郭瑞敏，荀哲，范正松，牛亞玲，李雁春

2，4，6?三硝基苯磺酸誘導(dǎo)不同鼠種急性潰瘍性結(jié)腸炎的比較

郭瑞敏，荀哲，范正松，牛亞玲，李雁春

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)代謝病分子機(jī)制與藥物研究所，沈陽(yáng) 110122）

目的利用2，4，6?三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)C57BL/6小鼠和昆明小鼠建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，對(duì)比2種小鼠的造模效果。方法小鼠經(jīng)結(jié)腸灌注一定劑量的TNBS，評(píng)估病情，于72 h后處死小鼠，取出結(jié)腸進(jìn)行組織學(xué)切片評(píng)分，并用Western blot及RT?PCR方法檢測(cè)炎性因子的表達(dá)。結(jié)果C57BL/6小鼠和昆明小鼠的急性潰瘍性結(jié)腸炎模型建立成功，但C57BL/6小鼠腸炎在分子水平和組織水平上均比昆明小鼠更加嚴(yán)重。結(jié)論C57BL/6小鼠比昆明小鼠對(duì)TNBS更敏感，組織學(xué)上更易觀察到病理變化。C57BL/6小鼠比昆明小鼠更適合用于潰瘍性結(jié)腸炎的研究。

潰瘍性結(jié)腸炎；C57BL/6小鼠；昆明小鼠；2，4，6?三硝基苯磺酸

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潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不完全明確的慢性腸道炎癥性疾病［1］，主要侵及結(jié)腸黏膜，破壞黏膜并形成潰瘍，常始自左半結(jié)腸，可由結(jié)腸近端發(fā)展至全結(jié)腸［2］，以連續(xù)方式逐漸進(jìn)展。臨床表現(xiàn)主要為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，且易反復(fù)發(fā)作，病程長(zhǎng)，遷延不愈［3］。

目前已有多種潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，但由2，4，6?三硝基苯磺酸（2，4，6?trinitrobenzene，TNBS）和乙醇混合試劑誘導(dǎo)建立的急性潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，雖然時(shí)間較短、操作簡(jiǎn)便，基礎(chǔ)研究中應(yīng)用較普遍［4］，但重復(fù)性差，使得造模效率下降。TNBS混合試劑的致炎機(jī)制是乙醇破壞腸黏膜屏障，TNBS滲入結(jié)腸黏膜組織作為化學(xué)性半抗原與結(jié)腸組織蛋白結(jié)合形成全抗原［5］，直接活化腸黏膜固有層中的巨噬細(xì)胞，促使其增生并且釋放多種促炎性細(xì)胞因子、組胺、白三烯、血小板活化因子、肝素等。促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）可以通過活化內(nèi)皮細(xì)胞整連素的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，同時(shí)釋放血小板活化因子，使淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板黏附到腸黏膜內(nèi)皮細(xì)胞上，活化一氧化氮合酶，產(chǎn)生大量一氧化氮，引起細(xì)胞損傷，形成潰瘍；TNF?α亦可促使白細(xì)胞介素IL?1β、IL?2、IL?8等的釋放，進(jìn)一步損傷腸黏膜屏障［6?7］。

誘導(dǎo)模型過程中所使用的試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類和遺傳背景及實(shí)驗(yàn)方法都對(duì)模型的成功建立產(chǎn)生不同程度的影響。本研究試圖通過針對(duì)C57BL/6小鼠和昆明小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比，對(duì)造模過程中遇到的問題做出分析比較，提供可靠的參考資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑：TNBS（美國(guó)Sigma公司）；膠體金便隱血檢測(cè)試劑盒（艾博生物醫(yī)藥有限公司）；HE染色試劑盒（上海碧云天生物公司）；蛋白酶抑制劑ULTRA（上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物公司）；羊抗鼠TNF?α單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）；羊抗鼠β?actin單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG（美國(guó)Santa Cruz公司）；ECL發(fā)光液（美國(guó)Thermo Fisher公司）；Trizol（美國(guó)Life Technologies公司）；鼠TNF?α和鼠GAPDH引物（上海生工生物工程公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Ta?KaRa公司）；PCR擴(kuò)增試劑盒（日本TaKaRa公司）。

1.1.2動(dòng)物：SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量23～25 g，周齡8～10周，購(gòu)于遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證書編號(hào)SCXK（遼）2015?0003；SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～23 g，周齡8～10周，購(gòu)于遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證書編號(hào)SCXK（遼）2015?0001。

