肖調(diào)義　李　偉　王榮華　劉巧林　彭慧珍　蘇建明

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410128； 2. 水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，常德 415000； 3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

赤眼鱒Toll 樣受體3基因cDNA全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析

肖調(diào)義1，2李偉1王榮華1劉巧林1，2彭慧珍1，2蘇建明1，3

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410128； 2. 水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，常德 415000； 3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

為探究赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus） Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，ScTLR3）基因是否參與抗病毒免疫反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RACE技術(shù)，克隆得到ScTLR3基因cDNA全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析； 通過(guò)Real-Time qPCR技術(shù)，檢測(cè)了ScTLR3 mRNA在健康赤眼鱒10個(gè)組織中的分布以及感染草魚(yú)呼腸孤病毒（GCRV）后肝臟、脾臟、體腎和頭腎中的表達(dá)特征。結(jié)果表明：ScTLR3基因cDNA序列全長(zhǎng)4043 bp，包括5′-非編碼區(qū)（UTR） 216 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）2715 bp和3′-UTR 1112 bp； ScTLR3共編碼904個(gè)氨基酸殘基，推導(dǎo)的蛋白分子量102.67 kD，理論等電點(diǎn)8.76； SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，ScTLR3由N端的信號(hào)肽（SP）、富亮氨酸結(jié)構(gòu)域（LRRs）、跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）和C端的Toll/白介素-1受體結(jié)構(gòu)域（TIR）組成。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，ScTLR3 mRNA在檢測(cè)的各組織中均有表達(dá)，肝臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織（P＜0.01）； 感染GCRV后，肝臟、脾臟、體腎和頭腎組織中ScTLR3 mRNA均上調(diào)表達(dá)，肝臟、脾臟和體腎組織中的相對(duì)表達(dá)量在24h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的5倍、7倍和6倍。研究表明，ScTLR3具有TLRs家族基因的典型結(jié)構(gòu)特征，并能被GCRV誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其在赤眼鱒抗GCRV入侵免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

赤眼鱒；Toll樣受體3；分子克?。槐磉_(dá)特征

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）是一類識(shí)別病原體保守結(jié)構(gòu)——病原相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）［1，2］。自1985年在果蠅中被發(fā)現(xiàn)起，TLRs基因受到廣大研究者的關(guān)注［3］。魚(yú)類中首個(gè)TLRs基因由Sangrador-Vegas等［4］2000年從虹鱒（Oncorhynchus mykiss）cDNA文庫(kù)中克隆得到。TLR3同時(shí)存在于哺乳動(dòng)物和魚(yú)類，位于細(xì)胞質(zhì)核內(nèi)體上，參與雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）的識(shí)別，是抗病毒免疫反應(yīng)和免疫機(jī)制進(jìn)化研究的理想對(duì)象［5，6］。

目前，已有多種魚(yú)類的TLR3基因的cDNA序列、識(shí)別配體及功能被報(bào)道，如稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）［7］、草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）［8］、斑馬魚(yú)（Danio rerio）［9］、鯽（Carassius auratus）［10］、河豚（Fugu rubripes）［11］、虹鱒（O. mykiss）［12］、南亞野鯪（Labeo rohita）［13］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［14］等。研究顯示，草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV）感染稀有鮈鯽［7］或傳染性造血壞死病病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）感染虹鱒［12］后，相關(guān)組織中TLR3表達(dá)量均顯著上調(diào)，且dsRNA病毒類似物poly（I：C）同樣能誘導(dǎo)虹鱒巨噬細(xì)胞［12］、人胚腎293細(xì)胞［15］和大黃魚(yú)脾臟［16］中TLR3顯著上調(diào)表達(dá)。另外，細(xì)菌也能引起魚(yú)類TLR3基因的表達(dá)水平變化［16，17］。魚(yú)類TLR3的功能與哺乳動(dòng)物相似，在免疫反應(yīng)中富亮氨酸結(jié)構(gòu)域（Leucine-rich repeats，LRRs）與病毒dsRNA特異性結(jié)合并通過(guò)MyD88非依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活相關(guān)信號(hào)因子，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生［18，19］。研究表明，Ⅰ型干擾素通過(guò)促進(jìn)下游干擾素刺激基因（MX1、TRIM等）表達(dá)，從而抑制病毒的繁殖［20，21］。

