趙廣翊，丁旭東，黃威，李丹

神經(jīng)生長因子預(yù)處理對神經(jīng)損傷大鼠脊髓脫髓鞘反應(yīng)的影響

趙廣翊，丁旭東，黃威，李丹

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

目的探討鞘內(nèi)注射神經(jīng)生長因子（NGF）預(yù)處理對局麻藥所致神經(jīng)損傷大鼠脊髓脫髓鞘反應(yīng)的影響。方法雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量250～280 g，采用隨機數(shù)字表法將其分為4組（n=6）：假手術(shù)組（S組）、神經(jīng)損傷組（L組）、生理鹽水組（NS組）和NGF預(yù)處理組（NGF組）。L組、NS組和NGF組均在鞘內(nèi)置管后1 d鞘內(nèi)注射10%利多卡因20 μL，其中NGF組在注射利多卡因前1 h，鞘內(nèi)注射NGF 30 μg（20 μL）預(yù)處理。于鞘內(nèi)注射利多卡因后1 d、2 d和3 d時測定甩尾潛伏期（TFL）。行為學(xué)測試完成后取脊髓組織，采用免疫組化法測定髓鞘堿性蛋白（MBP）的表達，Western blot法測定p38 MAPK磷酸化表達水平。結(jié)果與S組比較，L組和NS組鞘內(nèi)注射利多卡因后1～3 d TFL均延長，脊髓內(nèi)MBP的含量減少，p38 MAPK磷酸化的表達上調(diào)（P＜0.05），與L組比較，NGF組于鞘內(nèi)注射利多卡因后2 d和3 d TFL縮短，脊髓內(nèi)MBP的含量增加，磷酸化p38 MAPK的表達下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論NGF預(yù)處理可減輕局麻藥所致神經(jīng)損傷大鼠脊髓急性脫髓鞘反應(yīng)，機制與抑制p38 MAPK的磷酸化表達有關(guān)。

神經(jīng)營養(yǎng)因子類；利多卡因；藥物毒性；脫髓鞘反應(yīng)；p38 MAPK

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利多卡因鞘內(nèi)注射可導(dǎo)致脊髓組織脫髓鞘改變［1］。前期研究［2?3］已證實鞘內(nèi)注射外源性神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）可減輕利多卡因所誘發(fā)的大鼠脊髓神經(jīng)毒性，并減少神經(jīng)元的凋亡，但具體機制尚不清楚。髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）是一種強堿性膜蛋白，為脫髓鞘反應(yīng)的標(biāo)記物。主要功能是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。p38 MAPK主要參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡和分化。LIRK等［4］研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因的神經(jīng)毒性與p38 MAPK的激活密切相關(guān)，進一步發(fā)現(xiàn)p38 MAPK抑制劑具有潛在的神經(jīng)保護作用，可抑制利多卡因誘發(fā)的神經(jīng)細胞損傷的軸突退變［5］。然而，給予外源性NGF預(yù)處理能否有效控制利多卡因所造成的神經(jīng)損傷，其機制是否與抑制脫髓鞘損傷和p38 MAPK磷酸化有關(guān)鮮有報道。本研究旨在首先明確外源性NGF預(yù)處理可否抑制利多卡因造成的急性脫髓鞘損傷，進而確定其是否通過抑制p38 MAPK的過表達實現(xiàn)神經(jīng)保護。

1　材料與方法

1.1動物選擇及分組

清潔級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量250～280 g，8～10周齡，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供，于室溫24℃，濕度55%～65%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。采用隨機數(shù)字表法將其分為4組（n=6）：假手術(shù)組（S組）、神經(jīng)損傷組（L組）、生理鹽水組（NS組）和NGF預(yù)處理組（NGF組）。S組僅行鞘內(nèi)置管術(shù)。L組、NS組和NGF組均在鞘內(nèi)置管后第1天，鞘內(nèi)注射10%鹽酸利多卡因20 μL，其中NGF組在鞘內(nèi)注射利多卡因前1 h，鞘內(nèi)注射NGF 30 μg（20 μL）預(yù)處理，NS組在鞘內(nèi)注射利多卡因前1 h，鞘內(nèi)注射0.9%生理鹽水20 μL對照。

