唐宇，胡超，楊嬌，范詩琪，賀福元，2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，中醫(yī)藥超分子機理與數(shù)理特征化實驗室，湖南長沙410208）

·中藥制劑與分析·

補陽還五湯提取過程中最佳提取時間和藥材粉碎度的研究

唐宇1，胡超1，楊嬌1，范詩琪1，賀福元1，2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，中醫(yī)藥超分子機理與數(shù)理特征化實驗室，湖南長沙410208）

目的研究補陽還五湯提取過程中的最佳提取時間和藥材粉碎度。方法顯微觀察不同粉碎度的補陽還五湯單味藥材，觀察藥材的破壁情況，采用HPLC分析補陽還五湯不同粉碎度藥材的成分溶出情況。結(jié)果顯微觀察從80目到100目，藥材細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)不完整，細(xì)胞壁開始破壁。提取過程的中段，不同粉碎度之間的有效成分共有峰的個數(shù)較多，溶出比較完全。在提取時間約300 min時，不同目數(shù)指紋圖譜的相似度在0.85以上。結(jié)論20目藥材在240 min時、40目藥材在180 min時、60目在120 min時、80目藥材在90 min時、100目藥材在30 min時、飲片在180 min時補陽還五湯的溶出達到基本穩(wěn)定，提取效果最佳。

補陽還五湯；提取時間；粉碎度；顯微鑒別；HPLC

中藥活性成分是中藥藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，如何使組成有效成分盡量溶出，發(fā)揮最強的藥效，是中藥復(fù)方提取動力學(xué)中需要解決的難題［1］。中藥粉碎后，藥物有效成分在胃腸道的溶解度明顯增加，從而加快藥物起效時間，提高藥物的生物利用度［2］，從而達到提高藥物溶出的目的，因此細(xì)胞破壁為中藥提取中速控的首關(guān)。本實驗以補陽還五湯為研究對象，研究了細(xì)胞的破壁情況，考察不同粉碎度的藥材粉末有效成分溶出情況，從而確定補陽還五湯提取過程中的最佳提取時間和藥材粉碎度［3］。

1　材料

補陽還五湯處方：黃芪60 g，當(dāng)歸9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，紅花9 g，地龍9 g。藥材購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)杏林藥號，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉塔斯教授鑒定為正品。乙腈、甲醇為色譜純，蒸餾水為二次重蒸餾水，乙醇等其它試劑均為分析純［4］。

高速萬能粉碎機LD-T100（上海鼎帥電器有限公司），三目熒光顯微鏡（麥克奧迪5 000 C冷CCD），載玻片，蓋玻片，酒精燈，鑷子，解剖針，不銹鋼編織篩，稀甘油，水合氯醛溶液均按中國藥典規(guī)定配置。Waters高效液相色譜儀，Breeze工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector，UV-265型紫外分光光度儀（日本島津），MA110型電子天平（上海天平儀器廠），ZK-82A型真空干燥箱（上海實驗儀器總廠），超聲波提取器（北京醫(yī)用設(shè)備廠），微量注射器（25 μL上海實驗儀器總廠），可調(diào)電爐（上海實驗儀器總廠）［5］。

2　方法與結(jié)果

2.1細(xì)粉制備

黃芪、當(dāng)歸、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍飲片分別干燥至水分含量為6%，粉碎成細(xì)粉，分別過20目，40目，60目，80目，100目篩，備用。