近年來(lái)，草魚(yú)出血病嚴(yán)重影響草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，其病原GCRV受到廣泛關(guān)注［22］。赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）與草魚(yú)親緣關(guān)系較近，同屬雅羅魚(yú)亞科，分屬赤眼鱒屬和草魚(yú)屬，其作為一種優(yōu)質(zhì)的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，亦被大量研究報(bào)道［23］。劉巧林［24］用GCRV感染赤眼鱒和草魚(yú)后發(fā)現(xiàn)，赤眼鱒存活率較草魚(yú)高一倍以上。為探究ScTLR3基因是否參與赤眼鱒抗病毒免疫反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)克隆了ScTLR3基因cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)檢測(cè)了ScTLR3 mRNA在赤眼鱒各組織中分布和感染GCRV后肝臟、脾臟、體腎和頭腎組織中的表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能提供線索和參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用赤眼鱒購(gòu)自瀏陽(yáng)市北盛鎮(zhèn)烏龍漁場(chǎng)（湖南長(zhǎng)沙），為2014年5月繁育個(gè)體，實(shí)驗(yàn)前培育于面積333 m2，水深1 m的池塘。選取180尾6月齡的健康赤眼鱒［體長(zhǎng)（8.45±0.74） cm，體重（12.33±1.34） g］，于80 L/箱的恒溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)28℃養(yǎng)殖4周，30尾/箱，每天定時(shí)光照12h并按照體重的1%投喂粗蛋白含量為30%的膨化飼料2次。

本實(shí)驗(yàn)用GCRV（106毒株，1.78×107TCID50/mL）由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所曾令兵研究員惠贈(zèng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

總RNA提取和第一鏈cDNA合成選取一尾健康赤眼鱒，丁香酚（國(guó)藥，上海）麻醉處理后，用無(wú)核酸酶勻漿管（Bertin，法國(guó)）分別收集約80 mg腎臟和脾臟組織（預(yù)先加入5粒0.8—1.0 mm陶瓷研磨珠和600 μL裂解液，并在冰上預(yù)冷），立即用均質(zhì)儀Precellys 24（Bertin，法國(guó)）勻漿，勻漿程序：5000 r/ min，15s/次，共2次，間隔5s，總RNA提取的其他步驟參考MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）說(shuō)明書(shū)。將總RNA分裝成3份，分別用于RNA濃度（純度）檢測(cè)、穩(wěn)定性（完整性）檢測(cè)和第一鏈cDNA及RACE cDNA合成。使用BioSpectrometer Basic核酸蛋白儀（Eppendorf，德國(guó)） 檢測(cè)總RNA濃度（純度），穩(wěn)定性（完整性）檢測(cè)步驟：1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比分析置于-70℃和37℃的總RNA樣品，28S∶18S條帶亮度約等于2∶1且無(wú)明顯變化的樣品視為穩(wěn)定（完整）的。使用First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，美國(guó)）試劑盒，以O(shè)ligo（dT）18為引物、約2 μg總RNA為模板，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行第一鏈cDNA合成，產(chǎn)物-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA 部分序列克隆根據(jù)GenBank中草魚(yú)（DQ864497.1）、團(tuán)頭魴（DQ986365.1）、斑馬魚(yú)（AY616582.1） TLR3基因cDNA序列保守區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)同源PCR引物F1/R1、F2/R2（表1），克隆ScTLR3基因cDNA部分序列，50 μL PCR反應(yīng)體系由：赤眼鱒脾臟和肝臟cDNA各0.5 μL、0.25 μL TaKaRa Ex Taq（TaKaRa，大連）、5 μL 10×Ex Taq緩沖液、4 μL dNTP 混合液、正反引物（10 μmol）各1 μL和37.75 μL Mili-Q等級(jí)水組成，擴(kuò)增程序：95℃ 5min； 95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 90s，25 cycles； 72℃ 7min； 4℃ 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化后采用Gel Extraction Kit（Omega Bio-Tek，美國(guó)）回收，產(chǎn)物連接pEGM-T easy載體（Promega，北京），選取2個(gè)陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1　本研究相關(guān)引物Tab. 1　Primers used in this study