1.2鞘內(nèi)置管

參照文獻［6］進行鞘內(nèi)置管。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，俯臥位于脊柱下段兩側(cè)可觸及一對鈍形突起的髂結(jié)節(jié)，其水平連線為L6水平，剪毛、碘伏消毒，于背部正中線L4～5間隙處做長約2 cm的皮膚縱切口，切開筋膜，鈍性分離L4及L5棘突周圍肌肉，暴露L4～5棘突間隙，暴露上下關(guān)節(jié)突間黃韌帶并提起下位棘突，用PE?10導(dǎo)管尖端穿破黃韌帶及硬脊膜，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)擺或后腿抽動為導(dǎo)管成功到達椎管內(nèi)的標(biāo)志。于顯微鏡下經(jīng)硬脊膜破口向尾側(cè)插入PE?10導(dǎo)管2 cm，導(dǎo)管尖端位于骶1水平，可見導(dǎo)管內(nèi)充盈清亮的腦脊液，為鞘內(nèi)置管成功。術(shù)畢第1天鞘內(nèi)注射1%利多卡因20 μL，30 s內(nèi)出現(xiàn)雙下肢癱瘓為利多卡因篩選試驗陽性，如鉗夾雙上肢躲避反應(yīng)存在，但鉗夾雙下肢及尾部逃避反應(yīng)消失，則選入實驗。術(shù)畢出現(xiàn)四肢癱瘓、活動障礙及利多卡因試驗陰性或出現(xiàn)單側(cè)肢體癱瘓者排除出實驗。

1.3指標(biāo)與方法

1.3.1行為學(xué)觀察：參照文獻［7］方法，于術(shù)前測定各組大鼠的甩尾潛伏期（tail?flick latency，TFL）作為基礎(chǔ)值，再分別于鞘內(nèi)注射利多卡因后1 d、2 d和3 d時測試各組大鼠的TFL。將大鼠放在玻璃板上，安靜后，開啟BME?410C全自動熱痛刺激儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所）的鹵素?zé)糇鳛闊彷椛涔庠?，照射鼠尾中?、5、7 cm處，記錄從熱源啟動到大鼠甩尾的時間（即TFL），每點測定1次，間隔為5 min，取平均值作為熱痛閾。切斷時間設(shè)定為30 s，以防大鼠尾部皮膚造成損傷。如果在25 s內(nèi)大鼠無甩尾反應(yīng)，則TFL記為30 s。

1.3.2脊髓組織病理形態(tài)學(xué)的測定：于鞘內(nèi)注射利多卡因后3 d行為學(xué)測試完成后，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，開胸后經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛。分離并取L4～6段脊髓組織，經(jīng)多聚甲醛后固定24 h，行石蠟包埋組織切片，片厚4 μm。分別行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。HE染色具體做法為切片用自來水洗片刻，蒸餾水洗片刻，蘇木精浸染1～2 min，自來水沖洗片刻，1%鹽酸乙醇分化3～5 s左右，自來水沖洗數(shù)分鐘至數(shù)小時，1%的氨水分化3～5 s左右，自來水沖洗數(shù)分鐘至數(shù)小時，蒸餾水沖洗片刻，85%的乙醇脫水10 min，95%的乙醇脫水10 min，0.5%的伊紅溶液浸染1～2 min，脫水（95%、100%、100%的乙醇各10 min），透明（二甲苯10 min，3次），中性樹膠封固，觀察。

1.3.3MBP免疫組化檢測：SABC法進行免疫組織化學(xué)染色。一抗為兔抗大鼠MBP，抗體工作濃度為1∶1 000，4℃冰箱孵育過夜，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。陰性對照用PBS替代第一抗體，胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。光鏡下（×400）每張切片隨機拍攝10個不重復(fù)的視野，用Image?Pro Plus圖像分析軟件測量MBP免疫反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.3.4p38 MAPK蛋白磷酸化水平的測定：采用Western blot法，使用細胞裂解液提取蛋白，用Brad?for法進行蛋白定量，采用蛋白定量測定試劑盒（上海美季生物技術(shù)有限公司）。取蛋白在SDS?聚丙酰胺凝膠上電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶37℃封閉1 h，加入兔抗大鼠p38 MAPK單克隆抗體（1∶1 000，美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜；加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶2 000，美國Santa Cruz公司），常溫孵育2 h，曝光成像。用Scion Image軟件檢測磷酸化p38 MAPK（p?p38 MAPK）目的條帶和p38 MAPK總蛋白條帶的灰度值，其比值作為p38 MAPK磷酸化蛋白的相對表達量。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1NGF預(yù)處理對神經(jīng)損傷大鼠行為學(xué)的影響

S組各時點TFL差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與S組比較，L組和NS組鞘內(nèi)注射利多卡因后1～3 d TFL均延長（P＜0.05），與L組比較，NGF組于鞘內(nèi)注射利多卡因后2 d和3 d TFL縮短（P＜0.05），見表1。

表1　NGF預(yù)處理對大鼠不同時點TFL的影響?Tab.1　Effects of NGF postconditioning on the TFL of different time points in rats

表1　NGF預(yù)處理對大鼠不同時點TFL的影響?Tab.1　Effects of NGF postconditioning on the TFL of different time points in rats

1）P＜0.05 compared with S group；2）P＜0.05 compared with L group.

