袁昊　曾暉　肖德明　于斐　林健靜

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳518036）

白藜蘆醇通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)*

袁昊曾暉**肖德明于斐林健靜

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳518036）

背景：炎癥因子如IL-1β、TNF-α等可通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起關(guān)節(jié)軟骨破壞和炎癥反應(yīng)，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨病變中尤為重要。白藜蘆醇（resveratrol，Res）具有抗炎、抗氧化等作用，研究Res對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響可為其預(yù)防、治療骨關(guān)節(jié)炎提供參考依據(jù)。目的：探討Res對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)小鼠軟骨細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）活化及炎癥因子基因表達(dá)的調(diào)節(jié)及其相關(guān)機(jī)制。方法：體外分離培養(yǎng)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，Ⅱ型膠原免疫熒光檢測(cè)進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定。根據(jù)加入不同培養(yǎng)物分為3組：LPS組（1μg/m l LPS）；Res組（100μmol/LRes+1μg/m l LPS）；空白對(duì)照組。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞中NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB-α，I-κBα）的表達(dá)量，細(xì)胞免疫熒光染色觀察NF-κB核轉(zhuǎn)位情況，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)量。結(jié)果：熒光顯微鏡下可見(jiàn)軟骨細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。ELISA檢測(cè)：LPS組的I-κBα表達(dá)量低于空白對(duì)照組（P＜0.05），Res組明顯高于LPS組（P＜0.01）。細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)：與空白對(duì)照組相比，LPS組中NF-κB發(fā)生明顯的核轉(zhuǎn)位，而Res組中NF-κB的核轉(zhuǎn)位受到抑制。RT-PCR檢測(cè)：LPS組中IL-1β和TNF-αm RNA的表達(dá)量與空白對(duì)照組相比明顯上調(diào)，而Res組中IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)量與LPS組相比明顯下調(diào)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論：Res可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路影響軟骨細(xì)胞IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)，進(jìn)而降低軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，延緩關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變。

骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；NF-κB；炎癥

【Abstract】Background:Inflammatory cytokines such as IL-1 beta，TNF alpha can lead to cartilage destruction and inflammatory reaction through a series of cascade reaction，especially in cartilage lesions.Resveratrol has anti-inflammatory and antioxidant function.It can provide reference for the prevention and treatment of osteoarthritis by researching the effect of resveratrol on inflammatory cytokines expression of cartilage cells.Objective:To investigate how resveratrol regulates the activation of nuclear factor-Kappa B（NF-κB）and the gene expression of inflammatory cytokines in lipopolysaccharide-induced cartilage cells and its related mechanism.Methods:Mouse knee cartilage cellswere isolated and cultured in vitro，whichwere identified by typeⅡcollagen immunofluorescence.The experimentwas divided into three groups according to different culture:LPS group（1μg/m l LPS），resveratrol group（100μmol/L resveratrol+1μg/m l LPS），and blank control group.The expression level of inhibitor of NF-κB-α（I-κBα）were detected by using enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）.NF-κB nuclear translocation was observed by immunofluorescence staining.The expression of IL-1β、TNF-α mRNA wasmeasured by real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results:The cell nucleus of chondrocyteswas blue and cytoplasm was red under the fluorescentm icroscope.ELISA detection:the expression of I-κBαin LPS group w as significantly lower than that in control group（P<0.05），w hile the expression of I-κBαin resveratrol group was significantly higher than that in LPS group（P<0.01）.Immunofluorescence staining:the nuclear translocation of NF-κB in LPSgroup significantly changed compared with the control group，while the nuclear translocation of NF-κB in resveratrol group was inhibited.RT-PCR test:as compared with the control group，the expression of IL-1βand TNF-αmRNA in LPS groupwereupregulated，while resveratrolgroupwere downregulated compared to LPSgroup（P<0.05）.Conclusions:Resveratrol can inhibit the expression of IL-1βand TNF-αmRNA in cartilage cells through NF-κB signal pathway，decrease the inflammatory reaction of chondrocytes，and then delay the degeneration of articular cartilage cells.