1.1.3器材：RM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（美國(guó)Leica公司）；KD?BM生物組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；DMI3000B熒光顯微鏡（美國(guó)Lei?ca公司）；組織粉碎機(jī)（德國(guó)IKA公司）；微波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Nano Drop ND?1000全波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)（美國(guó)Gene公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio?Rad公司）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組：將10只同一窩別的C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，分別為對(duì)照組和模型組；將10只同一窩別的昆明雄性小鼠也隨機(jī)分為2組，每組5只，分別為對(duì)照組和模型組。

1.2.2試劑配制：TNBS與無(wú)水乙醇以1∶1的比例混合［8］。

1.2.3模型制作：各組小鼠在造模前禁食不禁飲24 h，灌腸前充分排便。根據(jù)小鼠體質(zhì)量和種系的差別，昆明小鼠的麻醉用藥量為0.5 mL/100 g，C57BL/6小鼠麻醉用藥量為0.25 mL/100 g。將麻醉的小鼠倒置懸掛，用帶有灌腸針的注射器以0.5 mL/100 g的劑量灌注TNBS混合試劑。灌腸針輕輕插入約4 cm，緩慢推入試劑，輕輕拔出針管，倒置約5 min，以保證造模液與結(jié)腸充分接觸和防止造模液外溢，然后放回籠內(nèi)［9］。造模完成后注意保溫，直至自然蘇醒。對(duì)照組用同樣的方法灌入相同劑量的無(wú)水乙醇。

1.2.4觀察：每天稱量并記錄小鼠體質(zhì)量，觀察糞便、毛發(fā)及活動(dòng)情況，肉眼不可見的血便采用便隱血檢測(cè)試劑評(píng)分。第3天后，統(tǒng)計(jì)小鼠體質(zhì)量下降的終值，糞便稀軟程度及便隱血情況，根據(jù)JACK?SON等［10］的疾病活性指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分方法繪制表格，見表1。

表1　DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1　DAI scoring system

1.2.5取材：造模72 h后將各組小鼠處死，取出結(jié)腸，用4℃冷卻的PBS液將腸內(nèi)容物清理干凈。用作組織切片的部分放置到4%的多聚甲醛溶液固定24 h；用作Western blot和RT?PCR檢測(cè)的部分放至-80℃的冰箱里凍存?zhèn)溆茫?1］。

1.2.6組織切片制作及觀察：多聚甲醛中固定好的組織用流水沖洗，依次使用70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、Ⅱ的梯度乙醇脫水，再用二甲苯Ⅰ、Ⅱ?qū)⒔M織進(jìn)行透明處理，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度約為4 μm，HE染色，分別于5倍、10倍物鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)變化［11］，并依據(jù)STEFAN等的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［8］對(duì)病理切片進(jìn)行評(píng)分。見表2。

1.2.7Western blot分析：使用已加入適量蛋白酶抑制劑ULTRA的RIPA裂解液，分別提取上述模型組及對(duì)照組小鼠的結(jié)腸黏膜組織總蛋白，加入適量loading buffer，加熱變性后，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉聚偏氟乙烯膜1 h，再用TBST稍加漂洗。一抗是濃度1∶1 000的羊抗鼠抗體，于4℃冷柜孵育過夜后，用TBST洗膜3次，每次10 min；然后加入二抗，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，稀釋濃度為1∶2 000；之后于室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次，最后將膜與ECL試劑反應(yīng)一定時(shí)間。X光片顯影，定影后掃描，使用Im?age J對(duì)蛋白表達(dá)做定量分析。抗β?actin為內(nèi)參照。

1.2.8RT?PCR：使用Trizol試劑提取各組小鼠結(jié)腸組織的總RNA，測(cè)定濃度，取500 ng應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，最后用實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)組織中TNF?α的表達(dá)量［12］。內(nèi)參采用GAPDH，TNF?α寡核苷酸引物序列為上游5′?TCAGCCTCTTCTCAT TCCTG?3′；下游5′?CAGGCTTGTCACTCGAATTT?3′，mGAPDH寡核苷酸序列為：上游5′?TGTGTCCGTCG TGGATCTG?3′；下游5′?CCTGCTTCACCACCTTCTTG A?3′［13］。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃60 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用比較閾值法進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)并比較［14］。

表2　結(jié)腸組織炎癥相關(guān)變化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2　Scoring system for inflammation?associated histological changes in the colon

