楊 琴，叢 林， 袁 靜，方慧琴，陳 薇，李 松，李 琴

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TGA與LPS競(jìng)爭(zhēng)抑制妊娠期糖尿病孕婦外周血單核細(xì)胞TLR4經(jīng)典信號(hào)通路

楊 琴，叢 林， 袁 靜，方慧琴，陳 薇，李 松，李 琴

目的 研究半乳糖醛酸(TGA)與內(nèi)毒素(LPS)同時(shí)刺激妊娠期糖尿病孕婦外周血單核細(xì)胞及其對(duì)LPS-Toll樣受體4(TLR-4)-核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的抑制作用。 方法 選取妊娠期糖尿病孕婦30例，抽取外周靜脈血15 ml，分離出單核細(xì)胞，分別加入LPS、TGA、TGA(0～1.0 mg/ml)聯(lián)合LPS刺激并培養(yǎng)，Western blot法檢測(cè)TLR4及NF-κB p65蛋白表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-10(IL-10)水平。 結(jié)果 單獨(dú)LPS或TGA刺激，其下游TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量及TNF-α、IL-1、IL-10水平均較未處理組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)加入TGA及LPS刺激，其TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量及TNF-α、IL-1、IL-10水平均較單獨(dú)LPS或TGA刺激低，但較未處理組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組TLR4與NF-κB p65蛋白表達(dá)量之間呈正相關(guān)性(P<0.01)。結(jié)論 TGA與LPS可競(jìng)爭(zhēng)抑制LPS-TLR4-NF-κB信號(hào)通路，對(duì)妊娠期糖尿病的預(yù)防及治療起到指導(dǎo)作用。

半乳糖醛酸；內(nèi)毒素；妊娠期糖尿?。籘LR4信號(hào)通路

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)所帶來(lái)的不良妊娠結(jié)局及遠(yuǎn)期影響危害較大，近年越來(lái)越引起大家的關(guān)注，對(duì)其機(jī)制的研究也越來(lái)越多。研究[1]表明GDM與免疫炎癥相關(guān)，認(rèn)為GDM是一種慢性低度炎癥性疾病。前期研究[2]表明GDM孕婦體內(nèi)Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR-4) mRNA、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor，NF-κB) mRNA呈高表達(dá)，炎癥因子升高，提示存在免疫炎癥，內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)-TLR4-NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)了大量炎癥因子釋放，可能參與了GDM的發(fā)病。基于此可針對(duì)TLR4信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，觀察其是否對(duì)GDM有影響，有研究者運(yùn)用半乳糖醛酸(trigalacturonic acid，TGA)類物質(zhì)調(diào)控TLR4信號(hào)通路并對(duì)其分子機(jī)制做了探討[3]。該實(shí)驗(yàn)即應(yīng)用TGA對(duì)LPS-TLR4-NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，并探討其與GDM的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 GDM孕婦30例，納入標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際妊娠合并糖尿病研究組(IADPSG)標(biāo)準(zhǔn)[4]，年齡21～34(28.20±3.46)歲，孕24～28(25.83±1.14)周。未做任何處理的作為空白對(duì)照組，只加LPS(1 μg/ml)刺激作為L(zhǎng)PS組，只加TGA(1.0 mg/ml)刺激為TGA組，余除了加LPS(1 μg/ml，參照前期研究[2])刺激外，同時(shí)加入TGA刺激，并按加入的TGA濃度(0.25、0.5、1.0 mg/ml)分為0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組。同時(shí)排除胎膜早破、肝腎功能損害、感染、妊娠期高血壓、妊娠期子癇及GDM高危因素等。所有受試者簽署知情同意書(shū)，方案已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)。

1.2 標(biāo)本收集及細(xì)胞培養(yǎng) 外周血經(jīng)肝素化處理后，用人淋巴細(xì)胞分離液提取淋巴細(xì)胞(按說(shuō)明書(shū)操作)，洗滌提純后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度并用臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力。將細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基中，按上述分組進(jìn)行處理后，均置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)；LPS、臺(tái)盼藍(lán)、TGA(美國(guó)Sigma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；RIPA裂解液、蛋白緩沖液、蛋白A+G瓊脂糖珠(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；小鼠抗人TLR4抗體、小鼠抗人泛乙酰化賴氨酸抗體(英國(guó)Abcam公司)；小鼠抗人NF-κB p65抗體、β-actin(美國(guó)CST公司)；山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL顯影液(美國(guó)Thermo公司)；ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)。

