張 琳，劉葵葵，李 欣，邢雪敏，王 伶（.山東省藥學科學院/山東省化學藥物重點實驗室，濟南2500；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司/山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，濟南 2500）

相似因子法評價雷美替胺片自研制劑與原研制劑溶出曲線的相似性

張 琳1＊，劉葵葵1，李 欣1，邢雪敏1，王 伶2#（1.山東省藥學科學院/山東省化學藥物重點實驗室，濟南250101；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司/山東省黏膜與皮膚給藥技術重點實驗室，濟南 250101）

目的：評價雷美替胺片自研制劑與原研制劑體外溶出行為的一致性。方法：采用槳法，轉(zhuǎn)速為50 r/min，分別以水、pH1.2鹽酸溶液、pH4.0乙酸鹽緩沖液和pH6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，用高效液相色譜法（HPLC）測定雷美替胺片自研制劑與原研制劑中主成分在不同時間點的累積溶出度，并繪制溶出曲線，進而采用相似因子（f2）法評價二者溶出曲線的相似性。結(jié)果：在4種溶出介質(zhì)中，雷美替胺片自研制劑與原研制劑的f2分別為62.8、80.0、77.7、76.2，說明二者溶出曲線具有相似性。結(jié)論：所建立的HPLC法適用于雷美替胺片的溶出度測定；自研制劑與原研制劑的體外溶出行為相似，初步說明自研制劑的處方和工藝具有合理性。

雷美替胺片；自研制劑；原研制劑；高效液相色譜法；相似因子；溶出曲線；評價

雷美替胺（Ramelteon）是一種口服催眠藥，由日本武田公司首研成功，于2005年7月通過美國食品與藥品管理局（FDA）批準上市，片劑批準的規(guī)格為8 mg，商品名Rozerem?［1］。該藥是第一個臨床應用于治療失眠的褪黑素受體激動藥，對褪黑素MT1和MT2受體具有高度親和性，對MT3受體的親和力很弱［2］，主要用于治療難以入睡型失眠癥，對慢性失眠和短期失眠也有確切療效［3-4］。

目前，國內(nèi)尚未有雷美替胺片仿制制劑獲批上市，也未見雷美替胺片溶出度測定或溶出曲線考察的相關文獻報道。本研究建立了雷美替胺片溶出度測定的高效液相色譜法（HPLC），并考察了其自研制劑（受試制劑）與原研制劑（參比制劑）在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線；同時，采用相似因子（f2）法評價了二者溶出曲線的相似性，旨在為其自研制劑與原研制劑的質(zhì)量一致性評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包含二極管陣列檢測器（DAD）、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱等（美國Agilent公司）；ZRS-8G型智能溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；BT125D型電子天平（德國Sartorius公司）；pHSJ-3F型酸度計（上海雷磁儀器廠）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

雷美替胺對照品（上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，批號：131224，純度：99.57%）；雷美替胺片（山東省藥學科學院自制批號：20130901，規(guī)格：8 mg）；雷美替胺片（原研制劑，美國武田制藥公司，批號：C18882，規(guī)格：8 mg）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent-ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH5.0）-甲醇（30∶70，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：288 nm；柱溫：30℃；進樣量：50 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取樣品細粉適量（約含雷美替胺8 mg），精密稱定，置于100 ml量瓶中，加流動相適量，超聲處理5 min使溶解，放冷，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm混合纖維素酯濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液1 ml，置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液 取對照品約8 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加流動相振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取上述貯備液1 ml，置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品處方比例稱取除雷美替胺外的各輔料制備混合粉末，取約0.16 g，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加流動相適量，超聲處理5 min使溶解，放冷，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm混合纖維素酯濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液1 ml，置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 溶出介質(zhì) 水：純化水；pH1.2鹽酸溶液：精密量取鹽酸7.65 ml，加水稀釋至1 000 ml；pH4.0乙酸鹽緩沖液：稱取乙酸鈉1.22 g、冰乙酸2.46 g，加水950 ml攪拌使乙酸鈉溶解后再加水稀釋至1 000 ml；pH6.8磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8 g、氫氧化鈉0.896 g，加水適量攪拌使溶解后再加水稀釋至1 000 ml。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下的對照品溶液、供試品溶液（自研制劑）和陰性對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，該色譜條件下，供試品溶液中主峰保留時間與對照品溶液中主峰保留時間一致，而陰性對照在該保留時間處無干擾，說明本方法的專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；1.雷美替胺Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance solution；B.test sample solution；C.negative control solution；1.ramelteon

