唐力瓊，李英*，羅銀河*，王孟清，舒蘭，譚維，龔細(xì)妹，陶洪，彭昕欣

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

咳喘寧對RSV誘發(fā)哮喘大鼠ICAM-1表達(dá)的影響

唐力瓊1，李英2*，羅銀河2*，王孟清2，舒蘭2，譚維1，龔細(xì)妹1，陶洪2，彭昕欣2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

目的研究咳喘寧對RSV誘發(fā)哮喘大鼠氣道重塑形態(tài)學(xué)及ICAM-1表達(dá)的影響，闡明其防治哮喘的作用機(jī)制。方法將60只幼年SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組，即正常組，模型組，潑尼松與沙丁胺醇治療組（簡稱潑+沙治療組），咳喘寧大、中、小劑量組，每組10只。用卵清蛋白復(fù)制大鼠哮喘模型，并予呼吸道合胞病毒（RSV）激發(fā)哮喘。大鼠處死后肺組織行HE染色觀察炎癥反應(yīng)；圖像分析軟件測定支氣管壁厚度及氣道壁面積；免疫組化pv-9000二步法檢測ICAM-1表達(dá)水平。結(jié)果與模型組相比，各治療組炎癥反應(yīng)較輕。各治療組支氣管壁厚度及氣道壁面積改變較小，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；咳喘寧中劑量組較潑+沙治療組作用略差，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；咳喘寧大、小劑量組與潑+沙治療組相比，其作用明顯較差，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各治療組與模型組比較，其肺組織中ICAM-1表達(dá)均降低，有顯著性差異（P＜0.01）；潑+沙治療組ICAM-1表達(dá)稍低于咳喘寧中劑量組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論咳喘寧可有效抑制氣道重塑，其機(jī)制可能與降低肺組織中ICAM-1表達(dá)有關(guān)。

哮喘；咳喘寧；氣道重塑；RSV；ICAM-1；五虎湯；大青葉；黃芪；桃仁

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是小兒常見的呼吸道疾病，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢。其中85%的兒童哮喘急性發(fā)作與病毒感染有關(guān)［1］，且呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染所致者可高達(dá)78.49%［2］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）是多種病毒的受體［3］，ICAM-1上調(diào)能增加炎癥的易感性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞通過血液進(jìn)入炎癥部位，通過促進(jìn)炎癥因子的黏附和遷移作用介導(dǎo)過敏部位的炎癥反應(yīng)［4］，從而促進(jìn)氣道炎癥與氣道高反應(yīng)性。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個主要病理學(xué)特征。為此，本實(shí)驗(yàn)研究了咳喘寧對哮喘大鼠氣道重塑形態(tài)學(xué)及ICAM-1表達(dá)的影響，觀察咳喘寧對哮喘氣道重塑的直觀效果，闡明其防治哮喘的可能機(jī)制。

1　材料

1.1動物

幼年SD雄性大鼠，體質(zhì)量120～150 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：4300470011386。

1.2主要試劑與藥物

咳喘寧口服液（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，生藥含量0.5 g/mL）；卵清蛋白（OVA，上海麗珠東風(fēng)公司（sigma分裝），RSV病毒（武漢市武昌區(qū)華東試驗(yàn)試劑公司），ICAM-1血清試劑盒、DAB顯色劑（武漢搏士德生物公司）。

1.3主要儀器

402AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；NYD 1000型圖文分析儀（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像科技公司）。

2　方法

2.1分組及造模

60只大鼠隨機(jī)分為6組，即PBS對照組（又稱正常組），模型組，潑尼松與沙丁胺醇治療組（簡稱潑+沙治療組），咳喘寧治療組又分為咳喘寧大、中、小劑量組，每組10只。參照文獻(xiàn)［5］，除正常組外，余五組大鼠分別于第1天和第8天分3處注射共1 mL含10 mg卵清白蛋白和100 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液（兩下肢內(nèi)側(cè)皮下各注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL）致敏；第9天至第21天為激發(fā)階段，將大鼠放入容積為10 L的霧化箱內(nèi)，罩的頂面及兩側(cè)面分別開一直徑約2.5 cm的圓孔，以1%卵清白蛋白生理鹽水溶液20 mL霧化，每次20 min，隔天霧化1次，連續(xù)2周；如發(fā)現(xiàn)大鼠精神變差、飲食減少、活動減少、呼吸頻率加快的的現(xiàn)象，提示激發(fā)成功，停止激發(fā)；第21、35、49天以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后再以滴度為1.0×106空斑形成單位的RSV 50滋L經(jīng)鼻腔滴入使大鼠感染RSV誘發(fā)哮喘，經(jīng)RSV滴鼻的大鼠出現(xiàn)噴嚏、鼻腔有少量卡他樣無色透明分泌物、弓肩聳背、點(diǎn)頭樣呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不穩(wěn)時(shí)即為哮喘急性發(fā)作，提示造模成功。正常組以PBS緩沖液代替卵清白蛋白進(jìn)行腹腔注射、霧化及RSV滴鼻。

