陳麗姣，楊冬霞，趙艷霞（1.山東理工職業(yè)學(xué)院，山東濟(jì)寧 7067；.山東創(chuàng)新藥物研發(fā)有限公司，濟(jì)南50101；3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究生教育中心，濟(jì)南 5006）

HPLC法測定他米巴羅汀片的溶出度

陳麗姣1＊，楊冬霞2，趙艷霞3#（1.山東理工職業(yè)學(xué)院，山東濟(jì)寧 272067；2.山東創(chuàng)新藥物研發(fā)有限公司，濟(jì)南250101；3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究生教育中心，濟(jì)南 250062）

目的：建立測定他米巴羅汀片溶出度的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為甲醇-水-冰乙酸（85∶15∶1，V/V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為235 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20 μl。溶出度測定采用槳法，以pH6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為900 ml，轉(zhuǎn)速為50 r/min，60 min取樣。結(jié)果：他米巴羅汀檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.801～2.804 μg/ml（r=0.999 6）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜3%；回收率分別為99.58%～100.90%（RSD=0.25%，n=9）；3批樣品的溶出度測定結(jié)果分別為98.25%、96.54%、92.38%（n=6）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，適用于他米巴羅汀片的溶出度測定。

高效液相色譜法；他米巴羅汀片；溶出度

急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）是一種特殊類型急性髓系白血病，病程發(fā)展迅速，死亡率高［1］。APL患者存在染色體t（15；17）易位，該易位導(dǎo)致分別定位于染色體15q22和17q21的病變蛋白與維A酸受體（RAR）α嵌合，形成PML-RARα融合基因［2-4］。他米巴羅?。═amibarotene）化學(xué)名為4-［（5，6，7，8-四氫-5，5，8，8-四甲基-2-萘基）甲酰］苯甲酸，它是一個新的RARα促進(jìn)劑，對復(fù)發(fā)或難治性急性前骨髓細(xì)胞性白血病（即APL）具有顯著的分化誘導(dǎo)能力，從而可產(chǎn)生治療作用。其片劑由日本新藥株式會社研制開發(fā)，于2005年在日本首次上市（商品名：Amnolake，規(guī)格：2 mg）［5-6］，該藥口服后吸收迅速、療效確切、副作用?。?］。目前，其仿制藥我國有幾家研發(fā)單位正在申報臨床，國內(nèi)市場空間巨大。為了保障藥品質(zhì)量和用藥安全，筆者參照2015年版《中國藥典》（四部）“溶出度與釋放度測定法”［8］和《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》［9］中的相關(guān)要求，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了國產(chǎn)他米巴羅汀片的溶出度測定方法。

1 材料

1.1 儀器

600E-2487型HPLC儀，包括600E多溶劑輸送系統(tǒng)（有梯度控制器的高壓輸液泵）、在線脫氣機(jī)、Rheodyne 7725i手動進(jìn)樣閥、2487雙通道紫外檢測器等（美國Waters公司）；ZRS-8G型智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；AX105DR型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

他米巴羅汀片（濟(jì)南康和醫(yī)藥科技有限公司，批號：20130401、20130402、20130403，規(guī)格：2 mg）；他米巴羅汀對照品（濟(jì)南康和醫(yī)藥科技有限公司，批號：20130301S，純度：99.9%）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［10］

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-冰乙酸（85∶15∶1，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：235 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取對照品適量，精密稱定，加甲醇10 ml使溶解，用溶出介質(zhì)pH6.8磷酸鹽緩沖液（取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 ml，加0.2 mol/L氫氧化鈉溶液118 ml，用水稀釋至1 000 ml，搖勻，即得）稀釋制成每1 ml中約含2 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，采用2015年版《中國藥典》（四部）“溶出度與釋放度測定法”第二法（槳法），以pH6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為900 ml，轉(zhuǎn)速為50 r/min，溫度為（37±0.5）℃，依法操作，于60 min時取溶出液10 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 濾膜吸附試驗

取按“2.2.1”項下方法制備的對照品溶液適量，作為濾過前溶液；取上述濾過前溶液適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為濾過后溶液。分別取濾過前、后溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量，以濾過前含量為100%，計算濾膜吸附量。結(jié)果表明，0.45 μm微孔濾膜對他米巴羅汀的吸附量＜2.0%，符合規(guī)定［9］。