1.4 ELISA法檢測(cè) 培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)水平按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 Western blot法檢測(cè)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量 RIPA裂解液低溫裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液加入5×蛋白上樣緩沖液，煮蛋白10 min，樣品保存于-20 ℃冰箱。10% SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后放入NF-κB p65抗體(1 ∶250)和β-actin(1 ∶1 000)中4 ℃過(guò)夜。洗膜，放入二抗(1 ∶1 000)37 ℃孵育2 h，ECL顯影液顯影。

2 結(jié)果

2.1 各組之間TNF-α、IL-1、IL-10水平比較 TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與空白對(duì)照組、LPS組進(jìn)行方差分析，TGA組TNF-α、IL-1、IL-10與空白對(duì)照組、LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=225.876、289.244、399.918，P<0.01)；與空白對(duì)照組、LPS組比較，0.25 mg/ml TGA組TNF-α、IL-1、IL-10(F=213.266、251.172、353.225，P<0.01)、0.5 mg/ml TGA組TNF-α、IL-1、IL-10(F=188.278、223.004、321.683，P<0.01)、1.0 mg/ml TGA組TNF-α、IL-1、IL-10(F=268.099、234.759、410.713，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.1 各組TNF-α水平比較 空白對(duì)照組與LPS組進(jìn)行比較，TGA組及0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與空白對(duì)照組、LPS組進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與LPS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LPS組、TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LPS組與TGA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1A。

2.1.2 各組IL-1水平比較 各組之間的比較方法同TNF-α，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與LPS組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組分別與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1.0 mg/ml TGA組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LPS組、TGA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1B。

2.1.3 各組IL-10水平比較 各組之間的比較方法同TNF-α，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與LPS組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組分別與空白對(duì)照組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1.0 mg/ml TGA組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TGA組、0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組分別與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1C。

2.2 外周血單核細(xì)胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，LPS組、TGA組TLR4、NF-κB p65蛋白條帶較深；0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組TLR4、NF-κB p65蛋白條帶較B、C組逐漸變淡，其中1.0 mg/ml TGA組蛋白條帶最淡，見(jiàn)圖2。TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量LPS組、TGA組較空白對(duì)照組多，0.25 mg/ml TGA組、0.5 mg/ml TGA組、1.0 mg/ml TGA組逐漸減少，見(jiàn)表1。

表1 各組TLR4、NF-κB p65 蛋白表達(dá)量比較

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

2.3 外周血單核細(xì)胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量之間的相關(guān)性分析 各組的TLR4與NF-κB p65蛋白表達(dá)量之間呈正相關(guān)性(r=0.882、0.838、0.939、0.868、0.846、0.853；P<0.01)。

3 討論

GDM是指妊娠期發(fā)生的不同程度的糖代謝異常[5]。近期許多研究[6-7]表明炎癥因子與糖尿病之間密切相關(guān)，且課題組前期研究[8]表明甘露糖結(jié)合凝集素下降可能與炎癥反應(yīng)相關(guān)，初步探討了GDM與免疫炎癥之間的關(guān)系。近期研究[2,9-10]顯示LPS-TLR4-NF-κB信號(hào)通路參與炎癥因子的釋放，可能參與了GDM的發(fā)病。TLR4可表達(dá)于免疫細(xì)胞胞膜上[11-13]，與胞外LPS結(jié)合并介導(dǎo)信號(hào)途徑，激活下游系列信號(hào)，并最終使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB活化，進(jìn)入胞核啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

圖1 各組TNF-α、IL-1、IL-10水平

A：TNF-α；B：IL-1；C：IL-10；1：空白對(duì)照組；2：LPS組；3：TGA組；4：0.25 mg/ml TGA組；5：0.5 mg/ml TGA組；6：1.0 mg/ml TGA組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05

圖2 Western blot法檢測(cè)各組TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)