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1小鼠DAI評(píng)分結(jié)果

小鼠被處理后的第2天，對(duì)照組糞便無(wú)異常，TNBS模型組會(huì)出現(xiàn)大便稀軟的現(xiàn)象；第3天，嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)稀水樣便，隱血便或肉眼可見血便。C57BL/6小鼠的平均值約為昆明小鼠的1.5倍，體質(zhì)量下降程度，大便稀軟程度及出現(xiàn)血便的概率均比昆明小鼠大。說明使用C57BL/6小鼠制作模型更容易成功。見表3。

表3　DAI評(píng)分結(jié)果Tab.3　DAI scores

2.2小鼠體質(zhì)量變化

各組小鼠體質(zhì)量變化曲線如圖1所示：C57BL/6小鼠和昆明小鼠體質(zhì)量下降趨勢(shì)基本一致。造模后第3天，C57BL/6模型組小鼠體質(zhì)量下降了將近20%（圖1A）；昆明小鼠體質(zhì)量下降幅度略小，約為12%（圖1B）。說明C57BL/6小鼠對(duì)TNBS的敏感性比昆明小鼠高。

圖1　C57BL/6小鼠和昆明小鼠接受TNBS處理后的體質(zhì)量變化曲線Fig.1　Body weight change curves of C57BL/6 mice and kunming mice after TNBS treatment

2.3結(jié)腸組織病理變化

將各組小鼠的病理組織切片進(jìn)行觀察比較后的評(píng)分結(jié)果如表4所示。C57BL/6小鼠和昆明小鼠的對(duì)照組無(wú)顯著變化，僅在無(wú)水乙醇的作用下，前者較后者略微敏感。TNBS模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且C57BL/6小鼠的平均值要大于昆明小鼠，約為昆明小鼠的1.7倍。各組小鼠病理組織切片如圖2所示。2種小鼠對(duì)照組無(wú)明顯差異，但C57BL/6模型組的變化比昆明小鼠的變化更加明顯。TNBS處理3 d后，結(jié)腸黏膜的基本組織結(jié)構(gòu)（包括腺體和杯狀細(xì)胞）基本全部消失，血管密度增加，白細(xì)胞顯著增多，肌層變厚；而昆明小鼠炎癥最嚴(yán)重的部位仍部分保留腸黏膜的基本結(jié)構(gòu)，部分腺體和杯狀細(xì)胞未完全消失。說明灌腸相同劑量的TNBS混合液，C57BL/6小鼠腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的破壞比昆明小鼠更明顯。

表4　結(jié)腸組織炎癥變化的評(píng)分結(jié)果Tab.4　Scores for inflammation?associated histological changes in the colon

圖2　組織切片 HE染色×20Fig.2　Histological section HE×20

2.4腸黏膜上皮細(xì)胞TNF?αmRNA表達(dá)

TNBS處理3 d后C57BL/6小鼠和昆明小鼠的結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞TNF?α在mRNA水平的表達(dá)均有增加。與對(duì)照組比較，C57BL/6小鼠的TNF?αmRNA增加15倍左右（P＜0.01），而昆明小鼠的TNF?α mRNA表達(dá)只增加5倍左右（P＜0.05）。 所以C57BL/6小鼠的TNF?α在mRNA水平的表達(dá)量增加較大，說明炎癥更加嚴(yán)重。見圖3。

圖3　腸黏膜上皮細(xì)胞TNF?α mRNA的表達(dá)Fig.3　Mucosal epithelial cell TNF?α mRNA expression

2.4腸黏膜上皮細(xì)胞TNF?α的蛋白質(zhì)表達(dá)

通過Western blot對(duì)2種小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞中的炎性因子TNF?α在蛋白水平表達(dá)做進(jìn)一步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2種小鼠對(duì)照組TNF?α表達(dá)都很低，而TN? BS刺激后，2種模型的TNF?α蛋白水平都有明顯的增加。定量結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠和昆明小鼠的腸黏膜上皮細(xì)胞TNF?α蛋白表達(dá)分別增加6.8倍和5倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果和mRNA變化水平基本一致。這進(jìn)一步說明在TNBS處理后，C57BL/6小鼠的腸黏膜炎性反應(yīng)比昆明小鼠嚴(yán)重。見圖4。

圖4　腸黏膜上皮細(xì)胞TNF?α蛋白的表達(dá)和定量分析Fig.4　Mucosal epithelial cell TNF?α protein expression and quantitative analysis

