劉西霞，黃政德，盧芳國(guó)，高強(qiáng)，賴娟，蘆俊，向琴，劉水平*，楊勝輝*

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410013；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；3.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410219）

·血瘀證治·

抗纖靈Ⅰ方對(duì)小鼠血吸蟲病肝纖維化的干預(yù)及機(jī)制探討

劉西霞1，3，黃政德2，盧芳國(guó)2，高強(qiáng)2，賴娟2，蘆俊2，向琴2，劉水平1*，楊勝輝2*

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410013；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；3.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙410219）

目的觀察抗纖靈Ⅰ方對(duì)小鼠血吸蟲病肝纖維化的干預(yù)效果，探討抗纖靈Ⅰ方干預(yù)血吸蟲肝纖維化的可能分子機(jī)制，為抗纖靈Ⅰ方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法采用日本血吸蟲尾蚴經(jīng)皮膚貼片感染昆明小鼠，建立血吸蟲病早期肝纖維化動(dòng)物模型，將建模成功的小鼠用吡喹酮藥物連續(xù)殺蟲治療后分為抗纖靈Ⅰ方低、中、高劑量組，抗纖靈Ⅰ方的丹參加味方低、中、高劑量組，秋水仙素治療對(duì)照組，蒸餾水灌胃對(duì)照組和未做任何處理的模型對(duì)照9組。以未感染血吸蟲的正常小鼠為肝纖維化陰性對(duì)照組。各實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌胃治療8周，收集各組小鼠肝臟，HE染色觀察肝纖維化病理改變，測(cè)量肝組織蟲卵肉芽腫平均面積；免疫組化染色方法檢測(cè)肝組織內(nèi)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、MMP-1蛋白酶以及TIMP-1蛋白的表達(dá)，比較各組間的蛋白表達(dá)差異。結(jié)果HE染色顯示，與模型組和正常對(duì)照組相比抗纖靈Ⅰ方及其丹參加味方高劑量組可顯著減少肝組織蟲卵肉芽腫面積（P＜0.05）；免疫組化染色結(jié)果顯示，與模型組比較，抗纖靈Ⅰ方及其丹參加味方中、高劑量組干預(yù)后小鼠肝組織內(nèi)的膠原Ⅰ、Ⅲ蛋白以及TIMP-1蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05）、MMP-1蛋白酶表達(dá)顯著增加（P＜0.05），但抗纖靈Ⅰ方與丹參加味方之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論抗纖靈Ⅰ方及其丹參加味方對(duì)小鼠血吸蟲病肝纖維化具有較好的干預(yù)效果，但兩者在療效上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，丹參未能增強(qiáng)抗纖靈Ⅰ方的干預(yù)肝纖維化效果；抗纖靈Ⅰ方的干預(yù)機(jī)制可能是通過抑制肝組織內(nèi)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表達(dá)，增加MMP-1蛋白酶的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。

抗纖靈Ⅰ方；血吸蟲?。桓卫w維化；膠原蛋白Ⅰ；膠原蛋白Ⅲ；MMP-1蛋白酶；TIMP蛋白；丹參

日本血吸蟲是我國(guó)長(zhǎng)江流域廣泛流行的一種傳染病，可導(dǎo)致急性、慢性和晚期血吸蟲?。?］。日本血吸蟲蟲卵的危害最為嚴(yán)重，蟲卵在肝臟門靜脈分支內(nèi)沉積形成蟲卵肉芽腫，在此基礎(chǔ)上發(fā)生肝纖維化和肝硬化，導(dǎo)致肝脾腫大、門靜脈高壓、上消化道大出血等一系列臨床綜合征，嚴(yán)重者可因?yàn)楦喂δ芩ソ?、肝昏迷而死亡，?duì)人類的健康危害極大。因而，積極預(yù)防和治療蟲卵所引起的肝纖維化和肝硬化對(duì)慢性血吸蟲病患者具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，血吸蟲病肝纖維化是機(jī)體對(duì)大量蟲卵在肝臟匯管區(qū)沉積所引起的慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，大量報(bào)道證實(shí)，肝纖維化以及肝硬化形成與肝星形細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化關(guān)系密切［2-4］，HSC被激活后能夠分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分，包括膠原蛋白、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）、纖維連接蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs）。其中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量是反映肝纖維化程度的敏感指標(biāo)。MMPs是一組能降解各種ECM成分的蛋白質(zhì)分解酶，其中MMP-1的活性最強(qiáng)，能夠分解各種膠原蛋白。TIMPs是一組抑制MMPs功能的活性多肽，其中TIMP-1可通過抑制MMP-1酶的活性來(lái)阻止膠原蛋白的降解，對(duì)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用?？估w靈Ⅰ方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)郭振球教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，能夠明顯緩解血吸蟲病肝纖維化常見的癥狀，降低血清透明質(zhì)酸和血清羥脯氨酸的水平，增強(qiáng)血漿纖溶酶的活性來(lái)發(fā)揮修復(fù)肝臟病損的組織［4］。但其對(duì)肝組織中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、TIMP-1和MMP-1的表達(dá)是否產(chǎn)生影響尚不明確。本研究通過觀察抗纖靈Ⅰ方及其丹參加味方在防治血吸蟲病肝纖維化中的作用及療效，以膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、TIMP-1和MMP-1等為靶點(diǎn)，通過其表達(dá)的變化來(lái)探討該方的可能分子作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與釘螺

