鄧奕輝，成紹武，易亞喬，覃弘宇，李銀，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208）

解毒化瘀方對(duì)凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷ERK1/2信號(hào)通路表達(dá)的影響

鄧奕輝，成紹武，易亞喬，覃弘宇，李銀，李定祥*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的探討急性缺血性中風(fēng)（AIS）瘀毒病機(jī)的分子機(jī)制及解毒化瘀方對(duì)凝血酶合并缺氧損傷的保護(hù)作用。方法（1）用凝血酶合并缺氧損傷PC12細(xì)胞，模擬急性缺血性中風(fēng)的體外細(xì)胞模型。（2）將細(xì)胞分為空白組，模型組，解毒化瘀方含藥血漿組和PD98059組（MEK抑制劑組），應(yīng)用熒光定量實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測(cè)MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表達(dá)，應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表達(dá)。結(jié)果PCR結(jié)果提示：模型組MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.01），解毒化瘀方組和PD98059組MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表達(dá)較模型組顯著降低（P＜0.01），免疫熒光結(jié)果提示：解毒化瘀方組和PD98059組ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表達(dá)較模型組顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論解毒化瘀方以凝血酶為作用的分子靶點(diǎn)，能夠顯著降低ERK1/2信號(hào)通路在缺血性中風(fēng)體外細(xì)胞模型中的表達(dá)。

解毒化瘀方；急性缺血性中風(fēng)；凝血酶；ERK1/2信號(hào)通路；黃連解毒湯

急性缺血性中風(fēng)（acute ischemic stroke，AIS）是最常見(jiàn)腦血管疾病之一，占各類(lèi)腦中風(fēng)（stroke）的60%～80%［1］，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題。近年來(lái)，有關(guān)急性缺血性中風(fēng)的機(jī)制的主要學(xué)說(shuō)有能量耗竭、興奮性氨基酸毒性、梗死灶周邊半暗帶去極化、炎性細(xì)胞因子、鈣離子超載、一氧化氮（NO）和自由基損傷、細(xì)胞凋亡等［2-3］。本研究在總結(jié)前期研究成果和繼承傳統(tǒng)中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，提出了AIS的主要病機(jī)為與凝血酶毒性相關(guān)的瘀血阻滯、毒損腦絡(luò)，解毒化瘀法是該病有效治法的假說(shuō)，并從ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)探討解毒化瘀方神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

解毒化瘀方（藥物組成有黃連、黃芩、黃柏、梔子、紅花、川芎、赤芍和地龍，由黃連解毒湯加味而成）飲片（購(gòu)于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院）；胰蛋白酶（Sango公司）、DMEM HIGH GLUCOSE（1X）培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone試劑公司，批號(hào)NAC1362）、胎牛血清（美國(guó)HyClone試劑公司，批號(hào)NWK0489）、凝血酶（1000 U/20 mg）（中國(guó)Solarbio試劑公司批號(hào)106A069）、PD98059（Cayman產(chǎn)品，上海葉舟生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)，167869-21-8）；一抗，美國(guó)圣克魯斯公司；二抗（羊抗兔），康為世紀(jì)，貨號(hào)CW0160。

1.2細(xì)胞及動(dòng)物

PC12細(xì)胞（來(lái)源于大鼠的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，高分化，永生性，購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司，編號(hào)2015032007）；SD大鼠18只，雌雄各半，體質(zhì)量為180～200 g（購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)2015032007）。

1.3主要儀器

ABI-7300 Real-time檢測(cè)儀（美國(guó)ABI公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司，貨號(hào)#K1622），XDS-1B倒置顯微鏡（日本奧林巴斯），普通二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)賀利氏），3131三氣培養(yǎng)箱（Thermo），SP-756型紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)羅氏公司）。

2　方法

2.1凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的建立

PC12細(xì)胞以含10%胎牛血清、100 μ/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液一次，待細(xì)胞成長(zhǎng)融合后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以1×105cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.18 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后再加終濃度為50 μg/L的神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）誘導(dǎo)分化72 h后［4］，細(xì)胞神經(jīng)元特性鑒定采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法。棄原培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，分別加入0、50、100、150、200 μ/mL凝血酶10 μL和100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于三氣培養(yǎng)箱中（5%CO2、1%O2、94%N2）模擬缺氧培養(yǎng)過(guò)程，按1、6、12、24 h時(shí)間點(diǎn)依次培養(yǎng)孵育后取出。干預(yù)濃度及時(shí)間前期已通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)明確［5］。

