劉春燕，朱偉，唐群，梅文娟，陸苗苗，丁志高

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西南昌330006；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001）

·方藥研究·

金匱腎氣丸對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織p-STAT3蛋白的影響

劉春燕1，朱偉1，唐群1，梅文娟2，陸苗苗3，丁志高1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西南昌330006；3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001）

目的探討金匱腎氣丸對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響及對(duì)p-STAT3蛋白表達(dá)的影響。方法雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO模型組、金匱腎氣丸低劑量組、金匱腎氣丸高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照藥依那普利組，UUO術(shù)后第1天開(kāi)始灌胃，第14天處死大鼠，取梗阻腎組織，HE和Masson染色觀察腎組織病理改變，免疫組織化學(xué)檢測(cè)I型和III型膠原在腎組織的蛋白表達(dá)，Real-time PCR法檢測(cè)I型和III型膠原在腎組織的mRNA水平，Western印跡檢測(cè)磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在腎組織的表達(dá)。結(jié)果與UUO模型組比較，金匱腎氣丸治療后，腎間質(zhì)損傷指數(shù)降低，間質(zhì)膠原陽(yáng)性面積減少，I型和III型膠原蛋白及mRNA表達(dá)減少，磷酸化STAT3蛋白水平降低（P＜0.05）。結(jié)論金匱腎氣丸可以減輕UUO大鼠梗阻腎組織腎間質(zhì)損傷，減少間質(zhì)內(nèi)膠原沉積，其作用機(jī)制可能與抑制STAT3磷酸化有關(guān)。

金匱腎氣丸；腎纖維化；單側(cè)輸尿管梗阻；大鼠；p-STAT3蛋白；熟地黃；山茱萸；山藥

腎纖維化是指由各種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分在腎組織內(nèi)過(guò)度沉積，是所有慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎病的共同途徑和病理基礎(chǔ)，控制腎纖維化，對(duì)于治療慢性腎臟病、延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展起關(guān)鍵作用［1］。金匱腎氣丸是張仲景《金匱要略》中的名方，廣泛應(yīng)用于泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病治療。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸可通過(guò)作用于糖皮質(zhì)激素受體、淋巴細(xì)胞亞群、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等靶點(diǎn)參與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等功能［2-3］，同時(shí)具有良好的抗器官纖維化作用［4］。本研究采用大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO），觀察金匱腎氣丸對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的療效，并探討其作用機(jī)制是否與抑制STAT3磷酸化有關(guān)。

1　材料

1.1動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：4304702551。

1.2試藥

金匱腎氣丸購(gòu)自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠(chǎng)，藥丸碾碎并加生理鹽水配成混懸液，濃度為0.25 g/mL。Masson三色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠I型膠原多克隆抗體、兔抗大鼠III型膠原多克隆抗體、Fibronectin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；α-SMA抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；p-STAT3（Ser727）和STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling technology公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Real-time PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3儀器

BH-2光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，轉(zhuǎn)移電泳槽和電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司，低溫微型離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司，CFX96TM實(shí)時(shí)定量PCR儀、SDS PAGE微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，全自動(dòng)上液高速軟片沖洗機(jī)購(gòu)自江蘇泰泉電子自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

2　方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及模型建立

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表的方法，將30只大鼠分為假手術(shù)組、UUO模型組、金匱腎氣丸低劑量組（1.25 g/kg）、金匱腎氣丸高劑量組（2.5 g/kg）、陽(yáng)性對(duì)照藥依那普利組（10 mg/ kg），每組6只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)建立UUO大鼠腎纖維化模型。每天1次給予相應(yīng)藥物灌胃，假手術(shù)組和UUO模型組灌胃等容量生理鹽水。連續(xù)用藥14 d，處死大鼠，取左側(cè)腎組織標(biāo)本。

2.2腎組織病理學(xué)檢查

將腎組織于4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE和Masson染色。在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片，盲法依序觀察右上、右下、中間、左上、左下5個(gè)腎小管間質(zhì)視野，按腎間質(zhì)損傷8項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分：腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)算均值［5］。在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察Masson染色切片，苯胺藍(lán)將膠原纖維染成藍(lán)色，盲法隨機(jī)觀察20個(gè)互不重疊視野，計(jì)算陽(yáng)性面積占整個(gè)視野（避開(kāi)大血管和腎小球）的百分比并計(jì)分，取均值。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)染色；1分，＜25%陽(yáng)性面積；2分，25～50%陽(yáng)性面積；3分，50-75%陽(yáng)性面積；4分，75～100%陽(yáng)性面積［6］。