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.2”項下對照品貯備液1、2、4、6、8、10、15 ml，置于100 ml量瓶中，分別用“2.2.4”項下4種溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得雷美替胺在水、pH1.2鹽酸溶液、pH4.0乙酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液中的回歸方程分別為y=30.178x+ 0.628 5（r=0.999 9）、y=30.176x+0.569 8（r=0.999 9）、y= 30.179x+0.769 8（r=0.999 9）、y=30.181x+0.885 6（r=0.999 9）。結(jié)果表明，4種溶出介質(zhì)中雷美替胺檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為0.796 3～11.94 μg/ml。

2.5 定量限考察

精密量取“2.2.2”項下對照品溶液適量，分別稀釋100倍、250倍和500倍后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，當信噪比為10∶1時，測得雷美替胺的定量限為0.80 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雷美替胺峰面積的RSD=1.14%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.10”項下自研制劑樣品在4種溶出介質(zhì)中30 min時的溶出液為供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，4種溶出介質(zhì)制備的供試品溶液中雷美替胺峰面積的RSD分別為1.17%、1.38%、1.26%、1.54%（n=6），表明4種溶出介質(zhì)制備的供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取自研制劑樣品1.3 g，共6份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果，雷美替胺的平均含量為6.04 mg/g，RSD=1.14%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 回收率試驗

取對照品約12、16、20 mg，各3份，精密稱定，分別置于100 ml量瓶中，并按樣品處方比例分別加入各輔料的混合粉末適量，再加流動相適量，超聲處理5 min使溶解，放冷，加流動相稀釋至刻度，制成含雷美替胺低、中、高3種質(zhì)量濃度的溶液，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 ml，共4份，置于不同的25 ml量瓶中，分別用“2.2.4”項下4種溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算雷美替胺的回收率，結(jié)果見表1。

2.10 溶出度測定及溶出曲線繪制

參考FDA溶出度方法數(shù)據(jù)庫中雷美替胺片的溶出度測定條件［5］及2015年版《中國藥典》（四部）“0931溶出度與釋放度測定法”的要求［6］，并參考《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》附錄中的規(guī)定，本試驗采用槳法，分別選用水、pH1.2鹽酸溶液、pH4.0乙酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液4種溶出介質(zhì)進行溶出試驗，溶出介質(zhì)體積為900 ml，轉(zhuǎn)速為50 r/min，溫度為37℃，依法操作，分別于5、10、15、20、30、45、60 min時取溶出液5 ml（取液后及時補充溶出介質(zhì)5 ml），用0.45 μm混合纖維酯濾膜濾過，取續(xù)濾液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算雷美替胺在各時間點的累積溶出度，并繪制溶出曲線。雷美替胺片自研制劑與原研制劑（各取12片進行試驗）在各溶出介質(zhì)中的平均累積溶出度測定結(jié)果見表2，溶出曲線見圖2。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab 1 Results of recovery test（n=9）

圖2 雷美替胺片自研制劑與原研制劑在各溶出介質(zhì)中的溶出曲線（n=12）A.水；B.pH1.2鹽酸溶液；C.pH4.0乙酸鹽緩沖液；D.pH6.8磷酸鹽緩沖液Fig 2 The cumulative dissolution profiles of self-made and original preparations of Ramelteon tablet in each dissolution medium（n=12）A.water；B.pH1.2 hydrochloric acid solution；C.pH4.0 acetate buffer solution；D.pH6.8 phosphate buffered solution