Group　n　Base value　1 d　2 d　3 d S 6 5.3±1.4　5.9±2.1　6.5±1.7　6.7±1.6 L 6 4.8±2.3　25.1±4.21）　23.1±3.81）　24.7±3.51）NS　6　4.9±2.2　26.2±4.71）　22.4±3.01）　21.9±2.41）NGF　6　6.2±2.1　21.3±2.91）　14.8±2.51），2）　15.3±3.41），2）

2.2NGF預(yù)處理對神經(jīng)損傷大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)的影響

光鏡下觀察，S組脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰，灰質(zhì)、白質(zhì)清晰可見，界限分明，無出血灶，無空泡樣改變，神經(jīng)元及神經(jīng)軸突正常，未見異常現(xiàn)象（圖1A）；L組和NS組見后角白質(zhì)廣泛水腫、空泡變性、脊膜細胞大量增生，損傷較重（圖1B、1C）；NGF組見的后角白質(zhì)神經(jīng)纖維水腫，脊膜細胞增生，空泡變性不明顯（圖1D）。

圖1　NGF預(yù)處理對大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)的影響 HE染色×400Fig.1　Effects of NGF preconditioning on the spinal cord morphology in rats HE×400

2.3NGF預(yù)處理對神經(jīng)損傷大鼠脊髓內(nèi)MBP及p38 MAPK磷酸化的影響

與S組比較，L組和NS組脊髓內(nèi)MBP的含量減少，p38 MAPK磷酸化的表達上調(diào)（P＜0.05）；與L組比較，NGF組脊髓內(nèi)MBP的含量增加，p38 MAPK磷酸化的表達下調(diào)（P＜0.05），見表2，圖2、3。

表2　NGF預(yù)處理對大鼠脊髓內(nèi)MBP和p38 MAPK磷酸化的影響Tab.2　Effects of NGF pconditioning on the MBP and p?p38 MAPK in the spinal cord in rats

表2　NGF預(yù)處理對大鼠脊髓內(nèi)MBP和p38 MAPK磷酸化的影響Tab.2　Effects of NGF pconditioning on the MBP and p?p38 MAPK in the spinal cord in rats

1）P＜0.05 compared with S group；2）P＜0.05 compared with L group.

Group　n　AOD of MBP　Relative expression of p?p38 MAPK S　6　149.4±10.4　0.52±0.12 L　6　85.6±12.81）　0.83±0.091）NS　6　91.3±11.21）　0.81±0.111）NGF　6　113.6±9.52）　0.49±0.072）

3　討論

本研究采用鞘內(nèi)置管注射高濃度利多卡因的方法制備大鼠脊髓神經(jīng)毒性模型。結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射利多卡因后大鼠TFL升高，提示利多卡因誘發(fā)大鼠脊髓神經(jīng)毒性的模型制備成功。此外，本課題組前期研究表明，應(yīng)用局麻藥神經(jīng)毒性損傷的大鼠模型，于鞘內(nèi)注射高濃度利多卡因后，鞘內(nèi)連續(xù)7 d每天1次的注射NGF 10 μg，能夠減輕局麻藥引起的毒性損傷，改善脊髓神經(jīng)細胞的超微結(jié)構(gòu)，抑制神經(jīng)細胞凋亡，因此，本研究仍選擇外源性NGF的上述給藥途經(jīng)和劑量。

圖2　NGF預(yù)處理對大鼠脊髓內(nèi)MBP的影響 免疫組化染色×400Fig.2　Effects of NGF preconditioning on the spinal cord MBP in rats Immunohistochemical staining×400

圖3　NGF預(yù)處理對大鼠脊髓內(nèi)p38 MAPK磷酸化的影響 West?ern blotFig.3　Effects of NGF preconditioning on the spinal cord the ex?pression of p?p38 MAPK in rats Western blot

MBP是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突細胞［8］和周圍神經(jīng)系統(tǒng)雪旺細胞合成的一種強堿性膜蛋白。MBP是組成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的主要蛋白質(zhì)，約占髓鞘蛋白質(zhì)總量的30%，脊髓損傷會誘導(dǎo)免疫組件對神經(jīng)系統(tǒng)自體抗原免疫應(yīng)答的刺激［9］，免疫組件對MBP或其他神經(jīng)成分會做出免疫損害刺激［10］。本研究發(fā)現(xiàn)L組大鼠術(shù)后1～3 d脊髓中MBP的表達較S、NGF組明顯減少，提示利多卡因?qū)λ枨蔬@種神經(jīng)成分會做出損害刺激，當(dāng)脊髓出現(xiàn)實質(zhì)性損害，特別是出現(xiàn)髓鞘脫失時，構(gòu)成髓鞘主要蛋白質(zhì)的MBP也同與其結(jié)合的脂質(zhì)分離，并通過破壞的脊髓血腦屏障入血。因此，在脊髓組織中由于脊髓損傷二相反應(yīng)使得一部分MBP丟失于血清中，相應(yīng)脊髓組織中含量會減少。而本研究發(fā)現(xiàn)NGF預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)上述病理生理過程，從而實現(xiàn)對局麻藥致脊髓脫髓鞘反應(yīng)的保護效應(yīng)。