2.2單味藥材粉末的顯微處理

取黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、紅花、赤芍、桃仁細(xì)粉適量，置于載玻片上，蒸餾水潤濕分散，水合氯醛溶液透化裝片置于顯微鏡下觀察。黃芪顯微特征包括：木栓細(xì)胞、淀粉粒、導(dǎo)管和纖維等。川芎顯微特征包括：淀粉粒、草酸鈣晶體、木栓細(xì)胞、油室碎片、導(dǎo)管碎片、木纖維、油滴等［6］。當(dāng)歸顯微特征包括：紡錘形韌皮薄壁細(xì)胞、網(wǎng)紋導(dǎo)管、木栓細(xì)胞、油室等。地龍粉碎后大部分為干燥泥土。紅花顯微特征包括：草酸鈣方晶、花粉粒、分泌細(xì)胞、花粉囊內(nèi)壁細(xì)胞、花粉基部細(xì)胞、網(wǎng)紋細(xì)胞等。赤芍顯微特征包括：草酸鈣簇晶、網(wǎng)紋導(dǎo)管、薄壁細(xì)胞、纖維等。桃仁顯微特征大部分為油滴。

2.3HPLC測定不同粉碎度的補陽還五湯有效成分溶出情況

2.3.1飲片藥材不同時間樣品液的采集取處方量補陽還五湯飲片111 g，精密稱定，用900 mL蒸餾水回流提取，置于圓底燒瓶中，接上三口接頭，一口接溫度計，另一口接定量取樣器，另一口接冷疑管，整個裝置置可控電爐或恒溫水浴鍋中，先預(yù)熱至所測溫度，然后加入預(yù)熱的蒸餾水，馬上打開電爐加熱至滴下第一滴回流液時開始計時，分別于5、10、20、30、60、90、120、240、360、720、1 335、1 440 min，定時由取樣器取樣2 mL，并補充同樣量的蒸餾水，得到HPLC樣品。

2.3.2不同粉碎度藥材提取試驗用回流法分別提取20、40、60、80、100目的一倍處方量補陽還五湯細(xì)粉，提取方法同“2.3.1”，提取液備用。

2.3.3指紋峰的鑒定采用相對保留時間確認(rèn)指紋峰。本實驗以各標(biāo)準(zhǔn)品為參照物，相對保留時間即各指紋峰保留時間與同一圖譜中標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的比值，指紋峰相對峰面積為指紋峰峰面積與同一標(biāo)準(zhǔn)品面積的比值［7］。

2.3.4不同粉碎度補陽還五湯化學(xué)成分的溶出情況比較分別測定不同粉碎度補陽還五湯有效成分溶出的情況。根據(jù)各圖色譜峰的相對保留時間，可觀察共有峰的個數(shù)。計算色譜峰峰面積。

3　結(jié)果

3.1不同粉碎度單味中藥粉末顯微結(jié)果（40倍放大倍數(shù)）

根據(jù)顯微鑒別來觀察不同粉碎度（20～100目）補陽還五湯單味中藥的粉碎度情況，20目藥材顆粒較大，未能在顯微觀察下很好地觀察顯微結(jié)構(gòu)，故未比較20目粉碎度藥材的顯微照片。在顯微鏡下，40目和60目藥材雖然看到的只是組織碎片，但可以看到完整的細(xì)胞形態(tài)。但從80目開始到100目，顯微結(jié)構(gòu)顯凌亂和不規(guī)則，推測細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)不完整，細(xì)胞壁開始破壁。隨著目數(shù)加大，粒度越小，細(xì)胞壁破壁率增大。其中因地龍成分含有泥土、桃仁成分以油脂為主，故顯微結(jié)構(gòu)差別不明顯。

3.2補陽還五湯不同粉碎度HPLC溶出比較結(jié)果

分別取補陽還五湯提取過程的開始（5 min）、中間（360 min）和結(jié)束（1 400 min）三個時間點，比較不同粉碎度補陽還五湯的HPLC指紋圖譜，對不同粉碎度的粉末進行化學(xué)成分溶出比較，結(jié)果見圖1-3。