昆明小鼠購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0012，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各54只。中國(guó)大陸株日本血吸蟲尾蚴陽(yáng)性釘螺購(gòu)自湖南省血吸蟲病防治所。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

抗纖靈Ⅰ方由黃芪、防己、茯苓、鱉甲、赤芍、桃仁、莪術(shù)、牛膝、當(dāng)歸9味中藥組成，抗纖靈Ⅰ方的丹參加味方系在抗纖靈Ⅰ方的基礎(chǔ)上加30 g丹參組方而成。以上中藥飲片均購(gòu)自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，加入蒸餾水煎煮后濃縮成含生藥1.0 g/mL的水煎液，經(jīng)高壓滅菌后4℃冰箱備用。秋水仙素購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司，為分析純產(chǎn)品，批號(hào)：505A0314。吡喹酮片購(gòu)自于南京制藥有限公司，0.2 g/片，批號(hào)：20120919。

1.3主要試劑

蘇木素-伊紅（HE）染色劑、兔抗大鼠/小鼠膠原Ⅰ、Ⅲ、MMP-1和TIMP-1多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、兔抗小鼠/大鼠GAPDH多克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自于武漢博士德生物工程有限公司；RIPA裂解液（強(qiáng)）、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜購(gòu)自于南京碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4主要儀器

酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Teck公司；美國(guó)Leica切片機(jī)；病理圖像分析系統(tǒng)，麥克奧迪（廈門）醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司；低溫超速離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；mini垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-rad公司。

1.5造模、分組及給藥

采用日本血吸蟲尾蚴敷貼法感染113只昆明小鼠，（10±2）條尾蚴/鼠，6周后隨機(jī)處死5只感染組小鼠，以正常未感染組作為對(duì)照，HE染色顯微鏡鏡下觀察蟲卵肉芽腫和肝纖維化情況，確定造模是否成功。將造模成功的108只肝纖維化模型小鼠均采用吡喹酮藥物灌胃300 mg/（kg·d）徹底殺蟲治療，連續(xù)治療2天，然后將小鼠隨機(jī)分成抗纖靈Ⅰ方低劑量組10.237 g/（kg·d）、中劑量組20.475 g/（kg·d）、高劑量組40.95 g/（kg·d）、丹參加味方低劑量組12.512 g/（kg·d）、中劑量組（25.025 g/kg·d）、高劑量組50.05 g/（kg·d）、秋水仙素治療組0.2 mg/（kg·d）、蒸餾水灌胃對(duì)照組0.4 mL/（只·d）以及未進(jìn)行任何治療的模型對(duì)照組等9組，同時(shí)以未感染血吸蟲的小鼠作為肝纖維化陰性的正常對(duì)照組，每組小鼠數(shù)為12只。除模型對(duì)照組和正常對(duì)照組之外，各試驗(yàn)組連續(xù)灌胃8周，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，無(wú)小鼠死亡。參照體表面積計(jì)算法，小鼠灌胃藥物的起始低劑量相當(dāng)于臨床劑量的0.5倍。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠肝臟病理改變情況收集小鼠左肝中葉相同部位置10%中性甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、染色和蘇木素復(fù)染封片后高倍鏡下（×400）觀察小鼠肝臟病理改變。1.6.2肝組織中蟲卵肉芽腫平均面積的檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織切片經(jīng)HE染色后，在低倍鏡下每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，以麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)6.0軟件測(cè)量肝組織中蟲卵肉芽腫的平均面積。蟲卵肉芽腫平均面積=每張切片5個(gè)視野中所有肉芽腫面積總和/5個(gè)視野中所有肉芽腫數(shù)量。

