李九零　周成旭　蔣　瑩　嚴(yán)小軍　陳海敏

（寧波大學(xué)浙江省海洋生物工程重點實驗室，寧波 315211）

紅藻糖苷對超低溫凍存微藻的保護(hù)作用

李九零周成旭蔣瑩嚴(yán)小軍陳海敏

（寧波大學(xué)浙江省海洋生物工程重點實驗室，寧波 315211）

為研究紅藻糖苷對超低溫凍存微藻細(xì)胞的保護(hù)作用，研究將3種不同的微藻置于含10% DMSO和不同濃度紅藻糖苷的凍存液中，凍存并解凍后，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞存活率，測定復(fù)養(yǎng)后藻株的生長曲線及相關(guān)生理參數(shù)。結(jié)果顯示，由于冷凍損傷，凍存后各種藻細(xì)胞的生長速率、細(xì)胞密度及生理指標(biāo)都顯著性下降，而紅藻糖苷協(xié)同DMSO能夠顯著增加細(xì)胞的存活率，尤其15%紅藻糖苷能將紫球藻存活率提升20%（P＜0.05）； 生長曲線得到明顯改善； 且對PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率也有顯著性提高（P＜0.05）。總體結(jié)果來看，紅藻糖苷對超低溫凍存微藻，特別是紫球藻具有明顯的保護(hù)作用，且效果強(qiáng)于蔗糖。

紅藻糖苷；海洋微藻；超低溫凍存；DMSO

近年來，微藻在能源、保健品、動物飼料等領(lǐng)域都有非常廣闊的應(yīng)用價值和前景，越來越多的被商業(yè)開發(fā)。傳統(tǒng)的微藻種質(zhì)的保存方法較繁瑣，且細(xì)胞的污染和變異幾率大，容易造成寶貴種質(zhì)的丟失［1］。超低溫凍存技術(shù)是一種在極低溫度下有效長期保藏有價值種質(zhì)資源的技術(shù)，已經(jīng)成為傳統(tǒng)方法最強(qiáng)大的替代方法［2］。

凍存保護(hù)劑（Cryoprotective Additives，CPA）是超低溫凍存的關(guān)鍵因素，主要通過減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成而減弱冰凍損傷，一般由滲透性CPA和非滲透性CPA結(jié)合使用。前者主要通過滲入細(xì)胞后和胞內(nèi)水形成氫鍵，從而破壞冰晶體的成核，如二甲基亞砜（DMSO）、甲醇等； 后者則在細(xì)胞外形成高滲透壓，促進(jìn)細(xì)胞脫水，從而減少冰晶形成，如蔗糖、海藻糖等［3］。小分子糖類是常用的無法擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜的非滲透性CPA。

紅藻糖苷（α-D-吡喃半乳糖基-（1→2）-D-丙三醇）是來源于紅藻的一類低分子量糖苷，是紅藻中重要的光合同化產(chǎn)物，也是主要的滲透壓調(diào)節(jié)劑，能夠調(diào)節(jié)潮間帶紅藻在干出時細(xì)胞的失水適應(yīng)性，以及提高藻類對低溫、高鹽的適應(yīng)能力［4，5］。國外有少量報道指出紅藻糖苷具有抗氧化［6］、保護(hù)細(xì)胞失水、保護(hù)蛋白質(zhì)等大分子［7］的多種作用。由于其來源于海洋藻類，對微藻有非常好的相容性，并且具有玻璃態(tài)形成、大分子保護(hù)、抗氧化性和抗?jié)B透壓功能，因此，非常適宜于細(xì)胞的凍存。

本實驗將紅藻糖苷作為非滲透性CPA結(jié)合DMSO應(yīng)用到3種不同微藻的超低溫凍存中，檢測其對微藻存活率、生長曲線以及生理指標(biāo)的影響，為微藻超低溫凍存的凍存保護(hù)液體系的優(yōu)化提供新的思路。