末端快速擴(kuò)增（RACE）依據(jù)SMARTer RACE 5′/3′ Kit（Clontech，美國(guó)）用戶手冊(cè)，應(yīng)用Oligo7軟件以拼接的ScTLR3基因部分cDNA序列為模板，設(shè)計(jì)RACE外引物GSP-5′-outer和GSP-3′-outer以及RACE內(nèi)引物GSP-5′-inner和GSP-3′-inner（表1），同時(shí)分別制備5′RACE cDNA和3′RACE cDNA。使用RACE外引物GSP-5′-outer和GSP-3′-outer分別進(jìn)行5′或3′第一次PCR，電泳檢測(cè)首次PCR產(chǎn)物，若無(wú)目的條帶，使用50倍稀釋的首次PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的RACE外引物進(jìn)行巢式PCR，兩次PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均同用戶手冊(cè)。目的片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化后使用In-Fusion?HD Cloning Kit（Clontech，美國(guó)）連接，選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，序列經(jīng)SeqMan軟件拼接后，得到ScTLR3的cDNA全長(zhǎng)序列。

序列分析應(yīng)用ExPASy-Translate tool（http：//web.expasy.org/translate/）預(yù)測(cè)ScTLR3開(kāi)放閱讀框（ORF），并推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列。對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析：分子量和等電點(diǎn)應(yīng)用在線工具ExPASy-Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算； 在線軟件SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）被用來(lái)預(yù)測(cè)信號(hào)肽； 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)使用在線軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）； ITASSER（http：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ITASSER/）被用于氨基酸序列3D建模，其數(shù)據(jù)分析和圖表構(gòu)建采用PyMOL 2.7軟件； 使用MEGA 6.06軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining） 構(gòu)建TLR3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

組織表達(dá)分析選取3尾健康赤眼鱒，分別提取心臟、腦、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、肌肉、腸、鰓和胸腺10個(gè)組織的總RNA，并合成第一鏈cDNA。根據(jù)ScTLR3保守區(qū)設(shè)計(jì)特異的熒光定量引物（ScTLR3-Q-F/R，E=96.64%），以β-actin作為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物（actin-F/R，E=95.37%）（表1）。利用CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，20 μL反應(yīng)體系由10 μL 2×UltraSYBR Mixture（康為世紀(jì)，北京）、上下游引物各0.4 μL和9.2 μL 10倍稀釋的cDNA組成。反應(yīng)條件為95℃ 10min； 95℃ 5s，60℃ 10s，72℃ 10s，采集熒光，35 cycles； 溶解曲線從65℃上升至95℃，每5s上升0.5℃，采集熒光。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

病毒感染和表達(dá)特征分析GCRV攻毒實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射GCRV病毒懸液200 μL/尾，對(duì)照組注射等量磷酸緩沖液（PBS）。在注射后的0、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h分別從3個(gè)實(shí)驗(yàn)箱隨機(jī)選取一尾，用含丁香酚自來(lái)水處理后立即取頭腎、肝臟、脾臟、體腎，提取總RNA，并合成第一鏈cDNA，對(duì)照組采用同樣的方法制備cDNA模板。Real-Time qPCR方法同上。

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Bio-Rad CFX Manager軟件，采用2-ΔΔCt法計(jì)算單個(gè)樣品中ScTLR3的相對(duì)表達(dá)量，并用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），顯著性水平為*P＜0.05，**P＜0.01。

2　結(jié)果

2.1ScTLR3 基因的克隆和序列分析

ScTLR3基因全長(zhǎng)4043 bp，GenBank No. KT 186364，其中ORF為2715 bp，編碼904個(gè)氨基酸殘基，5′-非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR） 216 bp和3′-UTR 1112 bp，在其3′-UTR包含3個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)“aataaa”或“aacaaa”和5個(gè)mRNA不穩(wěn)定信號(hào)“attta”以及典型的Poly A尾巴。預(yù)測(cè)的ScTLR3蛋白相對(duì)分子量為102.67kD，理論等電點(diǎn)為8.76。SMART結(jié)構(gòu)顯示，ScTLR3由N-端的信號(hào)肽（SP，1—23aa）、14個(gè)LRR基序（53—72aa，99—118aa，146—173aa，170—193aa，275—297aa，298—321aa，353—376aa，430—454aa，506—529aa，530—553aa，563—585aa，586—609aa，610—633aa，635—658aa）、LRR_CT 基序（646—698aa）、TM（704—726aa）和TIR（757—900aa）組成（圖1a）。I-TASSER 3D結(jié)構(gòu)模型顯示，ScTLR3包括14個(gè)α螺旋、13個(gè)β折疊，LRRs區(qū)域?yàn)轳R蹄形結(jié)構(gòu)（圖1b/c）。