1.6.3免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、MMP-1酶和TIMP-1蛋白表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各試驗(yàn)組小鼠的左肝中葉相同部位經(jīng)10%中性甲醛，4℃固定過夜。經(jīng)梯度酒精脫水后再行石蠟包埋、切片、貼片等處理，用0.3%TritonX-100和3% H2O2在37℃孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。80℃水浴修復(fù)抗原。加入正常山羊血清工作液封閉后，分別加入兔抗小鼠/大鼠膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、MMP-1和TIMP-1多克隆抗體（1∶400稀釋），4℃冰箱過夜后，洗滌后滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，PBS洗滌后加入0.05%DAB顯色液室溫顯色，以蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，封片鏡檢。每次試驗(yàn)以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，免疫組化染色以肝細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，每個(gè)樣本高倍鏡下隨機(jī)采集5個(gè)視野照片，利用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)6.0軟件計(jì)算平均光密度值，以“x±s”表示，比較各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的蛋白表達(dá)差異。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組掃描數(shù)據(jù)均作為計(jì)量資料，以“x±s”表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組之間的差異比較采用單因素方差分析方法；如方差齊性時(shí)則選用LSD法，當(dāng)方差不齊時(shí)則采用Tamhane's T2檢驗(yàn)法，所有結(jié)果均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各試驗(yàn)組小鼠肝臟病理改變情況

感染6周后顯微鏡下可見：正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)肝細(xì)胞變性和壞死現(xiàn)象（圖1-A）。模型組小鼠肝臟匯管區(qū)可見多個(gè)血吸蟲蟲卵及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞有不同程度變性和壞死，肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞（圖1-C）。抗纖靈Ⅰ方及丹參加味方治療8周后鏡下可見：正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列規(guī)則，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞變性、壞死等病變（圖1-B）；蒸餾水灌胃組和模型組小鼠肝臟匯管區(qū)有較多蟲卵肉芽腫形成，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞有不同程度變性和壞死，肝細(xì)胞排列紊亂（圖1-H、I）?？估w靈Ⅰ方和丹參加味方干預(yù)后，低劑量治療組鏡下可見匯管區(qū)仍有較多的慢性蟲卵肉芽腫，蟲卵周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞有不同程度變性和壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞（圖1-D，J）；中劑量（圖1-E，K）和高劑量組（圖1-F，L）慢性肉芽腫明顯減弱，蟲卵周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肝細(xì)胞變性和壞死明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。

2.2抗纖靈Ⅰ方及丹參加方治療后小鼠肝組織蟲卵肉芽腫面積的改變情況

圖1　小鼠肝臟病理改變光鏡圖（HE×400）

日本血吸蟲尾蚴感染小鼠后，肝組織內(nèi)可見大量的蟲卵在匯管區(qū)沉積，經(jīng)抗纖靈Ⅰ方及丹參加味方高劑量組干預(yù)后，小鼠肝組織中蟲卵肉芽腫平均面積顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，參見表1），表明抗纖靈Ⅰ方及丹參加味方能夠殺滅部分血吸蟲蟲卵，抑制蟲卵釋放抗原，降低和減輕肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的反應(yīng)程度，但兩方之間無(wú)差異（P＞0.05，參見表1）。

表1　抗纖靈Ⅰ方與其丹參加味方對(duì)日本血吸蟲病小鼠肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫平均面積的影響（±s，n=12）

表1　抗纖靈Ⅰ方與其丹參加味方對(duì)日本血吸蟲病小鼠肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫平均面積的影響（±s，n=12）

注：與模型組比，#P＜0.05；與秋水仙素組比，△P＜0.05。

組別劑量（g/kg）F值P值正常對(duì)照組模型組蒸餾水對(duì)照組抗纖靈Ⅰ方低劑量組抗纖靈Ⅰ方中劑量組抗纖靈Ⅰ方高劑量組丹參加味方低劑量組丹參加味方中劑量組丹參加味方高劑量組秋水仙素組---10.237 20.475 40.950 12.512 25.025 50.050 0.0002平均肉芽腫面積（×105μm2）-16.98±4.55 17.62±5.13 16.15±4.36△15.78±4.29△12.65±2.86#15.64±4.17△14.88±3.57△11.96±2.35#12.14±2.72#4.143 3.895 4.245 3.245 3.367 4.351 4.225 0.006 0.009 0.005 0.014 0.012 0.003 0.004