圖1　HPLC法測定不同粉碎度補陽還五湯5 min時有效成分溶出的比較圖

圖2　HPLC法測定不同粉碎度補陽還五湯360 min時有效成分溶出的比較圖

圖3　HPLC法測定不同粉碎度補陽還五湯1440 min時有效成分溶出的比較圖

在同一條件所得圖譜中，樣品提取至5 min，共有峰個數(shù)有16個；至提取中間時段的360 min，共有峰個數(shù)有18個；到最后截止點的1 440 min，共有峰個數(shù)有13個。在提取時間中段360 min時，共有峰個數(shù)最多，這時溶出比較完全。提取結(jié)束時共有峰個數(shù)減少，推測有效成分隨著時間的推移有發(fā)生了消除。這表明提取補陽還五湯提取時間不宜過長，否則會導(dǎo)致成分被破壞。根據(jù)圖3，比較在1 440 min時20目～100目的HPLC指紋圖譜圖形（見圖4）。

圖4　補陽還五湯不同粉碎度在1 440 min時共有峰峰面積對比圖

在同一分離條件下所得色譜圖中，選取其中分離效果較好且明顯的主要共有峰做圖，比較補陽還五湯20～100目共有峰峰面積，可以看出20～100目的圖形相似，雖然隨著粉碎度的增大，峰的面積有所增加，但峰面積相差不大。說明在補陽還五湯提取的時間后段，不同粉碎度藥材對補陽還五湯提取的差異不大。至于從何時開始不同粉碎度對提取無影響，可從補陽還五湯各提取時間點不同粉碎度溶出的相似度研究得出。

表1　補陽還五湯不同粉碎度提取時間5 min的指紋圖譜相似度結(jié)果

表2　補陽還五湯不同粉碎度提取時間10 min的指紋圖譜相似度結(jié)果

表3　補陽還五湯不同粉碎度提取時間300 min的指紋圖譜相似度結(jié)果

3.3補陽還五湯各提取時間點不同粉碎度溶出的相似度結(jié)果

在補陽還五湯提取前期的12個時間點均考察了指紋圖譜的相似度結(jié)果（見表4）。根據(jù)結(jié)果可知在提取之初，各不同粉碎度之間的相似度較低，證明不同粉碎度對補陽還五湯的提取存在影響，粉碎度越大成分溶出越快。在提取時間約300 min時，不同目數(shù)指紋圖譜的相似度基本上在0.85以上，可知在300 min左右，補陽還五湯的提取基本達到穩(wěn)定，不同藥材粉碎度對成分的提取沒有太大影響。

根據(jù)表4，選定不同粉碎度趨于穩(wěn)定的RSD值，認(rèn)為這個值即為不同粉碎度藥材的最佳提取時間?？芍?0目的藥材在240 min時、40目藥材在180 min時、60目在120 min時、80目藥材在90 min時、100目藥材在30 min、飲片在180 min時溶出達到基本穩(wěn)定，為補陽還五湯提取的最佳穩(wěn)定粒徑和時間。

表4　補陽還五湯各提取時間不同粉碎度相似度RSD結(jié)果

4　討論

中藥活性成分是中藥藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，如何使中藥有效成分盡量溶出，發(fā)揮最強的藥效，是中藥復(fù)方提取動力學(xué)中需要解決的難題。一般情況下，藥用有效成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞完整無損的狀態(tài)下，有效成分只有透過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜釋放后才能被釋放。完整的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對有效成分的釋出形成阻力，這種阻力隨細(xì)胞團內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的增多而增大［8］。對藥材進行粉碎，粉碎細(xì)胞可使細(xì)胞打碎，使中藥材細(xì)胞破壁，將細(xì)胞壁打破可使細(xì)胞膜內(nèi)的有效成分直接接觸溶媒而溶出［9］，而不再是通過細(xì)胞壁的透壁形式釋放。細(xì)胞破壁以后，胞內(nèi)有效成分可充分暴露出來，使儲存于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的有效成分直接接觸到提取用溶媒，或直接與機體受體結(jié)合，發(fā)揮治療效果［10］。