2.4 專屬性試驗

取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和溶出介質(zhì)各20 μl，分別按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果表明，供試品和對照品色譜中主峰的保留時間一致；各成分峰基線分離良好，且其他成分對主成分測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.溶出介質(zhì)；1.他米巴羅汀Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.dissolution medium；1.tamibarotene

2.5 線性關(guān)系考察

取對照品約10 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加甲醇10 ml使溶解，以溶出介質(zhì)pH6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，用pH6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取上述貯備液2、3、4、5、6、7 ml，分別置于50 ml量瓶中，加pH6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為0.8～2.8 μg/ml的系列對照品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以他米巴羅汀質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=101 023x－1 924.4（r=0.999 6）。結(jié)果表明，他米巴羅汀檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.801～2.804 μg/ml。

2.6 精密度試驗

2.6.1 儀器精密度 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，他米巴羅汀峰面積的RSD=0.25%（n=6），表明儀器精密度良好。2.6.2 中間精密度 取同一批樣品（批號：20130401）6片，由不同人員分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，各6份，分別在不同儀器上（Waters 600型和Waters 2695型HPLC儀）按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定并計算溶出度。結(jié)果，他米巴羅汀片的平均溶出度分別為98.42%、97.25%，RSD分別為2.06%、2.14%（n=6），表明本方法的中間精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20130401）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8 h時，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，他米巴羅汀峰面積的RSD=0.37%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20130401）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，他米巴羅汀峰面積的RSD=0.74%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗

取對照品約12、16、20 mg，每種質(zhì)量各3份，置于不同的100 ml量瓶中，再分別按樣品處方比例混合輔料，加甲醇10 ml使溶解，加溶出介質(zhì)pH6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別精密量取續(xù)濾液1 ml，置于100 ml量瓶中，加pH6.8磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 溶出度均一性試驗

取批號20130401的樣品6片，各按“2.2.2”項下方法進(jìn)行溶出度試驗，分別在5、15、30、45、60 min時取溶出液10 ml（同時補(bǔ)充溶出介質(zhì)10 ml），濾過，取續(xù)濾液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算他米巴羅汀在各時間點(diǎn)的累積溶出度（詳見表2），并繪制溶出曲線（詳見圖2）。結(jié)果，6片樣品溶出曲線趨勢基本相同，在各時間點(diǎn)的累積溶出度的RSD均＜2%，表明樣品同一批次內(nèi)的溶出度均一性良好。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab 1 Results of recovery test（n=9）

表2 各時間點(diǎn)的累積溶出度測定結(jié)果（%）Tab 2 Determination results of cumulative dissolution at each time point（%）

圖2 溶出曲線Fig 2 Dissolution curves

2.11 樣品溶出度測定

取3批樣品各6片，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計算每片的溶出度及平均值（要求均≥標(biāo)示量的75%），結(jié)果見表3。

表3 樣品溶出度測定結(jié)果（n=6，%）Tab 3 Determination results of dissolution of samples（n= 6，%）

3 討論

3.1 溶出介質(zhì)體積的選擇

根據(jù)《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》［9］的要求，口服固體制劑溶出度測定溶出介質(zhì)體積一般采用900 ml或1 000 ml，方可符合漏槽條件，并能滿足溶出度測定方法的要求。考慮到樣品規(guī)格為2 mg，規(guī)格較小，為了提高靈敏度，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［10］，選用900 ml作為本試驗溶出介質(zhì)的體積。

3.2 溶出介質(zhì)的選擇

口服固體制劑溶出度測定所用溶出介質(zhì)一般采用水、0.1 mol/L鹽酸溶液（pH1.0）、pH4.5乙酸鹽緩沖液和pH6.8磷酸鹽緩沖液等。本試驗前期曾分別選用以上4種溶出介質(zhì)進(jìn)行預(yù)試驗（其他試驗條件不變），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，他米巴羅汀在0.1 mol/L鹽酸溶液（pH1.0）和pH4.5乙酸鹽緩沖液介質(zhì)中60 min時的溶出度均比較低，而在水和pH6.8磷酸鹽緩沖液介質(zhì)中45～60 min時的溶出度比較高；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在水介質(zhì)中的溶出曲線未出現(xiàn)拐點(diǎn)，而在pH6.8磷酸鹽緩沖液中溶出曲線有明顯的拐點(diǎn)。故本試驗最終選擇了與文獻(xiàn)［10］方法一致的溶出介質(zhì)pH6.8磷酸鹽緩沖液。