1　材料與方法

1.1紅藻糖苷

本實驗所用紅藻糖苷提取自壇紫菜，LC-MS確定純度達(dá)到90%［8］。

1.2藻株及培養(yǎng)條件

3種不同種屬的微藻株：顆石藻（Pleurochrysis sp.）、小球藻（Chlorella vulgaris）、紫球藻（Porphyridium cruentum）。藻種由寧波大學(xué)海洋生物工程重點實驗室微藻種質(zhì)庫提供，采用NBM3#培養(yǎng)液配方進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22℃，光照40 μmoL/（m2·s），光暗循環(huán)為L ：D=12h ：12h。每天定時搖兩次，定時測密度，繪制生長曲線。

1.3凍存液的配置

凍存液中滲透性CPA為10%DMSO，非滲透性CPA為紅藻糖苷和蔗糖。將不同濃度梯度的紅藻糖苷和蔗糖分別溶于DMSO中，再用3#培養(yǎng)基稀釋到所需濃度［10%、20%和30%（w/v）］，每個梯度設(shè)3個平行，0.22 μm濾膜過濾滅菌后4℃保存。不加非滲透性CPA的作為空白組。

1.4超低溫凍存方案

待微藻生長至對數(shù)生長期時離心（5000 r/min，10min）收集藻細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)節(jié)密度至5×107/mL左右。將750 μL藻液和750 μL凍存母液加入1.8 mL凍存管中，移液槍吹打混勻后室溫平衡30min，4℃放置30min后預(yù)凍至-80℃，10h后直接投入液氮保存48h。

1.5指標(biāo)檢測

40℃水中快速解凍后，5000 r/min離心10min棄上清，用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次，再以1.5 mL新鮮培養(yǎng)基重新懸浮。

存活率的檢測使用熒光素二乙酸酯（FDA）標(biāo)記活的藻細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測凍存藻株的存活率。FDA用丙酮配置為10 mg/mL母液后保存于-20℃，每次實驗前，F(xiàn)DA工作液由超純水稀釋到0.04 mg/mL。參照Abdallah［9］和Altaf［10］的方法并稍加調(diào)整，對于顆石藻和紫球藻，以200 μLFDA工作液和300 μL藻液混勻后室溫避光孵育10min； 對小球藻，100 μLFDA工作液和300 μL藻液混勻后室溫避光孵育5min。冰激10min停止反應(yīng)后離心去除染液，將細(xì)胞稀釋至5×105/mL，上流式細(xì)胞儀FL1通道檢測FDA熒光強(qiáng)度。檢測時以未染色的熱激死亡細(xì)胞為陰性對照。

復(fù)養(yǎng)后生長曲線的測定將藻液添加到含20 mL新鮮培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件和凍存前一致，每天測定細(xì)胞密度，直至進(jìn)入衰退期，繪制生長曲線。

復(fù)養(yǎng)后對數(shù)期生理指標(biāo)葉綠素?zé)晒馐俏⒃骞夂献饔玫牧己弥笜?biāo)，通過對各種熒光參數(shù)如光能轉(zhuǎn)化效率、電子傳遞速率等的分析，可以得到有關(guān)的光能利用信息，反映其生長狀態(tài)［11］。

培養(yǎng)凍存藻株進(jìn)入對數(shù)生長期后，取樣4 mL，暗處理20min后使用葉綠素?zé)晒鈨x測定藻株的Fv/Fm（PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率）。

1.6統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用SPSS 17.0 軟件系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1紅藻糖苷對凍存藻細(xì)胞存活率的影響