【Key w ords】Osteoarthritis；Chondrocytes；NF-Kappa B；Inflammation

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種非黃酮類多酚化合物，多項(xiàng)研究表明其對(duì)腫瘤、腦缺血、骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病具有良好的治療作用，這可能依賴于其抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性以及改善細(xì)胞內(nèi)能量代謝等機(jī)制［1，2］。關(guān)節(jié)軟骨的退行性變是骨關(guān)節(jié)炎的主要病理改變，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為沒(méi)有炎癥因子參與，但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，代謝性炎癥在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3］。如果可以找到抑制骨關(guān)節(jié)炎中炎癥因子表達(dá)的途徑，保護(hù)軟骨細(xì)胞免受過(guò)度氧化應(yīng)激的損傷，將對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎有重要意義。本研究采用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）作為誘導(dǎo)劑，建立小鼠軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型［4］，觀察Res對(duì)軟骨細(xì)胞是否存在保護(hù)作用并探討其可能的作用途徑和作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和化學(xué)試劑

C57BL/6J品系胎鼠9只（動(dòng)物合格證號(hào)：44007200018611），雌雄不限，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心深圳醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。細(xì)胞培養(yǎng)液改良型1640（Hyclone公司提供）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco公司提供），雙抗（青霉素、鏈霉素）；Res、LPS（sigma公司提供）；PBS（Hyclone公司提供）；抗兔Dylight 488（Jackson公司提供）；抗熒光淬滅封片液、DAPI（碧云天公司提供）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）試劑盒（TaKaRa公司提供）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（酶聯(lián)生物科技有限公司提供）；TRE-trizol（Invitrogen公司提供），q-PCR引物（南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成）。

1.2軟骨細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下截取C57BL/6J胎鼠的膝關(guān)節(jié)，潔凈工作臺(tái)內(nèi)將膝關(guān)節(jié)取下，0.25%胰蛋白酶消化15m in，無(wú)菌PBS溶液沖洗后，加無(wú)菌0.2%Ⅱ型膠原酶置于37℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)消化4 h，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基終止消化，1000 r/m in、5m in，棄上清。按（3～4）×105/m l接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃恒溫、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3軟骨細(xì)胞爬片和培養(yǎng)

調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×104/m l，在24孔板中放入爬片，每孔加1m l細(xì)胞懸液后置37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，之后棄去液體，空白對(duì)照組加1m l培養(yǎng)基，LPS組加1m l1μg/m l的LPS，Res組加入100μmol/L Res培養(yǎng)2 h后加1μg/m l LPS繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

取生長(zhǎng)良好的軟骨細(xì)胞24孔板內(nèi)爬片，PBS液漂洗3次各5m in，4%多聚甲醛固定10m in，PBS液洗3次各5m in，5%BSA封閉30m in，加入一抗4℃過(guò)夜，PBS液漂洗3次各5m in，加入二抗37℃放置30m in以上，行顯微鏡下觀察。

1.5NF-κB免疫熒光染色與熒光顯微鏡觀察

吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。加入固定液固定15m in，PBS洗滌3次，每次5m in。每孔滴入200μl 3%的H2O2溶液覆蓋在爬片上，37℃孵育10m in，PBS洗滌3次，每次5m in。加入BSA封閉液，37℃恒溫封閉45 m in。加入NF-κB p65抗體，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，每次5m in。加入抗兔Dylight488，室溫孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5m in。加入細(xì)胞核染色液（DAPI），室溫染色5m in，PBS洗滌3次，每次5m in。滴加適量的抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片。在波長(zhǎng)460 nm處觀察細(xì)胞核、胞漿顏色，NF-κB p65染色為綠色熒光，DAPI染色為藍(lán)色熒光，高倍鏡下觀察細(xì)胞發(fā)生核轉(zhuǎn)位的情況。

1.6ELISA檢測(cè)軟骨細(xì)胞NF-κB抑制蛋白α（inhibitor ofNF-κB-α，I-κBα）表達(dá)量

小鼠軟骨細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋至1.0×105/m l，培養(yǎng)于6孔板，按不同組進(jìn)行相應(yīng)處理，獲取軟骨細(xì)胞后采用反復(fù)凍融的方法裂解細(xì)胞。應(yīng)用ELISA檢測(cè)I-κBα在各組中的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟操作，完成反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中I-κBα的濃度。

1.7實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

收集各組細(xì)胞，按照Trizol一步法抽提得到總RNA，分光光度計(jì)測(cè)得RNA的濃度，2%凝膠電泳確定RNA片段的完整性。取1μg總RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。按照PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行小鼠IL-1β、TNF-αmRNA的RT-PCR檢測(cè)。GAPDH作為內(nèi)參基因。利用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析相應(yīng)基因表達(dá)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。引物序列如表1所示。