2.3免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、TIMP-1蛋白和MMP-1蛋白酶的表達(dá)

2.3.1小鼠肝組織膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表達(dá)差異從圖2、3、4可見，正常對(duì)照組小鼠肝臟膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表達(dá)很弱，主要分布于匯管區(qū)及中央小靜脈管壁上（圖2，3，4-A）。模型組（圖2，3，4-E）和蒸餾水空白組（圖2，3，4-J）可見深棕褐色強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，主要位于肝竇周圍、匯管區(qū)內(nèi)及蟲卵肉芽腫周圍。與模型組比較，抗纖靈Ⅰ方與丹參加味方低劑量治療組（圖3，4，5-B、G）的膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表達(dá)減弱，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，參見表2）；中劑量（圖2，3，4-C，H）與高劑量組（圖2，3，4-D，I）的表達(dá)顯著減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，參見表2），提示兩方對(duì)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表達(dá)有明顯抑制作用，并存在劑量依賴性；抗纖靈Ⅰ方與丹參加味方低劑量組、中劑量組與秋水仙素治療組（圖2，3，4-F）相比有顯著性差異（P＜0.05，參見表2），但高劑量組與秋水仙素治療組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），提示兩方的低劑量與中劑量治療組療效不及秋水仙素治療組，但高劑量組療效與其相近；結(jié)果還顯示，抗纖靈Ⅰ方與丹參加味方之間在抑制膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ和TIMP-1蛋白的表達(dá)方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，見表2）。

2.3.2小鼠肝組織MMP-1蛋白酶的表達(dá)差異從圖5可見，正常對(duì)照組小鼠肝臟（圖5-A）和秋水仙素治療組（圖5-F）可見MMP-1蛋白酶的陽(yáng)性褐色表達(dá)主要分布于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、肝竇周圍以及匯管區(qū)。模型組（圖5-E）和蒸餾水空白組（圖5-J）可見少量微弱表達(dá)。抗纖靈Ⅰ方及丹參加味方各劑量治療組MMP-1酶陽(yáng)性表達(dá)主要位于肝竇周圍、匯管區(qū)和蟲卵肉芽腫周圍（圖5-B、G；C、H；D、I）；與模型組相比，抗纖靈Ⅰ方與丹參加味方中（圖5-C，H）、高劑量（圖5-D，I）治療組MMP-1蛋白酶表達(dá)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，參見表2），提示兩方對(duì)血吸蟲病肝纖維化小鼠肝組織中MMP-1蛋白酶的表達(dá)有促進(jìn)作用，并存在劑量依賴性；抗纖靈Ⅰ方與丹參加味方低劑量組（圖5-B，G）、中劑量組與秋水仙素組（圖5-F）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但高劑量組與秋水仙素組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示兩方的低劑量和中劑量組療效不及秋水仙素治療組，但高劑量組與其療效相近。結(jié)果還顯示，抗纖靈Ⅰ方與丹參加味方之間在促進(jìn)肝組織內(nèi)MMP-1酶的表達(dá)上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，參見表2）。

圖2　免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織中膠原Ⅰ蛋白表達(dá)（×400）

圖3　免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織中膠原Ⅲ蛋白表達(dá)（×400）

圖4　免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織中TIMP-1蛋白酶表達(dá)（×400）

圖5　免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織中MMP-1蛋白酶表達(dá)（×400）

表2　抗纖靈Ⅰ方及丹參加味方對(duì)血吸蟲病小鼠肝組織膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ、MMP-1以及TIMP-1表達(dá)的影響（平均光密度，x±s，n=12）