2.3免疫組織化學(xué)

采用SP法，按照試劑盒的操作步驟，檢測(cè)I型和III型膠原在梗阻腎組織的表達(dá)。光鏡下腎間質(zhì)中條索狀或波紋狀棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，200倍下隨機(jī)采集20個(gè)皮質(zhì)及外髓視野（除大血管外），運(yùn)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析陽(yáng)性面積百分比，取均值［7］。

2.4Real-time PCR

總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。引物序列均根據(jù)Gene Bank，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)完成。Collagen I上游引物5'-TCAGGGGCGAAGGCAACA'-GT-3'，下游引物：5'-TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA-3'；Collagen III上游引物：5'-AAGGGCAGGGAACAACTGAT-3'，下游引物：5'-GTGAAGCAGGG-TGAGAAGAAAC-3'；β-actin上游引物：5'-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下游引物：5'-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'。PCR反應(yīng)總體積為10滋L，組分如下：SYBR Premix Ex Taq 5滋L，10滋M collagen I（或collagen III）上下游引物各0.25滋L，適當(dāng)稀釋的cDNA 0.5滋L，ddH2O 4滋L。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；再95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。實(shí)時(shí)熒光定量利用PCR技術(shù)通過(guò)2-ΔΔCT方法分析相對(duì)基因表達(dá)差異，數(shù)據(jù)分析采用下列公式：ΔΔCT=（CT.Target-CT.Actin）Time x-（CT.Target-CT.Actin）Time 0，Time x表示任意時(shí)間點(diǎn)，Time 0表示經(jīng)β-actin校正后1倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。

2.5Western印跡

采用2×SDS裂解液提取腎組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜。牛奶室溫封閉1 h后，分別加入FN、α-SMA、p-STAT3/STAT3一抗（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗3次，用ECL顯色并曝光，采用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度掃描。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性，采用多組間單因素方差分析方法（LSD）；若數(shù)據(jù)方差不齊或不符合正態(tài)分布，進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換后采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1各組大鼠梗阻腎組織病理變化及腎間質(zhì)損傷指數(shù)、膠原相對(duì)面積比較

光鏡下觀察腎組織HE和Masson染色切片并進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示假手術(shù)組腎組織無(wú)明顯病理改變；UUO模型組腎小管擴(kuò)張，部分管腔內(nèi)有蛋白質(zhì)管型，腎小管上皮細(xì)胞萎縮或空泡變性，局部間質(zhì)內(nèi)有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增生、膠原纖維增多；金匱腎氣丸低劑量和高劑量及依那普利治療后，上述病變減輕，且金匱腎氣丸高劑量組病變最輕。腎間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分顯示，模型組與假手術(shù)組比較，腎間質(zhì)損傷指數(shù)明顯增高（P＜ 0.01）；各治療組與模型組比較，腎間質(zhì)損傷指數(shù)明顯降低（P＜0.05），其中金匱腎氣丸高劑量組腎間質(zhì)損傷指數(shù)比依那普利組明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1。對(duì)Masson染色膠原含量進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，UUO模型組腎間質(zhì)膠原陽(yáng)性面積評(píng)分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），各治療組腎間質(zhì)膠原陽(yáng)性面積評(píng)分顯著降低（P＜0.05）；其中金匱腎氣丸高劑量組評(píng)分最低，與依那普利組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖2。

表1　各組大鼠梗阻腎組織腎間質(zhì)損傷指數(shù)、膠原相對(duì)面積比較（x±s，n=5）

圖1　各組大鼠腎臟病理學(xué)改變光鏡圖（HE染色×200）

圖2　各組大鼠腎臟病理學(xué)改變光鏡圖（Masson染色×200）

3.2各組大鼠梗阻腎組織I、III型膠原的蛋白及mRNA表達(dá)情況

假手術(shù)組腎組織僅在血管周?chē)凶攸S色膠原表達(dá)，腎間質(zhì)中無(wú)I、III型膠原表達(dá)；14 d模型組腎間質(zhì)可見(jiàn)大量染成棕黃色條索狀的I、III型膠原表達(dá)；金匱腎氣丸低、高劑量治療組和依那普利治療組腎間質(zhì)I、III型膠原表達(dá)較模型組明顯減少，I、III型膠原陽(yáng)性面積百分比顯著降低（P＜0.05），其中金匱腎氣丸高劑量組的I、III型膠原陽(yáng)性面積百分比低于依那普利對(duì)照組。模型組腎間質(zhì)I、III型膠原mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；金匱腎氣丸低、高劑量治療組和依那普利治療組腎間質(zhì)I、III型膠原mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），其中金匱腎氣丸高劑量組的I、III型膠原mRNA表達(dá)水平低于依那普利對(duì)照組。見(jiàn)圖3。