藻細(xì)胞存活率是檢測凍存效果最直接、最重要的指標(biāo)。本研究選擇了10%DMSO作為滲透性CPA，在此基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的紅藻糖苷。結(jié)果顯示（圖1、圖2），紅藻糖苷能夠在DMSO的基礎(chǔ)上不同程度增加3種藻的細(xì)胞存活率，如15%紅藻糖苷將顆石藻的存活率從46.08%增大到64.13%，將紫球藻的存活率從63.06%增大到84.44%，將小球藻的存活率從51.04%增大到65.79%。這說明其作為非滲透性CPA對微藻凍存具有保護(hù)作用，并且效果隨濃度增大而增強(qiáng)。和蔗糖組相比，二者都有保護(hù)效果，但整體而言，紅藻糖苷的保護(hù)效果優(yōu)于蔗糖，特別是對紫球藻的效果顯著優(yōu)于蔗糖，其中15%紅藻糖苷協(xié)同DMSO的保護(hù)作用高達(dá)84.44%，比單獨DMSO保護(hù)作用增強(qiáng)了20%之多（P＜0.05）。

圖1　流式細(xì)胞儀對紫球藻存活率檢測的比較Fig. 1　Comparison of survival levels of Porphyridium cruentum

2.2紅藻糖苷對藻細(xì)胞生長曲線的影響

從生長曲線可以看出（圖3），由于受到冷凍損傷，細(xì)胞密度都出現(xiàn)明顯降低，單獨DMSO處理的藻細(xì)胞在整個生長周期的細(xì)胞密度都偏低。添加紅藻糖苷后，對三種藻的生長速率都有所提高，其效果要優(yōu)于蔗糖組。但對顆石藻和小球藻，其紅藻糖苷對生長曲線的提高效果不是很明顯。而對紫球藻則有較大的提高，特別是在平臺期后，10%和 15%紅藻糖苷處理的藻細(xì)胞密度基本能達(dá)到未凍存對照組的水平。

圖2　紅藻糖苷對3種微藻超低溫凍存解凍后存活率的影響Fig. 2　The effect of floridoside on survival of 3 strains of cryopreserve microalgae

圖3　復(fù)養(yǎng)后藻株的生長曲線Fig. 3　Growth cruves of re-culrured microalgae

2.3紅藻糖苷對凍存微藻的生理參數(shù)的影響

Fv/Fm（PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率）是能有效反映微藻光合效率的指標(biāo)。圖4結(jié)果顯示，凍存后3種微藻的光合效率普遍有所下降，特別是DMSO單獨處理的3種微藻的Fv/Fm值都出現(xiàn)極顯著下降（P＜0.01）。但添加了紅藻糖苷或蔗糖后，3種藻的Fv/Fm都出現(xiàn)顯著的提高，但不存在濃度變化趨勢，紅藻糖苷組中以5%的效果最好。而蔗糖在恢復(fù)3種藻的光合效率方面也有非常好的作用，紅藻糖苷不與其存在顯著性差異。

圖4　紅藻糖苷對3種微藻超低溫凍存解凍后生理參數(shù)的影響Fig. 4　The effect of floridoside on Fv/Fmof 3 strains of cryopreserve microalgae

3　討論

在凍存液中添加非滲透性CPA的方法廣泛應(yīng)用于海洋微藻的超低溫凍存，但目前主要使用的是蔗糖、葡萄糖等常見糖類，由于這些糖是細(xì)胞初級代謝的主要糖類，所以極易被微生物利用，易造成保存微藻的污染［12］。而本研究將來源于海洋紅藻的紅藻糖苷作為一種新型非滲透性CPA應(yīng)用到3種不同的微藻凍存中，由于紅藻糖苷是一種半乳糖甘油結(jié)構(gòu)，不被微生物所利用，因此不會引起污染問題。本研究中發(fā)現(xiàn)紅藻糖苷具備了蔗糖同樣的滲透性效果，并且在提高存活率和恢復(fù)生長方面更優(yōu)于蔗糖，其中15%的紅藻糖苷效果更好。能顯著降低低溫?fù)p傷、提高微藻存活率、并改善復(fù)蘇后的生長曲線及光合呼吸指標(biāo)，尤其對同樣是紅藻的紫球藻保護(hù)效果最佳。