1：空白對(duì)照組；2：LPS組；3：TGA組；4：0.25 mg/ml TGA組；5：0.5 mg/ml TGA組；6：1.0 mg/ml TGA組

TLR4信號(hào)通路參與多種疾病的發(fā)生，研究[14-15]顯示在腸道炎性疾病中通過(guò)5-TGA調(diào)控LPS-TLR4-NF-κB信號(hào)通路，下游表達(dá)產(chǎn)物減少，對(duì)通路起到抑制作用，但其具體機(jī)制并不完全清楚。而秦文星[3]則更深入的研究了其抑制作用的分子機(jī)制，認(rèn)為TLR4的配體至少需要乙?；Y(jié)構(gòu)與陰離子基團(tuán)，LPS具備這個(gè)條件；而5-TGA中的羧基，既屬于陰離子基團(tuán)，又有?；慕Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)，也具備與TLR4結(jié)合的條件，但LPS與TGA同時(shí)作用于TLR4時(shí)對(duì)TLR4信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用。

本研究則運(yùn)用TGA對(duì)TLR4信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，結(jié)果顯示TNF-α、IL-1、IL-10水平LPS組較空白對(duì)照組高，與前期研究[2,9]結(jié)果一致；TGA組細(xì)胞因子水平較空白對(duì)照組高，與LPS組無(wú)明顯差異，提示TGA可能與LPS有相同的作用，即可與TLR4結(jié)合并激活下游信號(hào)通路；TGA濃度(0.25、0.5、1.0 mg/ml)的變化，細(xì)胞因子水平逐漸降低，在1.0 mg/ml濃度時(shí)最低，提示TGA、LPS同時(shí)與TLR4作用時(shí)可能使下游信號(hào)途徑受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放減少。

本研究選取TLR信號(hào)通路TLR4、NF-κB p65蛋白這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明LPS組、TGA組與空白對(duì)照組比較，其TLR4、NF-κB p65蛋白條帶加深，其蛋白表達(dá)量升高；LPS組、TGA組蛋白條帶深淺較一致，表達(dá)量無(wú)明顯差異；LPS+TGA組隨著TGA濃度的變化，其蛋白條帶較LPS組、TGA組逐漸變淡，其中LPS+1.0 mg/ml TGA組蛋白條帶最淡，表達(dá)量也逐漸降低。TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)量變化趨勢(shì)與細(xì)胞因子變化趨勢(shì)相同，本研究對(duì)TLR4與NF-κB p65蛋白表達(dá)量做相關(guān)分析，結(jié)果顯示各組兩者均呈正相關(guān)性，可認(rèn)為TGA/LPS介導(dǎo)了TLR4-NF-κB 信號(hào)通路。由細(xì)胞因子及蛋白表達(dá)量變化水平可得知，TGA可激活TLR4信號(hào)通路，LPS與TGA同時(shí)與TLR4作用可抑制此通路，且LPS+1.0 mg/ml TGA作用最明顯，可視為最適抑制濃度。

TGA也有羧基，具備與TLR4結(jié)合的條件，且TGA濃度的選擇是根據(jù)5-TGA的最適濃度(1.0 mg/ml)[14]上下波動(dòng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索得出，因此其單獨(dú)使用與LPS有相同的作用，使得TGA組與LPS組蛋白及細(xì)胞因子變化趨勢(shì)一致。TGA對(duì)通路競(jìng)爭(zhēng)抑制的可能原因是其使細(xì)胞膜上的TLR4受體減少，或TGA-TLR4作用位點(diǎn)與LPS-TLR4作用位點(diǎn)相互干擾，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。而且，本研究只限于體外細(xì)胞刺激，體外環(huán)境不受機(jī)體內(nèi)環(huán)境的影響，因此TGA是否適用于機(jī)體以及其安全性等問(wèn)題需進(jìn)一步探究。

綜上所述，TGA可激活TLR4信號(hào)通路，也可與LPS競(jìng)爭(zhēng)抑制GDM孕婦外周血單核細(xì)胞LPS-TLR4-NF-κB信號(hào)通路，此通路的抑制為GDM的靶向治療提供理論依據(jù)，有利于GDM防治工作的開(kāi)展。

[1] Spyridaki E C,Simos P,Avgoustinaki P D, et al. The association between obesity and fluid intelligence impairment is mediated by chronic low-grade inflammation[J]. Br J Nutr,2014,112(10):1724-34.

[2] 李從青, 姚 潔, 劉長(zhǎng)明, 等. 內(nèi)毒素對(duì)妊娠期糖尿病患者外周血單核細(xì)胞 TLR4 mRNA 及 NFκ-B mRNA 表達(dá)的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 46(3): 254-7.