2.2治療方法

各治療組在造模完成當(dāng)天（即第49天）開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，直至處死。用藥劑量按體表面積-劑量換算法將人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量，潑尼松、沙丁胺醇治療組予混懸液醋酸潑尼7.0 mg/（kg·d）、沙丁胺醇片劑1.1 mg/（kg·d），咳喘寧大劑量組5.0 g/（kg·d），咳喘寧中劑量組2.5 g/（kg·d），小劑量組1.25 g/（kg·d），正常組及模型組予蒸餾水灌胃，每日灌胃1次。各治療組藥物均以蒸餾水稀釋，各組灌胃容量均為10 mL/（kg·d）。

2.3標(biāo)本制備

治療7 d后所有大鼠予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉完立即開腹，行腹主動脈取血后，迅速分離氣管，并做氣管切開插管固定，結(jié)扎右主支氣管，予左支氣管肺組織內(nèi)灌入PBS緩沖液，反復(fù)抽吸，收集肺泡灌洗液后，取右肺。將右肺下葉予4%甲醛固定保存，脫水，透明，包埋，切片厚約4～5滋m，每個標(biāo)本制備兩份切片。

2.4觀測指標(biāo)

2.4.1病理觀察取一份切片行蘇木精-伊紅（HE）染色，干后光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。采用NYD 1 000型圖像分析軟件測定完整小氣道支氣管內(nèi)周長（Pi）、管壁厚度（d）、外腔面積（Ao）、內(nèi)腔面積（Ai）、氣道壁面積（WA）。其中WA= Ao-Ai。測量結(jié)果用內(nèi)周長（Pi）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，支氣管壁厚度表示為d/Pi（%），氣道壁面積表示為WA/Pi2（%）。

2.4.2ICAM-1的測定取另一份切片用免疫組化pv-9 000二步法檢測ICAM-1含量：脫蠟、水化組織切片；3%雙氧水室溫孵15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS修復(fù)液置微波爐修復(fù)抗原及漂洗；滴加一抗兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體1∶100稀釋；加二抗Envision兔鼠通用型檢測系統(tǒng)，稀釋濃度亦為1∶100。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡下控制，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。高倍鏡下觀察，棕黃色為陽性顯色。運(yùn)用圖文分析儀測定ICAM-1陽性表達(dá)所占面積百分比即平均光密度值（OD）。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各分組所得計(jì)量數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)用單因素方差分析及組間的多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；方差不齊時(shí)，用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1病理觀察

模型組可見支氣管壁及其周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜水腫、增厚，上皮細(xì)胞壞死脫落，細(xì)胞排列紊亂，管腔變窄，管腔內(nèi)分泌物增多。正常組、潑+沙治療組及咳喘寧治療組炎癥反應(yīng)較模型組明顯減輕。正常組、潑+沙治療組及咳喘寧治療組小氣道支氣管壁厚度及氣道壁面積較模型組相比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；咳喘寧中劑量組較潑+沙治療組作用略差，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；咳喘寧大、小劑量組與潑+沙治療組相比，其作用明顯較差，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

3.2肺組織中ICAM-1水平的比較

正常組及各治療組與模型組比較，其肺組織中ICAM-1表達(dá)均降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；從肺組織免疫組化DAB染色切片中可看出ICAM-1主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，其中以內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增加最為明顯。潑+沙治療組與咳喘寧中劑量組優(yōu)于咳喘寧大、小劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；潑+沙治療組與咳喘寧中劑量相比，ICAM-1表達(dá)稍低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1　各組大鼠小氣道支氣管壁厚度、氣道壁面積及肺組織中ICAM-1平均光密度均值的比較（x±s）

