李小玲，刁娟娟，李新霞#（1.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 83008；.新疆醫(yī)科大學中心實驗室分析測試中心，烏魯木齊 830011）

HPLC法同時測定益膚丸中香豆素類化合物的含量

李小玲1＊，刁娟娟2，李新霞2#（1.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 830028；2.新疆醫(yī)科大學中心實驗室分析測試中心，烏魯木齊 830011）

目的：建立同時測定益膚丸中香豆素類化合物含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODS-3，流動相為乙腈-水（49∶51，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為320 nm，柱溫為30℃，進樣量為20 μl。結果：蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當歸酸酯檢測質量濃度線性范圍分別為5.16～206.4 μg/ml（r=0.999 9）、37.40～1 495.89 μg/ml（r=0.999 9）、9.95～318.34 μg/ml（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為96.05%～103.19%（RSD=2.18%，n= 9）、96.90%～103.09%（RSD=2.07%，n=9）、95.50%～103.57%（RSD=2.15%，n=9）。結論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性較好，可用于益膚丸中香豆素類化合物含量的同時測定。

益膚丸；蛇床子素；異歐前胡素；二氫歐山芹醇當歸酸酯；含量測定；高效液相色譜法

益膚丸由黨參、羌活、獨活等16味中藥材組成，具有健脾化濕、活血潤膚止癢的功效，常用于慢性濕疹、銀屑病、神經性皮炎、皮膚瘙癢等癥的治療，原方以煎劑在臨床使用多年，因其療效顯著，后制成丸劑作為新疆昌吉州中醫(yī)院的院內中藥制劑，目前尚無質量可控方法。存在于益膚丸中的羌活、獨活均有祛風除濕、止痛抗炎作用，而產生該藥理活性的物質主要為香豆素類化合物［1-2］。異歐前胡素、蛇床子素和二氫歐山芹醇當歸酸酯［3］分別為羌活和獨活中的香豆素類化合物，其含量的多少與益膚丸藥效有一定的聯(lián)系。因此，本研究利用高效液相色譜法（HPLC）在同一色譜條件下同時測定以上3種香豆素類化合物的含量，建立含量測定方法，從而確定量效關系，為益膚丸質量控制方法的建立提供更加準確的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；AB135-S型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

益膚丸（新疆昌吉回族自治州中醫(yī)醫(yī)院自制，批號：20140201、20140202、20140301，規(guī)格：60 g/瓶）；蛇床子素對照品（批號：110822-201308，純度：100%）、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品（批號：111583-201304，純度：98.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；異歐前胡素對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：A0012，純度：≥99%）；乙腈為色譜純，甲醇、95%乙醇均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（49∶51，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取蛇床子素對照品10.32 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度為206.4 μg/ml的蛇床子素對照品貯備液；精密稱取異歐前胡素對照品15.11 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度為1 495.8 μg/ml的異歐前胡素對照品貯備液；精密稱取二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品10.12 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度為397.92 μg/ml的二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品貯備液。分別精密吸取上述蛇床子素對照品貯備液2.5 ml、異歐前胡素對照品貯備液0.6 ml、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品貯備液0.5 ml，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品5 g，加硅藻土2.5 g，研勻，置圓底燒瓶中，加甲醇75 ml，加熱回流45 min，濾過，再加甲醇50 ml，加熱回流0.5 h，濾過，合并濾液，濾液蒸干，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按益膚丸處方比例和制備工藝制備缺羌活、獨活的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果，蛇床子素的保留時間約為33 min，理論板數(shù)為19 619；分離度為1.7，拖尾因子為1.05。異歐前胡素的保留時間約為38 min，理論板數(shù)為18 984；分離度為1.6，拖尾因子為1.04。二氫歐山芹醇當歸酸酯的保留時間約為42 min，理論板數(shù)為19 553；分離度為1.7，拖尾因子為0.99。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.蛇床子素；2.異歐前胡素；3.二氫歐山芹醇當歸酸酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.osthole；2.isoimperatorin；3.columbianadin