[3] 秦文星. AOG抑制LPS誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB信號(hào)通路活化的機(jī)制研究[D].第二軍醫(yī)大學(xué),2013.

[4] 魏玉梅,楊慧霞. 妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)變遷[J].中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2013,29(4):295-8.

[5] American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J]. Diabetes Care, 2011, 34 Suppl 1:s62-9.

[6] Ramirez Alvarado M M,Sanchez Roitz C.Relationship between serum levels of C-reactive protein and alpha1-antitrypsin and insulin resistance in obee women[J]. Ivest Clin,2014,55(3):249-59.

[7] Korkmazer E, Solak N.Correlation between inflammatory markers and insulin resistance in pregnancy[J].J Obstet Gynaecol,2015,35(2):142-5.

[8] 叢 林,嚴(yán)小艷,祝藝虹,等. 妊娠期糖尿病孕婦血清甘露糖結(jié)合凝集素水平和胰島素抵抗的關(guān)系[J]. 中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,12(6):458-9.

[9] 叢 林,李從青,姚 潔,等. LPS-TLR4-NF-κB通路在妊娠期糖尿病、正常孕婦及育齡婦女外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2010,19 (11):820-2.

[10] Xie B G,Jin S,Zhu W J.Expression of toll-like receptor 4 in maternal monocytes of patients with gestational diabetes mellitus[J]. Exp Ther Med,2014,7(1):236-40.

[11] Vallejo J G. Role of toll-like receptors in cardiovascular diseases[J].Clin Sci(Lond),2011,121(1):1-10.

[12] Dange R B, Agarwal D, Masson G S, et al. Central blockade of TLR4 improves cardiac function and attenuates myocardial inflammation in angiotensin 11-induced hypertension[J]. Cardiovasc Res, 2014,103(1):17-27.

[13] Dange R B, Agarwal D, Teruyama R, et al. Toll-like receptor 4 inhibition within the paraventricular nucleus attenuates blood pressure and inflammatory response in a genetic model of hypertension[J]. J Neuroinflammation, 2015,12:31.

[14] Li Y ,Fan L,Sun Y,et al.An apple oligogalactan suppresses endotoxin-induced cyclooxygenase-2 expression by inhibition of LPS pathways[J].Int J Biol Macromol,2013,61:75-81.

[15] Liu L,Li Y H,Niu Y B,et al.An apple oligogalactan prevents against inflammation and carcinogenesis by targeting LPS/TLR4/NF-κB pathway in a mouse model of colitis-associated colon cancer[J].Carcinogenesis,2010,31(10):1822-32.

Trigalacturonic acid competing with lipopolysaccharide inhibit the TLR4 signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes

Yang Qin, Cong Lin,Yuan Jing,et al

(Prenatal Diagnosis Center, Dept of Obstetrics and Gynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To study the inhibition of trigalacturonic acid and lipopolysaccharide(LPS) in LPS-TLR4-NF-κB signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes. Methods 15 ml of peripheral venous blood was obtained from 30 pregnant women with gestational diabetes and mononuclear cells were isolated. They were cultured with LPS, trigalacturonic acid(TGA), LPS combining with TGA respectively.Western blot and ELISA were used to detect the expressions of TLR4, NF-κB p65 and the level of TNF-α,IL-1,IL-10. Results The expressions of TLR4, NF-κB p65 and the TNF-α, IL-1, IL-10 were higher than the control after stimulated with LPS alone or TGA. And the difference was clearly statistically significant(P<0.05). The expressions of TLR4, NF-κB p65 and the TNF-α, IL-1, IL-10 were lower compared with LPS alone or TGA when stimulated with LPS combined with TGA. However it was high compared with the control. The differences were both clearly statistically significant(P<0.05).And the correlations between the TLR4 and NF-κB p65 were clearly statistically significant (P<0.01). Conclusion Trigalacturonic acid competing with LPS may inhibit the TLR4 signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes. And it can provide a guide to the prevention and treatment of gestational diabetes mellitus.

trigalacturonic acid; endotoxin; gestational diabetes mellitus; TLR4 signaling pathway

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.046.html

安徽省自然科學(xué)基金(編號(hào)：1208085MH172)；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2011Z215)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心，合肥 230022

楊 琴，女，碩士研究生；

叢 林，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：conglin1957@163.com

R 714.5

A

1000-1492(2016)01-0098-05

2015-09-30接收