選擇藥材最佳粉碎度的時候，應(yīng)該根據(jù)提取工藝參數(shù)來選取不同粒徑藥材，粒徑過大或過小都不有利于藥材溶出。粒徑過大，穩(wěn)定的時間較長；粒徑過小，雜質(zhì)成分也同時溶出，影響有效成分溶出［11］。本實驗的結(jié)果不一定適用于中試或大型生產(chǎn)。例如在實際操作中，要想達到100目的藥材粒徑，往往費時費工加大生產(chǎn)成本。故要考慮生產(chǎn)中的最佳粒徑還需進一步根據(jù)實際情況而定。

［1］賀福元，鄧凱文，黃勝，等.總量統(tǒng)計矩標(biāo)準(zhǔn)相似度數(shù)學(xué)模型的建立及應(yīng)用研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，2013，48（9）：1453-1458.

［2］江一唱，劉云海.超微粉碎對復(fù)方中藥藥效的影響［J］.中國藥師，2011，4（9）:1352-1355.

［3］陳雪琴，劉云海.超微粉碎對單味中藥藥效的影響［J］.中南藥學(xué)，2011，9（4）:292-295.

［4］鄒歡.補陽還五湯總苷類成分提取分離過程中溶解遷移規(guī)律的研究［D］.長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

［5］賀福元，鄧凱文，劉文龍，等.左金方與黃連中小檗堿型生物堿提取動力學(xué)差異性的研究［J］.中成藥，2009，31（9）:1354-1359.

［6］張琴，劉莉.川芎超微粉的粉體學(xué)性質(zhì)研究［J］.中草藥，2010（11）:1796-1799.

［7］江歡英.魚腥草揮發(fā)油及黃連生物堿的“網(wǎng)通性”研究［D］.長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

［8］任利，李偉，聶愛國，等.當(dāng)歸超微粉和普通粉的顯微特征觀察［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，20（6）:27-28.

［9］黎冬明，劉成梅，劉偉，等.中藥細(xì)胞級粉碎及其發(fā)展趨勢［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2006（3）:46-48.

［10］侯連兵.中藥細(xì)胞級微粉碎技術(shù)在中藥藥劑中的應(yīng)用［J］.中藥材，2001，24（10）：765-766.

［11］楊巖濤，吳春英，唐宇，等.中藥多成分控緩釋制劑研究方向探索［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，8（34）：1-5.

（本文編輯蘇維）

The Research of Optimum Extraction Time and Degree of Crushing Herbs of Buyang Huanwu Decoction

TANG Yu1，HU Chao1，YANG Jiao1，F(xiàn)AN Shiqi1，HE Fuyuan1，2*
（1.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Property and Pharmacodynamic Key Laboratory of Chinese Materia Medica，State Administration of Chinese Medicine，Supramolecular Mechanism and Mathematic-Physics Characterization for Chinese Materia Medica，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

Objective To determine the optimum extraction time andparticlesizeofBuyangHuaiwuDecoction（BYHWD）.Methods The damage of different grinding degrees BYHWD cell wall was determined by microscopy and the active ingredients dissolution situation herbs broken were analyzd by HPLC.Results The microstructure of herbs at 80 mesh to 100 mesh was messy and irregular.Herbs cell structure was incomplete because of broking of cell wall.In the middle of the extraction process，the common peaks of active ingredients from different grinding degrees herbs are the most.The similarity of different fingerprints was basically above 0.85 at the extraction time of 300 min.Conclusion The dissolution of BYHWD is stable at 20 mesh/240 min，40 mesh/180min，60 mesh/120 min，80 mesh/90 min，100 mesh/30 min and decoction pieces and the extraction effect is best.

Buyang Huanwu Decocotion；extraction time；grinding degree；microscopic identification；HPLC

R284.2

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.09

2015-11-30

國家自然科學(xué)基金資助項目（81073142，81173558）。

唐宇，女，講師，博士，從事中藥提取動力學(xué)研究。

*賀福元，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:pharmsharking@tom.com。