3.3 轉(zhuǎn)速的選擇

本試驗前期還對溶出度試驗的轉(zhuǎn)速進(jìn)行了考察。通過比較發(fā)現(xiàn)以50 r/min作為轉(zhuǎn)速，溶出速率已較快。在水、pH6.8磷酸鹽緩沖液中5 min時溶出度均＞60%，15 min時均＞80%，即50 r/min的轉(zhuǎn)速可以滿足本品溶出度測定要求。

3.4 測定方法的選擇

當(dāng)他米巴羅汀片溶于900 ml的pH6.8磷酸鹽緩沖液中時，主成分質(zhì)量濃度約為2.2 μg/ml，值非常低，在紫外條件下的吸收度＜0.1，會顯著影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。故本試驗最終選擇了更為靈敏的HPLC法進(jìn)行測定。

綜上所述，本方法簡便、準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，適用于他米巴羅汀片的溶出度測定。

［1］劉春燕.急性早幼粒細(xì)胞白血病的“克星”：全反式維甲酸［J］.開卷有益：求醫(yī)問藥，2007（3）：10.

［2］ Ohnishi K.PML-RARalpha inhibitors（ATRA，tamibaroten，arsenic troxide）for acute promyelocytic leukemia［J］. Int J Clin Oncol，2007，12（5）：313.

［3］王杰松，陳志哲.急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療現(xiàn)狀［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（11）：838.

［4］楊立平.他米巴羅汀藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2008，9（7）：57.

［5］Takeuchi M.Clinical experience with a new synthetic retinoid，tamibarotene（Am-80）for relapsed or refractory acute promyelocytic leukemia［J］.Gan To Kagalcu Ryoho，2006，33（3）：401.

［6］Davies SL，Castaner J，Capdevila LG.Tamibarotene［J］. Drugs Future，2005，30（7）：688.

［7］賴樹清，須媚.急性早幼粒細(xì)胞性白血病治療藥：他米巴羅汀：tamibarotene［J］.世界臨床藥物，2007，28（4）：252.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：121-124.

［9］國家食品藥品監(jiān)督管理局.普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.2009.

［10］ 東光薬品工業(yè)（株）.アムノレイク錠2mgに関する資料，新薬の承認(rèn)に関する情報［EB/OL］.（2005-06）［2013-06］.http：//www.info.pmda.go.jp/shinyaku/P200500 012/left.html.

（編輯：周 箐）

Dissolution Determination of Tamibarotene Tablet by HPLC

CHEN Lijiao1，YANG Dongxia2，ZHAO Yanxia3（1.Shandong Polytechnic College，Shandong Jining 272067，China；2.Shandong Chuangxin Pharmaceutical Research and Development Co.Ltd.，Jinan 250101，China；3.Graduate Education Center，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the dissolution determination of Tamibarotene tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Diamonsil C18with mobile phase of methanol-water-acetic acid（85∶15∶1，V/V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 235 nm，column temperature was 25℃，and injection volume was 20 μl.The paddle method was used to determine the dissolution，using pH6.8 phosphate buffer dissolution as medium，medium volume was 900 ml，the rotating speed was 50 r/min，taking samples after 60 min.RESULTS：The linear range of tamibarotene was 0.801-2.804 μg/ml（r= 0.999 6）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recovery was 99.58%-100.90%（RSD= 0.25%，n=9）；the accumulative dissolution rate of 3 batches of samples was 98.25%，96.54%，92.38%（n=6）.CONCLUSIONS：The method simple，accurate with high sensitivity and specificity，and suitable for the dissolution determination of Tamibarotene tablet.

HPLC；Tamibarotene tablet；Dissolution

R927

A

1001-0408（2016）30-4304-03

2015-12-02

2016-09-17）

＊講師，碩士研究生。研究方向：儀器分析。電話：0537-3617622。E-mail：hahachenlijiao@126.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：藥物分析。電話：0531-58672115。E-mail：mls_zhaoyx@ujn.edu.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.42