2.2解毒化瘀方含藥血漿的制備

處方飲片置于煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材5倍量水浸泡1 h，煮沸45 min過(guò)濾，濃縮成每毫升含生藥2 g的藥液，冷卻后裝入無(wú)菌容器中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。SD大鼠9只灌服解毒化瘀方水煎液（按生藥36.6 g/kg灌胃，即成人臨床用量的5倍），每天1次，連續(xù)7 d，于末次給藥后2 h無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，取血后立即以3 000 r/min離心15 min，取上清液，組內(nèi)血漿混合后0.22 μm過(guò)濾除菌后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3解毒化瘀方含藥血漿對(duì)PC12細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度及作用時(shí)間的確定

采用MTT法測(cè)定，分為空白對(duì)照組（不含血漿），解毒化瘀方含藥血漿組（終濃度分別為1%、5%、10%、15%）。PC12細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，待貼壁分化后以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于G0期，分別加入濃度為0、1%、5%、10%、15%的含藥血漿。作用24 h后，加10 μL 5 mg/mL的MTT于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去上清加150 μL的DMSO，震蕩10 min后于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度值（OD），計(jì)算各含藥血漿抑制PC12細(xì)胞增殖的濃度（IC50）。

采用MTT法測(cè)定，分為無(wú)血漿對(duì)照組和含藥血漿組（各含藥血漿組終濃度為各含藥血漿的增殖抑制半數(shù)濃度IC50），于37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、12、24、48 h后取出，加10 μL濃度為5 mg/mL的MTT于培養(yǎng)箱中溶液培養(yǎng)4h后，吸去上清加150 μL的DMSO，震蕩10 min后于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度值（OD），以O(shè)D值反映PC12細(xì)胞的增殖活性。

2.4分組給藥及指標(biāo)檢測(cè)

將細(xì)胞置于玻璃培養(yǎng)皿中并隨機(jī)分為空白組（正常細(xì)胞組）、模型組（凝血酶150 μ/mL、在缺氧條件下作用12 h）、解毒化瘀方含藥血漿組（含藥血漿+模型細(xì)胞，簡(jiǎn)稱(chēng)血漿組）和PD98059組（MEK信號(hào)通路抑制劑+模型細(xì)胞，簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照組）。取空白組和模型組細(xì)胞，加入PBS平衡液潤(rùn)洗（加入量以剛好沒(méi)過(guò)玻片為準(zhǔn)）2次后，加入4%多聚甲醛固定15 min，進(jìn)行PCR及激光共聚焦檢測(cè)。含藥血漿組加入含10%濃度解毒化瘀方的培養(yǎng)液于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。PD98059組加入10 μL濃度為20 um的阻斷劑，培養(yǎng)2 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。平行重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。

2.4.1熒光定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)PAR-1及ERK1/2的mRNA的表達(dá)引物由Invitrogen Biotechnology CO.，LTD中國(guó)公司合成（見(jiàn)表1），按照合成單加入ddH2O，制成7.5 μmd/L溶液。RNA的提取：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度，并進(jìn)行RNA定量。PCR條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃復(fù)性45 s，60℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物分析：取PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀(guān)察條帶，數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析（ABI Prism 7300 SDS Software），各標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。

表1　引物序列和擴(kuò)增序列長(zhǎng)度

2.4.2免疫熒光法檢測(cè)ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達(dá)PC12細(xì)胞以1×104/mL接種于24孔板中，制作細(xì)胞爬片，吸取并棄上清加4%多聚甲醛固定15 min，加0.5%曲拉通作用10 min，再以牛血清蛋白封閉液封閉1 h，加一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，PBS潤(rùn)洗后加FITC羊抗兔熒光二抗（1∶100）室溫孵育30 min，潤(rùn)洗后甘油封片于激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察拍照。

2.5統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用“x±s”表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析；組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnet T3檢驗(yàn)。

3　結(jié)果

3.1解毒化瘀方含藥血漿對(duì)PC12細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度和作用時(shí)間

隨著解毒化瘀方含藥血漿濃度的增高，各組IC50均在10%～15%的范圍內(nèi)，且各組間無(wú)差異（P＞0.05），則可確定含藥血漿作用濃度為10%。在12 h時(shí)間點(diǎn)，10%濃度含藥血漿與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），24 h與48 h時(shí)均可抑制PC12的生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05）。因此，含藥血漿的作用時(shí)間為24 h。