圖1　各組肺組織HE染色光鏡圖（×400）

圖2　各組肺組織ICAM-1免疫組化DAB顯色光鏡圖（×400）

4　討論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞包括氣道的炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞（EOS）、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道重塑是哮喘發(fā)病的病理性改變，是不可逆性氣流阻塞、氣道高反應(yīng)（AHR）及肺功能持續(xù)性、進(jìn)行性損傷的主要原因，并可形成頑固性哮喘。研究表明，哮喘患者氣道壁面積及厚度均較正常組明顯升高，且其氣道壁厚度與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［6］。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，廣泛表達(dá)于白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。靜息狀態(tài)下ICAM-1呈低水平表達(dá)或不表達(dá)，炎癥發(fā)生時(shí)分泌釋放的多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子都會不同程度地刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞活化，使ICAM-1表達(dá)增加，其主要作用是維持機(jī)體器官的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和參與機(jī)體的免疫反應(yīng)［7］。ICAM-1在肺組織有表達(dá)。在OVA致敏的哮喘大鼠實(shí)驗(yàn)中，ICAM-1基因缺陷的大鼠與野生型大鼠相比較，氣道以及肺組織的炎癥明顯減輕，氣道高反應(yīng)性顯著降低［8］。降低肺組織中ICAM-1表達(dá)，可抑制哮喘氣道炎癥細(xì)胞浸潤及氣道高反應(yīng)性。既往的研究認(rèn)為ICAM-1作為“痰證”變化的指標(biāo)，“血瘀證”與血液流變學(xué)密切相關(guān)。喻氏等［9］測定大鼠哮喘模型血漿ICAM-1、血液流變學(xué)全血黏度等西醫(yī)學(xué)指標(biāo)，直觀地展現(xiàn)出來其與氣道重塑指標(biāo)的相關(guān)性，表明中西醫(yī)對哮喘發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識是吻合的，提示“痰瘀伏肺”與哮喘氣道重塑的相關(guān)性，賦予哮病“痰瘀伏肺”宿根理論科學(xué)內(nèi)涵。袁雪晶認(rèn)為哮喘治療中，及早察覺到血瘀之征，靈活運(yùn)用活血化瘀藥物，痰瘀并治，使痰祛瘀化，氣道暢通，哮喘乃平［10］。實(shí)驗(yàn)證明痰瘀同治具有減輕和控制咳嗽變異性哮喘氣道重塑的作用，且對大鼠血清中IL-1，TGF-β1及NF-κB表達(dá)的抑制，痰瘀同治組優(yōu)于模型組、輔舒酮組、健脾化痰組、行氣化瘀組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）［11］。

咳喘寧是以清熱化痰平喘的傳統(tǒng)古方五虎湯為基本方，加大青葉、黃芪、桃仁組成。方中炙麻黃乃“喘家圣藥”，入肺、膀胱經(jīng)，可外開皮毛之郁閉，以使肺氣宣暢，內(nèi)降上逆之氣，以復(fù)肺司肅降之常，善平咳喘；苦杏仁味苦性微溫，能降肺氣平喘止咳，《藥性論》謂之：“主咳逆上氣喘促”，且杏仁助麻黃止咳平喘，疏肺利氣。二藥有宣有降，可祛除外邪，暢通氣道，從而降低氣道反應(yīng)性，共為本方君藥。生石膏味辛甘性大寒，歸肺、胃經(jīng)，功在清瀉肺熱以生津，辛散解肌以透邪；大青葉味苦性寒，能清泄內(nèi)熱；黃芪味甘性微溫，歸肺、脾經(jīng)，功在補(bǔ)氣健脾、扶正祛邪，三藥合用可清熱健脾益氣，共為本方臣藥。桃仁功在活血化瘀，且可止咳平喘；細(xì)茶葉功在醒神化痰；甘草鎮(zhèn)咳平喘，并可調(diào)和諸藥，共為本方佐使。諸藥合用，共奏發(fā)表清熱，化痰平喘，活血化瘀等功效。前期研究表明，咳喘寧治療病毒誘發(fā)兒童哮喘具有較好療效，無論是總有效率還是臨床控制率，均明顯優(yōu)于對照組［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：咳喘寧可有效抑制哮喘大鼠支氣管內(nèi)及其周圍肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤，減少支氣管黏膜水腫及其管腔內(nèi)分泌物，并可抑制哮喘大鼠的支氣管壁增厚及氣道壁面積增大，從而抑制氣道重塑。另一方面咳喘寧可通過抑制肺組織中ICAM-1表達(dá)，抑制炎癥因子的黏附和遷移，從而改善RSV誘發(fā)哮喘的氣道炎癥及氣道重塑。無論是從支氣管形態(tài)學(xué)角度還是從抑制氣道重塑機(jī)制方面而言，咳喘寧中劑量組明顯優(yōu)于咳喘寧大、小劑量組（P＜0.05）；咳喘寧大劑量組稍優(yōu)于咳喘寧小劑量組，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上表明，咳喘寧可抑制肺組織中ICAM-1在細(xì)胞上的表達(dá)，使之與病毒的結(jié)合減少，從而降低氣道高反應(yīng)性；同時(shí)由于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1表達(dá)降低，減少了炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞通過血液進(jìn)入炎癥部位，抑制了炎癥因子的黏附和遷移作用，阻礙了黏附因子直接參與變態(tài)反應(yīng)的炎癥反應(yīng)中，從而緩解氣道慢形炎癥、抑制氣道重塑。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)為哮病“痰瘀伏肺”宿根理論提供依據(jù)及為痰瘀并治法在病毒誘發(fā)哮喘中的作用提供可行性證據(jù)。

［1］Openshaw Peter JM，Yamaguchi Yuko，Tregoning John S.Childhood infections，the developing immune system，and the origins of asthma［J］.The Journal of allergy and clinical immunology，2004，114（6）:1275-1277.