2.2不同物種TLR3的進(jìn)化分析

結(jié)果顯示，整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為兩支：硬骨魚(yú)類聚為一支，兩棲類和其他參與分析的陸生動(dòng)物聚為一支； 硬骨魚(yú)類中，淡水硬骨魚(yú)類和海水硬骨魚(yú)類各為一支，其中赤眼鱒和武昌魚(yú)聚為一支。進(jìn)一步分析不同物種TLR3 TIR 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，ScTLR3與草魚(yú)（ABI64155.1）和鯉（ABC86865.1）相似度高達(dá)97%，其次是團(tuán)頭魴（ABI83673.1） 96%（圖2）。

圖2　應(yīng)用CLUSTALW進(jìn)行多序列比對(duì)并使用MEGA 6.06采用鄰接法構(gòu)建TLR3的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2　Phylogenetic tree constructed from a CLUSTALW alignments and MEGA version 6.06 Neighbor-Joining of selected TLR3 sequences

2.3ScTLR3的組織表達(dá)及GCRV誘導(dǎo)表達(dá)分析

采用Real-Time qPCR方法檢測(cè)ScTLR3 mRNA在健康赤眼鱒不同組織的相對(duì)表達(dá)量及GCRV攻毒后的表達(dá)量變化，結(jié)果表明：ScTLR3 mRNA在所檢測(cè)的10個(gè)組織中均有表達(dá)，由低到高依次為：胸腺＜鰓＜體腎＜腦＜腸＜脾臟＜肌肉＜頭腎＜心臟＜肝臟，且肝臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他9個(gè)組織（P＜0.01）（圖3）。與對(duì)照組相比，感染GCRV后肝臟、脾臟、腎臟和頭腎組織中ScTLR3 mRNA均上調(diào)表達(dá)，其中，肝臟和脾臟中相對(duì)表達(dá)量除0和120h外均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），頭腎中相對(duì)表達(dá)量除0外均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。感染GCRV后ScTLR3 mRNA在被檢測(cè)的四種組織中表達(dá)特征相似，均出現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)峰，同時(shí)又具有一定差異性，肝臟和脾臟組織中第一個(gè)表達(dá)峰出現(xiàn)在24h，第二個(gè)表達(dá)峰出現(xiàn)在96h但低于前一個(gè)，腎臟組織中第一個(gè)表達(dá)峰出現(xiàn)在24h，但第二個(gè)表達(dá)峰并不明顯，頭腎組織中兩個(gè)表達(dá)峰出現(xiàn)較肝臟和脾臟早，分別出現(xiàn)在12h和72h且表達(dá)量相近（圖4）。

圖3　健康赤眼鱒心臟、腦、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、肌肉、腸、鰓和胸腺組織中ScTLR3相對(duì)表達(dá)量Fig. 3　Relative expression of ScTLR3 in different tissues of barbel chub，include heart，brain，liver，spleen，trunk kidney，head kidney，muscle，intestines，gills and thymus

圖4　感染GCRV后ScTLR3基因的時(shí)空表達(dá)特征Fig. 4　Expression pattern of ScTLR3 after infected by GCRV

3　討論

在免疫反應(yīng)中，機(jī)體對(duì)病原的識(shí)別、呈遞與免疫反應(yīng)的強(qiáng)度、速度直接相關(guān)，TLR3主要參與識(shí)別胞內(nèi)病毒dsRNA，并以其特有的MyD88非依賴途徑激活下游免疫因子，誘導(dǎo)I型干擾素（α-IFN和β-IFN）表達(dá)和分泌，達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的［25—27］?；谇捌诔嘌埙VGCRV攻毒實(shí)驗(yàn)中赤眼鱒死亡率顯著低于草魚(yú)的結(jié)果和TLR3在哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)中的重要作用以及其在各物種間的保守性，我們希望探究TLR3是否在赤眼鱒抗病毒免疫反應(yīng)中也發(fā)揮了作用。