3.2各組凝血酶原（PAR-1）、MEK1、ERK1/2的m-RNA表達(dá)熒光定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞凝血酶原（PAR-1）、MEK1、ERK1/2 mRNA表達(dá)在模型組與空白組相比顯著升高（P＜0.01），解毒化瘀方含藥血漿組的凝血酶原（PAR-1）、MEK1、ERK1/2的mRNA與模型組相比表達(dá)均降低（P＜0.01），與PD98059對(duì)照組（MEK抑制劑組）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2　各組PAR-1、MEK1、ERK1/2的mRNA表達(dá)（灰度值）（x±s，n=5）

3.3各組ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達(dá)

與無(wú)血漿空白組比較，模型組P-ERK1/2與ERK1/2顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較PD98059組和解毒化瘀方含藥血漿P-ERK1/2與ERK1/2表達(dá)明顯下降（P＜0.01），含藥血漿組與PD98059組（MEK抑制劑組）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖1-2。

表3　免疫熒光相關(guān)信號(hào)通路ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達(dá)（灰度值）（x±s，n=5）

圖1　ERK1/2蛋白表達(dá)熒光圖（×600）

圖2　P-ERK1/2蛋白表達(dá)熒光圖（×600）

4　討論

急性缺血性中風(fēng)的基本病理生理過(guò)程由腦血管阻塞和隨之發(fā)生的腦細(xì)胞損傷組成，而凝血酶在這個(gè)過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。近年來(lái)，凝血酶在AIS發(fā)生發(fā)展中的作用受到了學(xué)術(shù)界的重視［6］，凝血酶不僅是血液凝固血栓形成的關(guān)鍵水解酶，而且也通過(guò)與蛋白酶活化受體（protease-activated receptor，PAR）結(jié)合發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，因此，以凝血酶為靶點(diǎn)來(lái)研究AIS具有重要價(jià)值［7］。PAR介導(dǎo)的凝血酶反應(yīng)在腦損傷中具有雙重作用，凝血酶在低濃度時(shí)誘導(dǎo)腦耐受性，在高濃度時(shí)對(duì)腦細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)而加重對(duì)腦組織的損害，以上過(guò)程是通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路是一條可以被多種因素廣泛激活的有絲分裂原活化蛋白激酶通路。MAPK具有誘導(dǎo)ERK磷酸化的作用，ERK1/2磷酸化可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，但持續(xù)的磷酸化能導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［8］。PD98059為ERK上游激酶MEK1特異性阻斷劑，能夠阻斷ERK1/2信號(hào)通路的傳導(dǎo)，可消除凝血酶誘導(dǎo)的ERK1/2激活作用，阻斷凝血酶誘導(dǎo)的腦耐受；在體外用凝血酶處理也能活化ERK1/2，而用PD98059可以完全阻斷用凝血酶預(yù)處理后的細(xì)胞保護(hù)作用［9］。

中醫(yī)認(rèn)為，缺血性中風(fēng)多是在內(nèi)傷積損的基礎(chǔ)上，復(fù)因勞逸失度、情志不遂、飲酒飽食或外邪侵襲等觸發(fā)，引起臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂。病理因素多為風(fēng)、火、痰、氣、瘀［10］。王永炎院士［11］認(rèn)為本病為毒損腦絡(luò)，導(dǎo)致腦絡(luò)破損，經(jīng)絡(luò)、氣血瘀滯不通，腦脈、神機(jī)失養(yǎng)，而出現(xiàn)神昏、肢體麻木、言語(yǔ)不利、半身不遂等癥狀。從臨床發(fā)病特點(diǎn)看，缺血性中風(fēng)可分為兩個(gè)階段，第一階段發(fā)生在腦脈閉阻前，該階段時(shí)程較長(zhǎng)，是缺血性中風(fēng)發(fā)病的基礎(chǔ)。由于人體正氣逐漸虧虛，而痰濁、瘀血等多種致病因素也因之緩慢形成，當(dāng)正虛邪實(shí)達(dá)到一定程度后，在誘因的作用下導(dǎo)致臟腑陰陽(yáng)失調(diào)、氣血逆亂而致腦脈閉阻。第二個(gè)階段發(fā)生在腦脈閉阻后，這個(gè)階段時(shí)程較短，病情變化迅速。腦脈閉阻，腦髓失養(yǎng)，進(jìn)而毒邪內(nèi)生，損絡(luò)傷髓，神明失養(yǎng)。腦脈閉阻多責(zé)之于瘀，絡(luò)損髓傷、神明失養(yǎng)多責(zé)之于毒，因此可以認(rèn)為AIS的基本病機(jī)為瘀血阻滯、毒損腦絡(luò)，臨床治療當(dāng)以化瘀解毒為法。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凝血酶合并缺氧PC12細(xì)胞的MEK1、PAR1和ERK1/2的mRNA表達(dá)明顯升高，而采用解毒化瘀方含藥血漿干預(yù)后能明顯降低細(xì)胞MEK1、PAR1和ERK1/2的mRNA表達(dá)，含藥血漿組和PD98059阻斷劑組下降程度相當(dāng)，表明解毒化瘀方能干預(yù)ERK信號(hào)通路的傳導(dǎo)并有效降低凝血酶原的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果表明，凝血酶合并缺氧可以使P-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達(dá)上調(diào)，加重細(xì)胞的損傷。解毒化瘀方含藥血漿和PD98059均可減少P-ERK1/2和ERK1/2的蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