p38 MAPK磷酸化在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中主要表現(xiàn)為負性損傷作用，可介導(dǎo)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)組織水腫和神經(jīng)細胞死亡［11］。本研究證實L組在術(shù)后1 d即開始出現(xiàn)p38 MAPK磷酸化表達增高，提示p38 MAPK磷酸化很可能是后續(xù)脊髓脫髓鞘損傷的始動因素。有研究［12］表明持續(xù)的p38 MAPK活化在成熟少突膠質(zhì)細胞的生存中也起到重要作用，長時間抑制p38 MAPK的活性則導(dǎo)致成熟少突膠質(zhì)細胞的凋亡。但值得注意的是，p38 MAPK可能在少突膠質(zhì)細胞中具有不同的作用，這可能與少突膠質(zhì)細胞活性或者p38 MAPK自身的活性動力學(xué)有關(guān)［13］，在病理條件下刺激時p38 MAPK短暫激烈的活化則導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞凋亡。本研究亦證實NGF預(yù)處理可抑制p38 MAPK磷酸化，即阻斷了p38 MAPK短暫激烈活化導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞凋亡這一病理生理過程，從而產(chǎn)生了抑制脊髓急性脫髓鞘損傷的效應(yīng)。

綜上所述，鞘內(nèi)予外源性NGF預(yù)處理可減輕局麻藥所致神經(jīng)損傷大鼠脊髓急性脫髓鞘反應(yīng)，機制與抑制p38 MAPK磷酸化表達有關(guān)。

［1］趙廣翊，趙柏松，高林林，等.不同比例利多卡因-布比卡因混合液鞘內(nèi)注射后大鼠神經(jīng)行為及脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)變化［J］.實用臨床醫(yī)藥雜志，2014（16）：1-6.DOI：10.7619/jcmp.201416001.

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［3］趙廣翊，曹巖巖，李丹，等.鞘內(nèi)注射外源性神經(jīng)生長因子對利多卡因致大鼠脊髓損傷的保護作用［J］.國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2014，35（11）：1022-1025.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673?4378.2014. 11.013.

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（編輯于溪）

Effect of Nerve Growth Factor Postconditioning on Demyelination Process of Spinal Cord with Nerve Damage in Rats

ZHAO Guangyi，DING Xudong，HUANG Wei，LI Dan
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the effect of postconditioning of intrathecal injection of nerve growth factor（NGF）on demyelination process of spinal cord in rats with local anesthetics?induced nerve damage.MethodsA total of 24 SD male rats（250?280 g）were randomly divided into 4 groups（n=6 in each group）：the sham?operation group（group S），nerve damage group（group L），normal saline group（group NS）and NGF pretreatment group（group NGF）.While group Lido，NS and NGF were all given 20 μL of 10%lidocaine hydrochloride via intrathecal injection on 1 d after catheterization.Group NGF was given 30 μg（20 μL）NGF via intrathecal injection for pretreatment 1 h before injection of lidocaine. Tail?flick latency was measured on 1，2 and 3 d after intrathecal injection of lidocaine.Spinal cord tissues were taken after completion of behavioral test.Immunohistochemical method was used to determine the expressions of MBP and Western blot was used to determine the expressions of phos?phorylated p38 MAPK（p?p38 MAPK）.ResultsCompared with group S，TFLs on 1?3 d after intrathecal injection of lidocaine in group L and NS were all prolonged，spinal cord MBP was decreased in group L and group NS，while expressions of p?p38 MAPK were up?regulated（P＜0.05）；while compared with group L，TFLs on 2 d and 3 d were both shortened in group NGF，spinal cord MBP was decreased in group NGF and expressions of p?p38 MAPK were also down?regulated（P＜0.05）.ConclusionNGF postconditioning via intrathecal approach can reduce acute demyelinating reaction of spinal cord in rats with nerve damage caused by local anesthetics，and the mechanism was related to the inhibition of phosphorylation expression of p?p38 MAPK.

nerve growth factors；lidocaine；drug toxicity；demyelinating reaction；p38 MAPK

R744.5

A

0258-4646（2016）09-0783-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.09.004

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2011225017）

趙廣翊（1976-），男，副教授，博士. E-mail：zhaogy_sy@sina.com

2016-01-21

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