3　討論

郭振球教授認(rèn)為，血吸蟲病肝纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“蠱脹”、“蠱病”的范疇，致病因素為“蠱毒”，發(fā)病機(jī)制則多因蟲積、氣滯、血瘀、水濕、氣虛等而致氣血失和、氣血逆亂；其病變主要涉及肝脾兩臟，蟲邪蠱毒隨血流侵入肝，導(dǎo)致肝臟脈絡(luò)瘀阻，肝氣失和，經(jīng)隧不利，氣滯而血瘀；久則肝病傳脾，因?qū)嵍绿摗Ｒ蚨x病肝纖維化以氣滯血瘀和氣虛血瘀兩證多見，其氣虛血瘀證，病重在脾，氣虛為主，脾虛夾濕，兼有肝瘀?？估w靈Ⅰ方（主要由黃芪、茯苓、防己、赤芍、桃仁、鱉甲、莪術(shù)等組成）具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、益氣健脾、行氣利水之效，是郭教授臨床工作中治療血吸蟲病肝纖維化的經(jīng)驗(yàn)方，方中的黃芪、茯苓、防己等藥益氣扶正、健脾化濕，具有保護(hù)肝細(xì)胞，促進(jìn)肝功能恢復(fù)的功效；莪術(shù)、赤芍、牛膝等藥活血行血，改善門靜脈血流及肝微循環(huán)，因而常用于氣滯血瘀證，病重在肝，血瘀為主，肝臟氣血運(yùn)行不暢。多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)本方對(duì)血吸蟲病肝纖維化患者的脅下疼痛、脅腹痞塊、面暗唇青、脘腹竄痛、胃納呆滯、大便稀溏、面色萎黃等癥狀的總有效緩解率達(dá)到93.9%［5］，明顯緩解患者的臨床癥狀，減輕和逆轉(zhuǎn)患者的肝纖維化程度。但該方的抗肝纖維化作用的分子機(jī)制一直不明確，療效也有待進(jìn)一步提高。為增強(qiáng)該方的活血化瘀療效，進(jìn)一步觀察其抗血吸蟲病肝纖維化效果，闡明其抗肝纖維化作用的分子機(jī)理，本研究團(tuán)隊(duì)在抗纖靈Ⅰ方的基礎(chǔ)上加味丹參，組成抗纖靈Ⅰ方的丹參加味方。大量研究證實(shí)，丹參具有很好的祛瘀和活血效果，可以抗血小板聚集、阻止血栓形成以及增強(qiáng)纖維蛋白的降解，也可顯著降低血液黏度，減少紅細(xì)胞的聚集，增加血液流速，擴(kuò)張毛細(xì)血管，改善機(jī)體組織局部的微循環(huán)狀況，增加各內(nèi)臟器官的血流量等［6］?？估w靈Ⅰ方及其丹參加味方持續(xù)灌胃治療血吸蟲病肝纖維化小鼠模型8周后，兩方的高劑量組可以顯著減少小鼠肝組織中蟲卵肉芽腫平均面積，表明抗纖靈Ⅰ方及其丹參加味方能夠降低肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的反應(yīng)程度，但兩方之間無(wú)差異。免疫組化試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，兩方能夠明顯逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)展，小鼠肝組織中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的合成顯著減少，表達(dá)明顯減輕；MMP-1蛋白酶的表達(dá)明顯增強(qiáng)，增強(qiáng)了對(duì)膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的分解，減少了兩種與肝纖維化發(fā)病至關(guān)重要的膠原蛋白在肝組織內(nèi)的沉積；同時(shí)TIMP-1蛋白分泌明顯減少，減輕了對(duì)MMP-1蛋白酶活性的抑制作用，間接增強(qiáng)了MMP-1蛋白酶的活性，進(jìn)一步減少膠原蛋白在肝組織中的沉積，對(duì)肝纖維化的進(jìn)展有明顯的逆轉(zhuǎn)作用。本研究團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了抗纖靈Ⅰ方及其丹參加味方可從多途徑、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)等方面干預(yù)和逆轉(zhuǎn)血吸蟲病肝纖維化的進(jìn)展，其逆轉(zhuǎn)肝纖維化的分子機(jī)制主要為抑制TIMP-1蛋白的合成與表達(dá)，促進(jìn)MMP-1蛋白酶的分泌，降解肝組織炎癥部位的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ等。同時(shí)，本研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)兩方的高劑量組對(duì)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)作用明顯強(qiáng)于低劑量組和中劑量組，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，其干預(yù)和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的效果與西藥治療肝纖維化的秋水仙素藥物之間無(wú)明顯差異。但抗纖靈Ⅰ方與其丹參加味方之間在干預(yù)效果方面未見顯著性差異，分析其原因可能與下述因素有關(guān)：抗纖靈Ⅰ方中已有活血化瘀的莪術(shù)、赤芍、牛膝等幾味中藥，再加味具有活血化瘀療效的丹參后可能對(duì)原方各藥之間的君臣佐使關(guān)系產(chǎn)生影響，并不能單純產(chǎn)生藥物的疊加效應(yīng)。閻小女等［7］研究也顯示，丹參與黃芪進(jìn)行配伍干預(yù)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化研究中，丹參與黃芪配伍與單用黃芪或單用丹參之間無(wú)顯著性差異，與本研究團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果一致。其具體的原因有待于進(jìn)一步的研究與分析。

綜上所述，本研究進(jìn)一步明確和證實(shí)抗纖靈Ⅰ方具有防治血吸蟲病肝纖維化的作用，其分子機(jī)制主要是通過抑制肝組織膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ的沉積，抑制TIMP-1蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)MMP-1蛋白酶的合成發(fā)揮作用。

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［3］郭曉霞，李良學(xué)，武玉鵬.調(diào)肝理脾方對(duì)原發(fā)性膽汁性肝硬化小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及肝組織病理的影響［J］.中醫(yī)雜志，2016，57（2）：161-165.