超低溫凍存微藻的整個凍存及解凍過程，細(xì)胞會面臨滲透壓的影響、各種氧化損傷、溶質(zhì)損傷、膜成分丟失、細(xì)胞膜脫水、蛋白質(zhì)變性、溶酶體破壞、膜滲漏破裂等［13］問題。而紅藻糖苷作為一種天然的海洋生物資源，盡管到目前為止報道相對較少，但是它在幾個方面的特點非常適合于海洋藻類的凍存。首先，紅藻糖苷是紅藻中重要的抗?jié)B透壓物質(zhì)。細(xì)胞在凍存時，由于胞外水的凍結(jié)會導(dǎo)致胞內(nèi)水分易滲出胞外，而紅藻糖苷可以吸附在細(xì)胞表面形成黏液層，阻止水分的流失，并通過增大溶液黏度阻止冰晶的生長對細(xì)胞的破壞［14］。另外，紅藻糖苷還具有抗氧化作用，不僅可以清除各種自由基（DPPH、羥自由基、烷基自由基、超氧陰離子自由基等），還可以降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平［15］。細(xì)胞凍存及解凍過程中膜蛋白的各種氨基酸如賴氨酸、精氨酸等極易受到氧化攻擊而導(dǎo)致羰基（主要是醛和酮）的積累，紅藻糖苷則可以顯著抑制此類氧化過程而保護(hù)膜蛋白［6］。

所以紅藻糖苷較于蔗糖、葡糖糖等具有更好的抗氧化、保護(hù)大分子、保水等生物學(xué)功能。此外，紅藻糖苷來源于紅藻，它對藻類的相容性會更好，特別是紅藻，本研究中觀察到紅藻糖苷對紫球藻的凍存保護(hù)作用就要優(yōu)于其他兩種藻，說明紅藻糖苷更適合于紅藻的凍存。

綜上所述，紅藻糖苷可作為微藻超低溫保藏中的非滲透性保護(hù)劑，它與DMSO聯(lián)合使用，可顯著提高微藻的存活率、生長曲線，并提高微藻的光合效率。

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THE CRYOPROTECTIVE EFFECT OF FLORIDOSIDE ON MICROALGAE

LI Jiu-Ling，ZHOU Cheng-Xu，JIANG Ying，YAN Xiao-Jun and CHEN Hai-Min
（Marine Biotechnology Laboratory of Zhejiang Province，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

This study was designed to determine the protective effects of floridoside on cryopreservation of marine microalgae. Three strains of microalgae were cryopreservated by combination of 10% DMSO and different concentrations of floridoside. After frozen-thaw process，the cell viability was determined by performing flow cytometry with fluorescein diacetate（FDA）. Growth curve and physiological parameter（Fv/Fm） were also detected. Results revealed that freezing caused significant decrease on the growth rate of three microalgae，moreover，growth curve and physiological parameters of thawed microalgae were also impacted severely. Combination of floridoside and DMSO significantly improve viability of three microalgae. Especially，15% of floridoside could increase the cell viability of Porphyridium cruentum by 20%（P＜0.05） than that only using DMSO. Growth curve were resumed remarkably，and physiological parameter，PSII was also improved. These findings indicated that appropriate concentration of floridoside might be used as a better cryoprotectant to cryopreserve microalgal species，especially P. cruentum. The protect effect was better than sucrose.

Floridoside； Marine microalgae； Cryopreservation； DMSO

Q-33

A

1000-3207（2016）05-1020-05

10.7541/2016.132

2015-09-02；

2016-01-25

浙江省重大科技專項（2012C12907-6）； 國家公益性行業(yè)（海洋）科研專項經(jīng)費項目（201105023）資助 ［Supported by Major Science and Technology Projects in Zhejiang Province（2012C12907-6）； National Public Welfare Industry（Marine） Research Projects（201105023）］

李九零（1990—），女，河南焦作人； 碩士； 主要研究方向為海洋生物活性物質(zhì)。E-mail：89628638@qq.com

陳海敏，研究員； E-mail：chenhaimin@nbu.edu.cn