［2］鄭吉善，朱春，蘇苗賞，等.5歲以下兒童哮喘急性發(fā)作時(shí)呼吸道病毒病原學(xué)檢測分析［J］.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，35（6）:483-484.

［3］Shcheglovitova ON，Skliankina NN，Babaiants AA，et al.Adhesion molecules expressed in vascular endothelial cells in natural immunity against viral infections［J］.Vestn Ross Akad Med Nauk，2011（10）:54-60.

［4］Kikkawa Y，Sugiyama K，Obara K，et a1.Interferon-alpha inhibits airway eosinophila and Hyperresponsiveness in an animal asthma model［J］.Asia Pac Allergy，2012，2（4）:256-263.

［5］劉麗娜，楊季國，程東慶.呼吸道合胞病毒誘發(fā)的哮喘小鼠模型的建立［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，31（2）:154-155，157.

［6］Kasallara K，Shiba K，Ozawa T，et al.Correlation between the bronchial subepithelial layer and Whole airway wal1 thiekness inpatients with asthma［J］.Thorax，2002，57:242-246.

［7］Marguet C，Dean TP，Warner JO.Soluble intereellular adhesionmoleeule-1（sICAM-1）and Inter-feron-gamma in bronchoalveo larlavage fluid from ehildren with a1rway Diseases［J］. Am J Respir Crit Care Med，2000，162（3Ptl）:1016-1022.

［8］Tang ML，F(xiàn)iscus LC.Important roles for L-selectin and ICAM-1 in the development of allergic airway inflammation in asthma［J］. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics，2001，14（3）:203-210.

［9］喻強(qiáng)強(qiáng)，薛漢榮，洪廣祥.支氣管哮喘氣道重塑與“痰瘀伏肺”的相關(guān)性研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（7）:2148-2152.

［10］袁雪晶.從風(fēng)、痰、瘀論治兒童支氣管哮喘［J］.中國中醫(yī)急癥，2010，19（3）:438-439.

［11］李冬梅，施雷，王文麗，等.痰瘀同治對CVA模型大鼠氣道重塑作用的實(shí)驗(yàn)觀察研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015，43（3）:61-64.

［12］王孟清，羅銀河，陳錫軍，等.咳喘寧治療病毒誘發(fā)的小兒哮喘的臨床研究［J］.新中醫(yī)，2007，39（4）:16-17.

（本文編輯楊瑛）

Effect of KeChuanNing on Expression of ICAM-1 in Asthma Rats Induced by RSV

TANG Liqiong1，LI Ying2*，LUO Yinhe2*，WANG Mengqing2，SHU Lan2，TAN Wei1，GONG Ximei1，TAO Hong2，PENG Xinxin2
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410218，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

Objective To explore the effect of KeChuanNing on airway remodeling morphology and the expression of ICAM-1 in asthma rats induced by RSV，and clarify the mechanism of prevention and treatment.Methods The 60 SD male rats were randomly divided into 6 groups:normal group，model group，prednisone and salbutamoll treatment group（PS treatment group）and KeChuanNing high，medium and low dose groups，with 10 rats in each group.The asthma rats models were copied by ovalbumin and the asthma was stimulated by respiratory syncytial virus.The lung tissue pathological changes were observed by HE staining.The bronchial wall thickness and airway wall area were setermined by image analysis software. The expression of ICAM-1 was detected by using immunohistochemistry pv-9000 method.Results Compared with the model group，the inflammatory reaction in treatment groups was less；the bronchial wall thickness and airway wall area were smaller，the difference was statistically significant（P＜0.01）.The function of KeChuanNing medium dose group was slightly weak than the PS treatment group，but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Compared with PS treatment group，the effect of the KeChuanNing high，low dose group was poor and had statistical significance（P＜0.05）.Compared with the model group，the lung tissue ICAM-1 expression in the treatment groups was decreased，the difference was significant（P＜0.01）.The expression of ICAM-1 in PS treatment group was slightly lower than KeChuanNing medium dose group，but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion KeChuanNing could effectively inhibit airway remodeling，the mechanism may be related with inhibiting the expression of ICAM-1 in lung tissue.

asthma；Kechuanning；airway remodeling；respiratory syncytial virus；intercellular adhesion molecule-1；Wuhu Decoction；folium isatidis；Astragalus membranaceus；peach seed

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.007

2016-04-03

國家自然科學(xué)基金（81674025）；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（14JJ3120）。

唐力瓊，女，在讀碩士研究生，主要研究方向：小兒呼吸系統(tǒng)疾病。

*李英，女，主治醫(yī)師，E-mail:120812828@qq.com；羅銀河，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:1286313109@qq.com。