3.1ScTLR3 cDNA序列及結(jié)構(gòu)特征分析

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RACE方法獲得了ScTLR3基因cDNA全長(zhǎng)序列4043 bp，預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框（ORF） 2715 bp，ScTLR3基因3′-UTR 1112 bp，較草魚(yú)（DQ864497.1）、團(tuán)頭魴（DQ986365.1）、斑馬魚(yú)（NM_001013269.3）等長(zhǎng)400—600 bp，已有研究表明，3′-UTR的長(zhǎng)度和序列構(gòu)成與mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白定位均有一定的影響［28—30］。不穩(wěn)定的mRNA 3′-UTR通常含有AU富含基序（AU-rich elements，AREs），如免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因IL-1、IL-2、IL-4、TNF和IFN等，ARE結(jié)構(gòu)中最典型的基序?yàn)锳TTTA［31—33］。在本實(shí)驗(yàn)中，ScTLR3基因mRNA 3′-UTR包含5個(gè)ATTTA序列，而草魚(yú)（DQ864497.1）包含4個(gè)、人（NM_003265.2）包含3個(gè)、團(tuán)頭魴（DQ986365.1）包含2個(gè)、斑馬魚(yú)（NM_001013269.3）一個(gè)也沒(méi)有。結(jié)果表明，ScTLR3基因的穩(wěn)定性不及草魚(yú)、人、團(tuán)頭魴和斑馬魚(yú)。氨基酸序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，ScTLR3是一個(gè)保守型很高的基因，ScTLR3與草魚(yú)TLR3相似度高達(dá)96%，與其他鯉科魚(yú)類（團(tuán)頭魴、斑馬魚(yú)、稀有鮈鯽、鯽等）相似度也達(dá)到了達(dá)82%以上，這提示ScTLR3很可能是赤眼鱒體內(nèi)一種重要的基礎(chǔ)分子。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，ScTLR3主要由胞外的LRRs結(jié)構(gòu)域、TM結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域組成，具有TLRs的典型結(jié)構(gòu)。3D模型顯示ScTLR3基因LRRs結(jié)構(gòu)域?yàn)榈湫偷鸟R蹄形結(jié)構(gòu)，有資料證明，該結(jié)構(gòu)能與dsRNA形成穩(wěn)定的二聚體，有利于dsRNA的識(shí)別［34，35］。

3.2ScTLR3表達(dá)特征

不同物種TLR3 mRNA在健康個(gè)體組織中的表達(dá)情況有所差異。Su等［7］定量檢測(cè)未經(jīng)GCRV攻毒的稀有鮈鯽，發(fā)現(xiàn)TLR3在鰓、心臟、腸、體腎、肝臟、肌肉和脾臟中均有表達(dá)，在肝臟、肌肉和體腎中表達(dá)量較高。Yang等［36］定量檢測(cè)健康鯉鰓、心臟、腸、體腎、肝臟、肌肉和脾臟中TLR3的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)鯉肌肉和心臟中TLR3表達(dá)量較低，而在腸、體腎和肝臟中表達(dá)量較高。在本實(shí)驗(yàn)中，ScTLR3 mRNA在被檢測(cè)的10個(gè)組織中均有表達(dá)，在肝臟中的表達(dá)量極顯著的高于其他9個(gè)組織，這可能與組織的功能差異有關(guān)。

大量誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，魚(yú)類TLR3基因能被dsRNA病毒、dsRNA類似物poly（I∶C）或DNA病毒誘導(dǎo)表達(dá)［37］。Su等［8］用GCRV感染草魚(yú)后發(fā)現(xiàn)，草魚(yú)脾臟中TLR3的表達(dá)量在1—7d均上調(diào)表達(dá)，1—2d上升到對(duì)照組的3倍以上，除第4天略微下降外，至第7天（實(shí)驗(yàn)結(jié)束）一直上升。Huang等［16］定量檢測(cè)注射poly（I：C）的大黃魚(yú)，發(fā)現(xiàn)其脾臟組織TLR3表達(dá)量在注射后6h顯著上升，之后逐步下降，至48h下降到初始水平； 而肝臟中在24h前上升較為緩慢，至48h迅速上升，達(dá)到最大值。Hu等［14］發(fā)現(xiàn)感染大菱鲆虹彩病毒（Turbot reddish body irido-virus，TRBIV）后，大菱鲆肝臟和肌肉中TLR3表達(dá)量在1d迅速上升，然后緩慢下降至第5天達(dá)到初始水平。在本實(shí)驗(yàn)中，赤眼鱒在感染GCRV后赤眼鱒肝臟、脾臟和體腎中的TLR3 mRNA的表達(dá)特征相似，整體表現(xiàn)為先上升后下降，然后小幅上升，最后回歸初始水平，在24h出現(xiàn)表達(dá)量峰值。這一結(jié)果與Phelan等［9］用SHRV感染斑馬魚(yú)成魚(yú)后TLR3的表達(dá)情況相似，與Su等［8，38］用GCRV感染稀有鮈鯽后鰓中TLR3表達(dá)特征以及GCRV感染草魚(yú)后脾臟中TLR3表達(dá)特征不同。另外，赤眼鱒在感染GCRV后，頭腎中的TLR3 mRNA表達(dá)量在12h迅速上升，在72h迅速達(dá)到第二表達(dá)峰值，這一結(jié)果較草魚(yú)和稀有鮈鯽TLR3表達(dá)變化更加快速，但是否與赤眼鱒對(duì)GCRV抗性有關(guān)需要進(jìn)一步研究證明。