我們可以推論ERK1/2信號(hào)通路參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，是急性缺血性中風(fēng)的一條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。而凝血酶原很可能是其作用的有效靶點(diǎn)。通過(guò)阻斷信號(hào)通路可以有效的降低細(xì)胞損傷。綜上所述，解毒化瘀方對(duì)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，可為臨床上對(duì)急性缺血性中風(fēng)的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)，腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫(xiě)組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010［J］.中國(guó)全科醫(yī)生，2011，14（12B）：4013-4017

［2］Brouns R，De Devn PP.The complexity of neurobiological processes in acute ischemic stroke［J］.Clin Neurol Neurisurg，2009，111（6）：483-495.

［3］McColl BW，Allan SM，Rothwell NJ.Systemic infection，inflammation and acute ischemic stroke［J］.Neuroscience，2009，158（3）:1049-1061.

［4］覃弘宇，李銀，李定祥等.基于凝血酶合并缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的模型研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（27）：597-600

［5］Bo C，Beth F，Michael AW，et al.Thrombin Activity Associated with Neuronal Damage during Acute Focal Ischemia［J］.J Neuroscience，2012，32（22）:7622-7631.

［6］Bo C，Beth F，Michael AW，et al.Thrombin Activity Associated with Neuronal Damage during Acute Focal Ischemia［J］.J Neuroscience，2012，32（22）:7622-7631.

［7］Bo C.Thrombin in Ischemic Stroke Targeting.Translational Stroke Research［M］.Springer New York，2012:189-204.

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［11］李澎濤，王永炎，黃啟福.“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說(shuō)的形成及其理論與實(shí)踐意義［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（1）：1-6.

（本文編輯楊瑛）

Effect of Jiedu Huayu Fang on the Expression of ERK1/2 Signaling Pathway in PC12 Cells Injuried by Thrombin and HyPoxia

DENG Yihui，CHENG Shaowu，YI Yaqiao，QIN Hongyu，LI Yin，LI Dingxiang*
（Hunan Provincial Key Laboratory of Prevention and Treatment of Cardio-cerebral Diseases by Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，the Key Laboratory of Cell Biology and Molecular Technology，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

Objective To investigate the molecular mechanism of cerebral vascular occlusion and the mechanism of brain cell damage induced by acute ischemic stroke（AIS）and the protective effect of Jiedu Huayu Fang.Methods（1）PC12 cells were used to establish acute ischemic stroke in vitro.（2）The cells were divided into blank group，model group，Jiedu Huayu Fang serum group and PD98059 group（MEK inhibitor group）.The mRNA expression of MEK1，PAR-1 and ERK1/2 was detected by Real-time PCR，and the protein expression of P-ERK1/2 and ERK1/2 was detected by immunofluorescence assay.Results PCR results indicated that the expression of MEK1，PAR-1 and ERK1/2 mRNA in the model group was significantly higher than that in the blank control group（P＜0.01）.The MEK1，PAR-1 and ERK1/2 mRNA expression in Jiedu Huayu Fang group and PD98059 group was much lower than that of model group（P＜0.01）.Immunofluorescence results show that:the ERK1/2，p-ERK1/2 protein expression of JieDuHuaYuFang group and PD98059 group was much lower than that of model group（P＜0.01）.ConclusionJiedu Huayu Fang，as the molecular targets of thrombin，can significantly reduce the expression of ERK1/2 signaling pathway in acute ischemic stroke.

Jiedu Huayu Fang；acute ischemic stroke；thrombin；ERK1/2 signaling pathway；Huanglian Jiedu Decoction

R285.5；R255.2

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.005

2016-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373508）；湖南省自然科學(xué)基金（14JJ2113）；湖南省教育廳項(xiàng)目（16K063）；湖南省中醫(yī)藥科研基金（201606）；中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)湖南省重點(diǎn)學(xué)科資助。

鄧奕輝，女，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病血管并發(fā)癥。

*李定祥，男，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：ldxlzy@hotmail.com。