2.11 f2法評價溶出曲線的相似性

f2法是美國FDA推薦的用于評價兩條溶出曲線是否具有相似性的方法，其通過將自研制劑（受試制劑）與原研制劑（參比制劑）兩組累積溶出度數(shù)據(jù)代入公式進行計算，得到f2。若f2在50～100之間，即可認為兩條溶出曲線相似；若f2＜50，即可認為兩條溶出曲線不相似［7］。f2計算公式如下：

式中，Rt和Tt分別代表參比和受試制劑第t時間點的平均累積溶出度；n代表選取計算時間點數(shù)。本試驗選取雷美替胺片自研制劑與原研制劑5～20 min時的平均累積溶出度進行f2計算和相似性評價，結(jié)果見表3。

表2 雷美替胺片自研制劑與原研制劑在各溶出介質(zhì)中的平均累積溶出度測定結(jié)果（n=12，%）Tab 2 Determination results of average cumulative dissolution of self-made and original preparations of Ramelteon tablet in each dissolution medium（n= 12，%）

表3 雷美替胺片自研制劑與原研制劑在各溶出介質(zhì)中的溶出曲線相似性評價結(jié)果Tab 3 Results of similarity evaluation of dissolution profiles of self-made and original preparations of Ramelteon tablet in each dissolution medium

3 討論

3.1 流動相的選擇

雷美替胺解離常數(shù)（pKa）為－0.84［8］，流動相pH調(diào)節(jié)至弱酸性范圍內(nèi)均可得到較理想的色譜峰形。本試驗以pH5.0的磷酸二氫鈉緩沖液與甲醇體系為流動相，得到的色譜峰理論板數(shù)可達8 000以上，對稱因子在0.90～1.10之間，可對色譜峰進行準確積分。另外，因溶出曲線考察測定樣本數(shù)量較多，為了達到大量樣品快速分析的目的，該流動相中有機相占有較高的比例（70%），可加快主峰的洗脫，縮短運行時間。

3.2 測定波長的選擇

采用HPLC法進行試驗前，應首先對其測定波長進行確定。取“2.2”項下對照品貯備液、供試品溶液和陰性對照溶液制備過程中的過濾液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，對照品和供試品中雷美替胺的最大吸收波長均為288 nm，陰性對照在288 nm波長處無干擾，因此本試驗選擇288 nm為溶出度測定波長。

3.3 過濾器吸附量的研究

進行溶出試驗時，過濾裝置對主成分可能有一定的吸附作用，因此有必要研究在取續(xù)濾液進行測定前需要棄除多少體積的初濾液，以保證續(xù)濾液中主成分的質(zhì)量濃度與過濾前主成分的質(zhì)量濃度一致。取“2.2.1”項下供試品溶液適量，用過濾器（內(nèi)含直徑為25 mm、孔徑為0.45 μm混合纖維素酯濾膜）濾過，分別棄除0、1、2、3、4 ml的初濾液，取續(xù)濾液按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積分別為357.03、356.91、356.50、355.32、353.40。可見峰面積無明顯變化，說明過濾器對雷美替胺幾乎無吸附作用，取溶出液經(jīng)濾過后棄除適量初濾液即可。

3.4 自研制劑與原研制劑溶出曲線相似性評價的意義

由雷美替胺片原研制劑在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線考察結(jié)果可知，20 min時其在4種介質(zhì)中的平均累積溶出度均＞85%，在30 min后其累積溶出度到達平臺期；且其在水、pH1.2鹽酸溶液及pH4.0乙酸鹽緩沖液中各時間點的平均累積溶出度無明顯差別，在pH6.8磷酸鹽緩沖液中15 min之前的平均累積溶出度略高于其他3種介質(zhì)（這可能與雷美替胺的pKa有關）。研究人員在進行雷美替胺片自研制劑的處方工藝研究時應以原研制劑為目標，確保自研制劑至少在上述4種介質(zhì)中均與原研制劑保持溶出一致性，從而為實現(xiàn)二者的生物等效奠定基礎。本試驗溶出曲線相似性評價結(jié)果顯示，雷美替胺片自研制劑與原研制劑在4種不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線具有相似性，可初步判斷該自研制劑處方和工藝具有合理性。