表1　實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間計(jì)量資料采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1小鼠原代細(xì)胞的觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)，未貼壁前細(xì)胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中；12 h左右細(xì)胞開(kāi)始貼壁；24 h后有較多細(xì)胞貼壁，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，大部分呈梭形，部分呈多角形，均勻散在生長(zhǎng)，出現(xiàn)較多細(xì)胞分裂相；7 d左右細(xì)胞鋪滿瓶底，鋪滿后進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)可呈現(xiàn)“鋪路石”樣改變。從第6代開(kāi)始，軟骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量細(xì)黑顆粒，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，有些甚至出現(xiàn)碎裂。

Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)的主要成分，Ⅱ型膠原的合成與分泌可作為鑒定軟骨細(xì)胞的特定指標(biāo)［5］。軟骨細(xì)胞培養(yǎng)3 d后光鏡下形態(tài)如圖1A所示，Ⅱ型膠原免疫熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察如圖1B所示，可見(jiàn)典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)，其中軟骨細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，而胞質(zhì)呈紅色熒光。

圖1　A.軟骨細(xì)胞培養(yǎng)3 d后光鏡下大多呈梭形，少數(shù)呈多角形（200×）；B.細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)Ⅱ型膠原免疫熒光染色后熒光顯微鏡下軟骨細(xì)胞核藍(lán)染，胞質(zhì)呈紅色熒光（200×）

2.3Res對(duì)軟骨細(xì)胞I-κBα蛋白表達(dá)的影響

I-κBα是NF-κB的抑制蛋白，通過(guò)檢測(cè)I-κBα蛋白的表達(dá)量可以反映NF-κB信號(hào)通路的激活情況。ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖2所示：LPS組中加入LPS后繼續(xù)培養(yǎng)6 h（LPS終濃度為1μg/m l）；Res組加入Res培養(yǎng)2 h后換液，加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)6 h（Res終濃度為100μmol/L，LPS終濃度為1μg/m l）；空白對(duì)照組（僅加培養(yǎng)液）。ELISA檢測(cè)三組的I-κBα蛋白表達(dá)量分別為：LPS組（41.55±3.83）ng/L、Res組（85.02±6.33）ng/L、空白對(duì)照組（71.18±3.83）ng/L，其中LPS組明顯低于空白對(duì)照組（*P＜0.05），Res組明顯高于LPS組（**P＜0.01）。

2.4Res對(duì)軟骨細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

細(xì)胞免疫熒光染色與熒光顯微鏡下觀察如圖3所示：對(duì)照組（圖3A、B、C）綠色熒光主要分布于胞漿區(qū)，而核區(qū)很少或不見(jiàn)，核呈藍(lán)色；LPS組（圖3D、E、F）胞漿區(qū)綠色熒光減弱，胞核有部分綠色熒光，與細(xì)胞核藍(lán)色疊加，提示NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，處于激活狀態(tài)；Res組（圖3G、H、I）可見(jiàn)胞漿區(qū)綠色熒光相比LPS組增強(qiáng)，但弱于空白對(duì)照組，提示白R(shí)es對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)位有一定抑制作用。

圖2　Res對(duì)軟骨細(xì)胞I-κBα蛋白表達(dá)的影響

2.5Res對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果如圖4所示，軟骨細(xì)胞經(jīng)1μg/m l LPS誘導(dǎo)后，IL-1β、TNF-α的表達(dá)量明顯上調(diào)，加入LPS前2 h分別用不同濃度（10μmol/L，100μmol/L，1000μmol/L）的Res處理。LPS組IL-1β、TNF-α的表達(dá)量與空白對(duì)照組相比明顯上調(diào)（*P＜0.05），Res組除10μmol/L濃度的IL-1β的表達(dá)量無(wú)明顯差異外，其余濃度組IL-1β和TNF-α的表達(dá)量與LPS組相比均明顯下降（**P＜0.05）。

