthesia,which may be related to the inhibition of RAGE expression.
quercetin;propofol;postoperative cognitive dysfunction;advanced glycation end products receptor
R614.2
A
0258-4646(2016)09-0801-04
10.12007/j.issn.0258?4646.2016.09.008
遼寧省省直醫(yī)院改革重點(diǎn)臨床科室診療能力建設(shè)項(xiàng)目(LNCCC?C06?2015)
馮艷(1982-),女,主治醫(yī)師,碩士研究生.
魏芳,E-mail:wf?cmh@163.com
2016-06-22
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:
中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2016年9期