4　結(jié)論

ScTLR3主要由富亮氨酸結(jié)構(gòu)域（LRRs）、跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）和Toll/白介素-1受體結(jié)構(gòu)域（TIR）組成，具有TLRs的典型結(jié)構(gòu)特征，在健康赤眼鱒肝臟中特異性表達(dá)； GCRV攻毒后，ScTLR3 mRNA在赤眼鱒肝臟、脾臟、體腎和頭腎中的表達(dá)水平顯著升高，這些結(jié)果提示TLR3在赤眼鱒抵抗GCRV入侵反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF TOLL-LIKE RECEPTOR 3 GENE IN BARBEL CHUB SQUALIOBARBUS CURRICULUS

XIAO Tiao-Yi1，2，LI Wei1，WANG Rong-Hua1，LIU Qiao-Lin1，2，PENG Hui-Zhen1，2and SU Jian-Ming1，3
（1. Hunan Engineering Technology Research Center of Featured Aquatic Resources Utilization，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China； 2. Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province，Changde 415000，China； 3. College of Animal Veterinary and Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

To investigate whether the toll-like receptor 3（ScTLR3） gene involve in antiviral immune response，TLR3 full-length cDNA in barbel chub（Squaliobarbus curriculus） was cloned and characterized with RACE technique and grass carp reovirus（GCRV） infection was used The method of real-time qPCR was used to examine the expression of ScTLR mRNA in 10 different tissues and the relative expression in liver，spleen，trunk kidney and，head kidney after infection at different times. The results showed that the full-length cDNA of ScTLR3 was 4043 bp including a 216 bp 5′-terminal untranslated region（UTR），an 1112 bp 3′-terminal untranslated region（UTR） and a 2715 bp open reading frame（ORF） encoding a polypeptide of 904 amino acid residues. The putative isoelectric point（pI） and molecular weight（Mw） of ScTLR3 were 8.76 and 102.67 kD，respectively. The ScTLR motifs were consisted of N-terminal signal peptide（SP），14 leucine-rich repeats（LRRs），transmembrane domain（TM），and the Toll/IL-1 Receptors domain（TIR） in C-terminal. ScTLR3 mRNA was expressed in all tested tissues，and its expression in liver was extremely significant higher than other tested tissues in health barbell chub（P＜0.01）. GCRV infection induced the ScTLR expression in liver，spleen，trunk kidney，and head kidney. Compared with the control group，the ScTLR mRNA expression levels in liver，spleen and trunk kidney tissues of barbel chub was induced 5-，7-，and 6- fold at 24h post infection，respectively. These results suggest that ScTLR3 may play an important role in the immune response of barbel chub against GCRV infection.

Squaliobarbus curriculus； Toll-like Receptor 3； Molecular cloning； Expression characterizations

Q781

A

1000-3207（2016）05-0894-08

10.7541/2016.115

2015-10-30；

2016-04-21

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31272652）； 國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31402289）； 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)基金項(xiàng)目（13YJ04）資助［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31272652，31402289）； Science Foundation of Hunan Agricultural University（13YJ04）］

肖調(diào)義（1964—），男，湖南邵陽(yáng)人； 教授； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。E-mail：tyx1128@163.com；李偉（1989—），男，湖南常德人； 碩士研究生； 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。E-mail：match10@qq.com

肖調(diào)義，E-mail：tyx1128@163.com