3　討論

Res于1940年首次從毛葉藜蘆的根莖中獲得，是一種存在于葡萄科、百合科、豆科等多種植物中的天然小分子化合物，其具有抗炎、抗氧化、抗衰老、調(diào)控細(xì)胞凋亡等病理作用。有研究指出Res可抑制軟骨細(xì)胞凋亡繼而起到預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的作用［6］。LPS是革蘭氏陰性桿菌外膜的主要組成成分，它可干擾軟骨細(xì)胞的正常功能，促使軟骨細(xì)胞表達(dá)促炎因子（IL-1β，TNF-α，IL-6）而表現(xiàn)為退化性關(guān)節(jié)炎的早期階段［7］。本實(shí)驗(yàn)用LPS刺激小鼠軟骨細(xì)胞模擬骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的炎癥模型［4］，在細(xì)胞水平研究骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)機(jī)制。骨關(guān)節(jié)炎是一種多致病因素引起的關(guān)節(jié)退行性病變，年齡、肥胖、炎性反應(yīng)、過(guò)度負(fù)載以及關(guān)節(jié)損傷和疾病均是發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素［8］。目前骨關(guān)節(jié)炎的早期治療主要集中在改善關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)狀況及減少關(guān)節(jié)軟骨的磨損。但隨著對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，各種細(xì)胞因子的調(diào)控失調(diào)所致的合成和分解效應(yīng)在軟骨退變中起重要作用，炎癥細(xì)胞因子（如：IL-1β，IL-6和TNF-α等）已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)更新周轉(zhuǎn)率，進(jìn)而加速骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞退化和誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，IL-1、TNF-α是引起骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)及軟骨基質(zhì)降解的重要細(xì)胞因子，IL-1可能是眾多破壞性細(xì)胞因子的核心因子［9，10］。因此，控制軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有利于控制或延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，并可能成為治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究中觀察到，在LPS誘導(dǎo)下軟骨細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)明顯升高，而加入Res后IL-1β、TNF-αmRNA的表達(dá)受到抑制，而且呈劑量依賴性，提示Res對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)具有抑制效應(yīng)。

圖3　Res對(duì)軟骨細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

圖4　Res對(duì)軟骨細(xì)胞IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)的影響

骨關(guān)節(jié)炎炎癥的產(chǎn)生與NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)，許多與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的趨化因子、環(huán)氧合酶和金屬蛋白酶等重要因子均含有κB位點(diǎn)，活化的NF-κB能與特定的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)調(diào)節(jié)參與機(jī)體的炎癥有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，正常情況下軟骨基質(zhì)的合成和分解處于動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞因子以及外界機(jī)械刺激主要通過(guò)關(guān)節(jié)液和軟骨基質(zhì)作用于軟骨細(xì)胞［11］。體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)Res可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨基質(zhì)的降解［12］。

NF-κB是炎癥通路中的一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，刺激細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和炎癥因子等，破壞關(guān)節(jié)軟骨，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨修復(fù)產(chǎn)生不利影響［13］。大量研究已證實(shí)，在軟骨細(xì)胞中NF-κB參與調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α和IL-1β、纖維結(jié)合蛋白碎片和機(jī)械信號(hào)［14，15］。NF-κB蛋白是一類由其家族蛋白亞單位組成的同源或異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，不同的組合可以激活不同的效應(yīng)基因。在人體中最常見(jiàn)的是由p65和p50組成的異源二聚體，NF-κB在胞質(zhì)內(nèi)被合成并與其I-κB結(jié)合形成三聚體而失活。它可以被多種刺激因素激活而使I-κB磷酸化，從而使NF-κB與I-κB解離并移位至細(xì)胞核內(nèi)與靶基因上游的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子上的特定序列（κB位點(diǎn)）結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。由此可知，通過(guò)檢測(cè)I-κB蛋白的表達(dá)量可以反映NF-κB信號(hào)通路的激活情況。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS的刺激下I-κB蛋白的表達(dá)量和對(duì)照組相比明顯下降（P＜0.05），而I-κBa作為NF-κB信號(hào)通路的抑制蛋白，其含量的減少提示該通路的激活。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果提示LPS組NF-κB明顯激活，而Res組NF-κB激活受抑制。

本研究針對(duì)Res對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的防治作用進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)Res對(duì)軟骨細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路具有抑制作用，并且可降低軟骨細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)。由此認(rèn)為Res對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路降低炎癥因子表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，為Res用于防治骨關(guān)節(jié)炎提供了新的參考依據(jù)。

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Resveratrol inhibits theexpression of inflammatory cytokines in cartilage cells through NF-κB signaling pathway*

YUAN Hao，ZENG Hui**，XIAODem ing，YU Fei，LIN Jianjing
（Departmentof Orthopedics，Peking University Shenzhen Hospital，Guangdong 518036，China）

2095-9958（2016）02-0075-05

10.3969/j.issn.2095-9958.2016.01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81272032）；深圳市科創(chuàng)委資助項(xiàng)目（JCY20130402114702130）

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曾暉，E-mail：zenghui_36@163.com