2.4 線性關系考察

分別量取“2.2.1”項下對照品貯備液適量，加甲醇制成質量濃度分別為5.16、10.32、20.64、51.6、103.2、206.4 μg/ml的系列蛇床子素對照品溶液，加甲醇制成質量濃度分別為37.40、74.79、149.59、299.18、747.95、1 495.89 μg/ml的系列異歐前胡素對照品溶液，加甲醇制成質量濃度分別為9.95、19.90、39.79、79.58、159.17、318.34 μg/ml的系列二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當歸酸酯回歸方程分別為y=72 898.611x+ 2 858.811 5（r=0.999 9）、y=56 920.295 1x+89 098.993 5（r=0.999 9）、y=53 724.346 8x+8 786.074 6（r=0.999 9）。結果表明，蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當歸酸酯檢測質量濃度線性范圍分別為5.16～206.4、37.40～1 495.89、9.95～318.34 μg/ml。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積的RSD分別為2.87%、1.07%、2.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20140201）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、15、18、21、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，蛇床子素、異歐前胡素在24 h內穩(wěn)定性良好，其峰面積的RSD分別為1.43%、0.98%（n=9）；二氫歐山芹醇當歸酸酯在15 h內基本穩(wěn)定，其峰面積的RSD=1.31%（n=9），超過15 h后發(fā)生降解，其峰面積增大，RSD=29.4%。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20140201）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯含量平均值分別為131.26、236.57、52.92 μg/g，RSD分別為2.16%、1.57%、2.15%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：20140201）適量，共6份，分別加入低、中、高含量的蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=9）Tab 1 Results of recovery tests（n=9）

續(xù)表1Continued Tab 1

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=3，μg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n=3，μg/g）

3 討論

本試驗因在同一色譜條件下同時測定益膚丸中蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當歸酸酯3種化合物，綜合2015年版《中國藥典》（一部）和相關文獻方法［3-6］，最終確定采用文中色譜條件。

益膚丸中二氫歐山芹醇當歸酸酯穩(wěn)定性差，故用于益膚丸中香豆素類化合物含量測定的供試品溶液應在檢測前臨時制備?？紤]到樣品中化合物的穩(wěn)定性，提取和濾液蒸干時，溫度應不超過80℃，以避免熱不穩(wěn)定成分的降解。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復性較好，可用于益膚丸中香豆素類化合物含量的同時測定。

［1］李云霞，高春華，沙明.中藥羌活化學成分及藥理作用研究進展［J］.遼寧中醫(yī)學院學報，2004，6（1）：22.

［2］段志富，陳建偉，李祥.傘形科藥用植物中香豆素類成分及其藥理作用研究現(xiàn)狀［J］.中國藥房，2008，19（3）：223.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：182.

［4］胡太德，陳紹成，譚君.重慶道地藥材獨活與全國其他產區(qū)獨活主要藥效成分含量對比研究［J］.中國藥房，2015，26（33）：4 711.

［5］段紅，翟科峰，曹穩(wěn)根，等.正交試驗法優(yōu)選祛風止痛片中制草烏、獨活的合提工藝［J］.中成藥，2010，32（8）：1 421.

［6］謝惠艷，王英豪，王蓉蓉，等.正交試驗優(yōu)選羌活-獨活藥對的合提工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（12）：10.

（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of Coumarin Compounds in Yifu Pill by HPLC

LI Xiaoling1，DIAO Juanjuan2，LI Xinxia2（1.Dept.of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830028，China；2.Analysis and Testing Center of Central Laboratory，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of coumarin compounds in Yifu pill.METHODS：HPLC was performed on the column of Inertsil ODS-3 with mobile phase of acetonitrile-water（49∶51，V/V）at a flow rate was 1.0 ml/min，the detection wavelength was 320 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 5.16-206.4 μg/ml for osthole（r=0.999 9），37.40-1 495.89 μg/ml for isoimperatorin（r=0.999 9）and 9.95-318.34 μg/ml for columbianadin（r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3.0%；recoveries were 96.05%-103.19%（RSD=2.18%，n=9）for osthole，96.90%-103.09%（RSD=2.07%，n=9）for isoimperatorin，95.50%-103.57%（RSD=2.15%，n=9）for columbianadin.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of coumarin compounds in Yifu pill.

Yifu pill；Osthole；Isoimperatorin；Columbianadin；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）30-4299-03

2015-10-19

2016-02-04）

＊主管藥師。研究方向：中成藥質量標準。電話：0991-4609105。E-mail：lixiaoling008@sohu.com

#通信作者：教授，博士生導師。研究方向：新藥研發(fā)。電話：0991-4365034。E-mail：LXX6668@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.40