3　討論

C57BL/6小鼠被稱作“標(biāo)準(zhǔn)”近交系小鼠，是腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、病理生理學(xué)、遺傳學(xué)及藥理學(xué)研究中常用的鼠種。昆明小鼠則是一種遠(yuǎn)交系品種，基因庫(kù)大，基因雜合率高。與C57BL/6小鼠比較，昆明小鼠抵抗力和適應(yīng)力均很強(qiáng)，且繁殖率和成活率較高［15］。本研究通過對(duì)比由TNBS混合液誘導(dǎo)的2種小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型發(fā)現(xiàn)，在造模的第2天，各組小鼠出現(xiàn)不同程度的厭食、懶動(dòng)、皮毛粗糙無(wú)光澤，腹部扭曲，膨大，糞便呈黏液狀或稀水樣便甚至隱血便。C57BL/6小鼠和昆明小鼠在接受TNBS混合液處理后，表現(xiàn)出的體質(zhì)量下降趨勢(shì)是基本相同的，都在72 h后體質(zhì)量降到最低值，但C57BL/6小鼠比昆明小鼠下降更多，出現(xiàn)稀軟糞便和血便的概率更大，DAI評(píng)分約為昆明小鼠的1.5倍。通過病理組織切片可以看到，在灌腸同樣劑量TNBS的情況下，C57BL/6小鼠的炎性反應(yīng)更嚴(yán)重，腸黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，杯狀細(xì)胞、腺體和絨毛上皮細(xì)胞基本消失，血管密度增加，白細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，肌層變厚；而昆明鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)變化較小，最嚴(yán)重的情況仍可觀察到杯狀細(xì)胞和腺體的存在，肌層結(jié)構(gòu)變化亦不顯著，組織評(píng)分結(jié)果與小鼠病癥變化一致。但通過Western blot和RT?PCR對(duì)炎性因子TNF?α的檢測(cè)，進(jìn)一步在分子水平上證實(shí)，雖然2種小鼠都有炎癥，但C57BL/6小鼠的腸黏膜炎癥程度比昆明小鼠更嚴(yán)重。當(dāng)使用較高劑量的TNBS刺激昆明小鼠并誘導(dǎo)其產(chǎn)生炎癥后，在組織水平并未發(fā)現(xiàn)明顯病變特征，但在mRNA水平和蛋白水平卻可以檢測(cè)到炎性因子的表達(dá)，加之該模型的誘導(dǎo)為急性發(fā)作，組織可在短期內(nèi)自我修復(fù)，在視覺觀察上易誤斷為造模失敗。

綜上所述，在選擇TNBS誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎時(shí)，由于C57BL/6小鼠對(duì)TNBS的高敏感性，結(jié)腸炎表現(xiàn)更加顯著，且造模成功率較高，降低了實(shí)驗(yàn)成本，改善了反復(fù)造模的繁瑣性。雖然昆明小鼠價(jià)格相對(duì)便宜，但從實(shí)驗(yàn)整體的性價(jià)比來說并非理想品種。

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（編輯于溪）

Comparison of 2，4，6?trinitrobenzene Sulfonic Acid?induced Acute Colitis Models in Two Different Mouse Strains

GUO Ruimin，XUN Zhe，F(xiàn)AN Zhengsong，NIU Yaling，LI Yanchun
（Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveAcute colitis was induced with 2，4，6?trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS）in C57BL/6 and Kunming mice，and effec?tiveness of the colitis model in these two mouse strains was compared.MethodsMice were treated with TNBS and sacrificed after 72 h.The co?lons were collected for histological observation，and the expression of colonic mucosal pro?inflammatory cytokines was assessed by western blot and real time RT?PCR.Disease severity and mucosal histological damages were scored.ResultsColitis was successfully induced in both C57BL/6 and Kunming mice，but colonic pathological lesions and inflammation were more severe in C57BL/6 mice than in Kunming mice at both histologi?cal and molecular levels.ConclusionC57BL/6 mice were more susceptible to TNBS than Kunming mice in colitis development，and histological damages were more prominent in C57BL/6 mice.Thus，C57BL/6 mice are more suitable for experimental colitis research.

colitis；C57BL/6 mouse；Kunming mouse；2，4，6?trinitrobenzene

R326.2

A

0258-4646（2016）09-0787-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.09.005

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2014320）

郭瑞敏（1988-），女，碩士研究生.

李雁春，E-mail：cyan@medicine.bsd.uchicago.edu

2016-01-22

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