圖3　各組大鼠腎組織I、III型膠原蛋白及mRNA表達(dá)的比較光鏡圖×200（左列）及柱形圖（右列）

3.3各組大鼠梗阻腎組織p-STAT3蛋白的表達(dá)情況

模型組大鼠腎組織p-STAT3表達(dá)水平明顯增高（P＜0.01），金匱腎氣丸低、高劑量治療組和依那普利治療組p-STAT3表達(dá)明顯降低（P＜0.05），三個(gè)治療組間沒(méi)有顯著性差異，見(jiàn)圖4。

4　討論

目前臨床上治療腎纖維化的措施主要包括兩個(gè)方面：一是針對(duì)原發(fā)病的病因治療，二是針對(duì)腎纖維化本身的治療。原發(fā)病因的去除并不能完全抑制腎纖維化的發(fā)展，而腎纖維化病變反過(guò)來(lái)又可以影響原發(fā)病的治療效果［8］，因此針對(duì)腎纖維化本身的治療尤其重要。但是，目前臨床缺乏有效的抗腎纖維化藥物。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ型受體拮抗劑是目前臨床上應(yīng)用較多的抗腎纖維化藥物，但這兩類(lèi)藥物均只能延緩腎纖維化的進(jìn)程，并不能十分有效的阻止慢性腎臟病向終末期腎病的進(jìn)展，而且在已存在腎功能衰竭患者中的應(yīng)用尚存爭(zhēng)議［9］。目前在研的抗腎纖維化藥物主要有：抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β拮抗劑、松弛素、秋水仙堿、己酮可可堿、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及骨形成蛋白-7等，但這些藥物均仍處于臨床前研究階段，其臨床實(shí)際療效及毒副作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證，而且這些藥物往往針對(duì)某一個(gè)導(dǎo)致纖維化的靶點(diǎn)，不能從整體上防治纖維化的發(fā)生。中醫(yī)辨證論治，從整體上改善人體的內(nèi)環(huán)境，從各個(gè)環(huán)節(jié)防治纖維化的發(fā)生。研究顯示，中醫(yī)藥在防治腎纖維化方面具有廣闊的前景。

圖4　Western blot檢測(cè)各組大鼠梗阻腎組織p-STAT3蛋白的表達(dá)電泳圖（上）及柱形圖（下）

中醫(yī)認(rèn)為，各種慢性腎病進(jìn)展到腎功能衰竭的過(guò)程屬陽(yáng)氣衰敗，水濕瘀濁內(nèi)聚，正虛邪實(shí)、脾腎衰敗、濁毒內(nèi)蘊(yùn)、腎絡(luò)瘀阻是其基本病理，虛、瘀、濕是其特點(diǎn)。腎纖維化早中期多見(jiàn)脾腎氣虛或脾腎氣陰兩虛；隨著病情進(jìn)一步發(fā)展，腎虛氣化乏力，脾虛水濕不運(yùn)，濕濁日久化熱、生毒、成瘀，變證叢生。正虛貫穿疾病始末，扶助正氣是延緩和阻止慢性腎纖維化進(jìn)程的重要方法。故需用溫陽(yáng)利水、化瘀降濁中藥。腎氣丸來(lái)源于東漢末年張仲景所著《金匱要略》一書(shū)，所以又名金匱腎氣丸，是溫補(bǔ)腎陽(yáng)的代表方，也是最早的補(bǔ)腎方劑。方中用熟地黃滋陰補(bǔ)腎，山茱萸、山藥補(bǔ)肝脾而益精血；以少量肉桂、附子溫補(bǔ)腎陽(yáng)，可微生少火以生腎氣；澤瀉、茯苓利水滲濕泄?jié)?，牡丹皮清肝瀉火、活血散瘀，調(diào)血分之滯，其與滋陰補(bǔ)腎藥相配，意在寓瀉于補(bǔ)，以瀉助補(bǔ)。