3.5 f2計算選取時間點原則的探討

進行f2計算時，選取計算的時間點有一定原則，所選時間點間隔可不相等，但兩對比制劑所取的時間點必須一致，計算時間點為3～5個之間，且需選擇平均累積溶出度＞85%的時間點應不多于1個［9］。根據(jù)雷美替胺片在4種溶出介質(zhì)中的不同累積溶出度數(shù)據(jù)，筆者最終選取的計算時間點分別為：水、pH1.2鹽酸溶液、pH4.0乙酸鹽緩沖液介質(zhì)中選取了5、10、15、20 min 4個時間點，pH6.8磷酸鹽緩沖液介質(zhì)中選取了5、10、15 min 3個時間點。

3.6 仿制藥的質(zhì)量一致性評價及目前的要求

目前，國家食品藥品監(jiān)督管理總局開始要求對2007年前獲得生產(chǎn)批件的口服固體藥物仿制制劑進行質(zhì)量和療效一致性評價［10］，要求通過采用全面的體外溶出度試驗來對其內(nèi)在質(zhì)量進行評估，主要目的是保證其對于不同患者均能具有較高的生物利用度。另外，國內(nèi)申報仿制藥時均要求對自研制劑與原研制劑進行多介質(zhì)的溶出曲線對比，以保證自研制劑在體外溶出行為上與原研制劑的一致性，從而初步反映自研制劑的處方和工藝的合理性，由此給仿制藥初期的工藝開發(fā)提供一種快速、便捷的指導。

［1］葉敏，呂林，徐嘯晨.治療失眠癥新藥雷美替胺［J］.中國新藥雜志，2006，15（15）：1 309.

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［9］謝沐風，操洪欣.溶出度測定中的若干問題［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37（12）：859.

［10］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.國家食品藥品監(jiān)督管理總局關于征求《關于開展仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價的意見（征求意見稿）》意見的公告：2015年第231號［EB/OL］.（2015-11-18）.［2016-03-26］.http：//www.sda.gov.cn/W S01/CL0778/135400.html.

（編輯：周 箐）

Similarity Evaluation of the Dissolution Profiles of Self-made and Original Preparation of Ramelteon Tablet by f2

ZHANG Lin1，LIU Kuikui1，LI Xin1，XING Xuemin1，WANG Ling2（1.Shandong Academy of Pharmaceutical Science/Shandong Provincial Key Laboratory for Chemical Drug，Jinan 250101，China；2.Shandong Freda Pharmaceutical Group Company/Shandong Provincial Key Laboratory of Mucosal and Transdermal Drug Delivery Technology，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To evaluate the similarity of in vitro dissolution of self-made and original preparation of Ramelteon tablet.METHODS：The paddle method was adopted with rotational speed of 50 r/min，using water，pH1.2 hydrochloric acid solution，pH4.0 acetate buffer solution and pH6.8 phosphate buffer solution as dissolution media，HPLC was used to determine the cumulative dissolution of main components of self-made and original preparation of Ramelteon tablet at different time points，dissolution profile was drew，then f2was used to evaluate its similarity.RESULTS：In the 4 dissolution media，the f2of self-made and original preparation of Ramelteon tablet was 62.8，80.0，77.7，76.2，respectively，which indicated that the dissolution profiles showed similarity.CONCLUSIONS：The established HPLC is suitable for the dissolution determination of Ramelteon tablet；the dissolution profiles of the self-made and original preparations are similar，it preliminary indicates the prescription and technological rationality of self-made preparation.

Ramelteon tablet；Self-made preparation；original preparation；HPLC；f2；Dissolution curve；Evaluation

R927

A

1001-0408（2016）30-4307-04

2015-10-31

2016-09-09）

＊工程師，碩士。研究方向：藥物分析。電話0531-88562280。E-mail：watasumi@163.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：新藥研發(fā)。電話：0531-88562280。E-mail：lw6624@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.43