［4］于曉紅，金博.肝纖維化發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（l4）:2155-2158

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（本文編輯李杰）

The Intervention Effects and Mechanisms of KangXianLing PrescriptionⅠon Schistosomiasis Liver Fibrosis in Mice

LIU Xixia1，3，HUANG Zhengde2，LU Fangguo2，GAO Qiang2，LAI Juan2，LU Jun2，XIANG Qin2，LIU Shuiping1*，YANG Shenghui2*
（1.Department of Medical Microbiology，Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha，Hunan 410013，China；2.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；3.Department of Medical Microbiology and Immunology，Changsha Medical University，Changsha，Hunan 410219，China）

Objective To explore the intervention effects of KangXianLing prescriptionⅠ（KXLPI）on schistosomiasis liver fibrosis in mice，elucidate the possible molecular mechanisms of KXLPⅠanti hepatic fibrosis，and provide experimental basis for clinical application of KXLPⅠ.Methods Kunming mice were infected by Sj cercariae in order to establish the animal model with hepatic fibrosis.All the model mice withhepatic fibrosis were treated by praziquantel（PZQ）and randomly divided into 9 groups，including KXLPⅠlow dose group（L-KXLPⅠ），medium dose group（M-KXLPⅠ）and high dose group（H-KXLP I），KXLPⅠ's modified prescription based on Salvia miltiorrhiza（KXLPⅠ-Sm）low dose group（L-KXLPⅠ-Sm），medium dose group（M-KXLPⅠ-Sm）and high dose group（H-KXLPⅠ-Sm），Colchicin treatment group（CTG），distilled water group（DWG）and model group（MG），and the mice which were not infected by Sj cercariae are used as normal control group（NG）.After intragastric administration for 8 weeks，the livers of the mice were collected and the pathologic changes of hepatic fibrosis were observed by HE.The mean granuloma areas induced by eggs were detected，and pathological changes of hepatic fibrosis wereobserved.TheexpressionlevelsofcollagenⅠ，Ⅲ，matrix-metalloproteinase-1（MMP-1）andtissueinhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1）were detected by immunohistochemical staining，the differences of proteins were compared. Results Compared with MG and NG，the mean granuloma areas in H-KXLPⅠand H-KXLPⅠ-Sm significantly decreased，（P＜0.05）.Immunohistochemical staining results showed that the expression levels of collagenⅠ，Ⅲand TIMP-1 inMKXLPⅠ，H-KXLPⅠ，M-KXLPⅠ-Sm and H-KXLPⅠ-Smweresignificantly lower than that ofMD group（P＜0.05），while the expression levels of MMP-1 significantly higher than that of MD（P＜0.05），there is no difference betweenKXLPⅠand KXLPⅠ-Sm groups（P＞0.05）.Conclusion KXLPⅠand KXLPⅠ-Sm showed good preventive effects on experimental schistosomiasis liver fibrosis mice，but there was no difference on curative effect，and Salvia miltiorrhiza could not enhance the effect of KXLPⅠanti hepatic fibrosis.Meanwhile，KXLPⅠcould inhibit the expressions of collagenⅠ，Ⅲand TIMP-1 in liver tissues and increase the expression of MMP-1.

KangXianLing Prescription I；schistosomiasis；hepatic fibrosis；collagenⅠ；collagenⅢ；matrix-metal loproteinase-1；tissue inhibitor of metalloproteinase-1；Salvia miltiorrhiza

R285.5；R383.2+4；R2-031

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.004

2016-05-11

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81373576）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11JJ3106）；湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)項(xiàng)目（201209）；湖南省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目（B2014-043）；湖南省高校感染性疾病中醫(yī)藥防治研究科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)開放基金項(xiàng)目（Grxjb-3）；湖南省教育廳基金項(xiàng)目（15C0147）。

劉西霞，女，在讀碩士研究生，從事感染性疾病中醫(yī)藥防治研究。

*劉水平，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：spliu@csu.edu.cn；楊勝輝，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：shenghuiyang@126.com。