本研究采用腎間質(zhì)纖維化的經(jīng)典動(dòng)物模型UUO作為研究對(duì)象，觀察金匱腎氣丸對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，并采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑依那普利作為陽(yáng)性對(duì)照藥。結(jié)果顯示，金匱腎氣丸低劑量、高劑量和依那普利組均能有效改善腎間質(zhì)損傷，與模型組相比，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性少，萎縮或擴(kuò)張的腎小管少，間質(zhì)膠原纖維沉積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少（P＜0.05）；其中金匱腎氣丸高劑量組病變最輕，且腎間質(zhì)損傷指數(shù)評(píng)分低于依那普利組（P＜0.05）。同時(shí)，通過(guò)Masson染色，我們發(fā)現(xiàn)各治療組的梗阻腎臟膠原纖維沉積比UUO組減少，膠原面積評(píng)分明顯低于UUO組（P＜0.05）；其中金匱腎氣丸高劑量組的評(píng)分低于依那普利組（P＜0.05）。I型和III型膠原是腎間質(zhì)纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，因此通過(guò)免疫組織化學(xué)方法和real-time PCR方法來(lái)研究金匱腎氣丸對(duì)梗阻腎間質(zhì)中I、III型膠原的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，各治療組均能顯著下調(diào)I、III型膠原的蛋白和mRNA水平（P＜0.05），其中金匱腎氣丸高劑量組的I、III型膠原的蛋白和mRNA水平顯著低于依那普利組（P＜0.05）。

JAK/STAT信號(hào)通路是一條由多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增生、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等重要生理過(guò)程。STAT作為JAK的靶蛋白，是存在于胞質(zhì)中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，其中STAT3是該家族的重要成員，且與腎臟疾病的關(guān)系最為密切［10-11］。多項(xiàng)研究證實(shí)，UUO模型腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的增多與STAT3的激活相關(guān)［12-13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UUO模型組大鼠梗阻腎組織中STAT3表達(dá)明顯增高，金匱腎氣丸治療后可降低UUO梗阻腎組織中STAT3的表達(dá)，推測(cè)金匱腎氣丸可能通過(guò)抑制STAT3的磷酸化來(lái)起到減輕腎間質(zhì)纖維化的作用。

綜上所述，金匱腎氣丸可以減輕UUO梗阻腎組織腎間質(zhì)損傷和膠原沉積，降低腎組織中I型和III型膠原的表達(dá)，并抑制STAT3的磷酸化；高劑量的金匱腎氣丸對(duì)腎間質(zhì)損傷的保護(hù)作用及減少膠原沉積的作用優(yōu)于依那普利。所以認(rèn)為，金匱腎氣丸可以改善UUO模型腎間質(zhì)纖維化，其作用機(jī)制可能與其抑制STAT3的磷酸化有關(guān)。

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（本文編輯楊瑛）

Effect of Jingui Shenqi Pill on the Expression of p-STAT3 in Unilateral Ureteral Obstruction Rats

LIU Chunyan1，ZHU Wei1，TANG Qun1，MEI Wenjuan2，LU Miaomiao3，DING Zhigao1
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China；3.The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China）

Objective To investigate the effect of Jingui Shenqi pill on unilateral ureteral obstruction（UUO）rats with renal interstitial fibrosis and the expression of p-STAT3 protein.Methods 30 male SD rats were randomly divided into sham operation group，UUO model group，low dose of Jingui Shenqi pill group，high dose of Jinguishenqi pill group，enalapril treatment group as positive control.After intragastric administration on the 14 days，the rats were sacrificed.The obstructive kidney tissues were stained with HE and Masson to observe the pathologic changes.The protein or mRNA expression of type I and III collagen in renal tissue was detected by immunohistochemistry staining or Real-time PCR.The phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）in renal tissue was detected by Western blot.Results Compared with UUO model group，after treatment with Jingui Shenqi pill，the renal interstitial damage index and collagen positive area weredecreased，theexpressionoftypeIandtypeIIIcollagenproteinandmRNAwerealsodecreasedandthe phosphorylation of STAT3 protein was inhibited（P＜0.05）.Conclusion Jingui Shenqi pill can obviously improve renal interstitial injury and reduce interstitial collagen deposition in UUO rats which may be related to the inhibition of STAT3 phosphorylation

Jingui Shenqi pill；renal fibrosis；unilateral ureteral obstruction rats；p-STAT3；prepared radix rehmanniae；semen corni；Chinese yam

R277.5；R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.10.006

2016-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81503442）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81603470）；湖南省教育廳科研項(xiàng)目（11C0953）。

劉春燕，女，博士，研究方向：慢性腎臟病的防治，E-mail:liuchunyan0221@126.com。