宋逍段璽唐志書(shū)王昌利趙鵬

微波輔助提取款冬花多糖的工藝及抗氧化活性研究*

宋逍①段璽②唐志書(shū)①王昌利①趙鵬①

目的：研究款冬花多糖微波輔助提取工藝及其抗氧化活性。方法：通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響款冬花多糖提取率的料液比、微波功率、微波時(shí)間進(jìn)行考察，最后，選用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并研究款冬花多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子的清除作用。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，款冬花多糖微波輔助提取最佳實(shí)驗(yàn)條件為料液比為1∶30（g/mL），微波功率為600 W，微波時(shí)間為7 min，在此條件下，多糖得率為14.806%。隨著款冬花多糖濃度的增大，其清除羥基自由基、超氧陰離子的能力也隨之增加。結(jié)論：款冬花多糖具有一定的抗氧化性，并對(duì)羥自由基、超氧自由基有較強(qiáng)的清除能力。

款冬花； 多糖； 微波提??； 抗氧化活性

First-author’s address：Pharmacy College of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Xianyang 712046，China

款冬花為菊科植物款冬（Tussilagofar-fara）的干燥花蕾，為常用中藥材之一，具有潤(rùn)肺止咳、化痰平喘之功效[1]，其主要有效成分為萜類(lèi)、黃酮、生物堿、有機(jī)酸和精油等[2-5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)款冬花中有效成分多糖具有一定的抗腫瘤作用[6-7]，因而對(duì)其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，關(guān)于款冬花多糖的提取研究，主要采用傳統(tǒng)水提、超聲提取的研究方法，而關(guān)于款冬花多糖微波提取的方法鮮有報(bào)道[8-12]?；诖?，本研究利用微波提取技術(shù)[13-17]，對(duì)款冬花多糖提取工藝運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化篩選，并以抗氧化性實(shí)驗(yàn)對(duì)提取的款冬花多糖進(jìn)行活性研究，為款冬花的實(shí)際應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究提供一定的科研基礎(chǔ)和思路。

1　材料與方法

1.1材料 于西安萬(wàn)壽路中藥材批發(fā)市場(chǎng)自購(gòu)款冬花實(shí)驗(yàn)藥材，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王繼濤教授鑒定為菊科植物款冬（Tussilago farfara L.）的干燥花蕾。

1.2儀器及試劑 UV-265型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），AL204型分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），中科中佳HC-3618R冷凍離心機(jī)DZF-602真空干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠），微波爐美的EG823MF4-NA；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA（上海嘉鵬科技有限公司）。乙醇、乙醚、丙酮、葡萄糖、苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1原料的提取 取款冬花花蕾，于80 ℃烘箱中烘干，粗粉碎，過(guò)篩。按照1∶3（g/mL）條件用無(wú)水乙醚回流提取2 h，脫脂，在70 ℃烘箱中干燥后再按前面1∶3（g/mL）條件用85%乙醇回流提取2 h，以除去單糖等雜質(zhì)，再在70 ℃烘箱中干燥備用。

1.3.2單因素實(shí)驗(yàn) 取款冬花粉末，按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行：以料液比1∶30（g/mL），設(shè)定微波功率為400 W，時(shí)間為5 min，并在不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60），不同微波功率（200、300、400、500、600、700 W），不同微波時(shí)間（3、4、5、6、7、8 min）下考察上述條件對(duì)款冬花多糖得率的影響。

1.3.3正交實(shí)驗(yàn) 在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、微波功率、微波時(shí)間3個(gè)因素，按照L934設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.4款冬花多糖提取方法 取80 ℃下烘干的款冬花→粉碎后，過(guò)70目篩→脫脂及除去單糖等雜質(zhì)→微波提取→抽濾，濾液測(cè)定多糖含量→Sevage法去蛋白→水相加入乙醇，4 ℃沉淀過(guò)夜→4 ℃冷凍離心，沉淀，依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮洗滌3次→80 ℃真空干燥至恒重→款冬花多糖。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及多糖提取率計(jì)算 精密稱(chēng)取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，至100 mL容量瓶中用蒸餾水溶解定容，搖勻，配成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取2、4、6、8、10 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液定容到50 mL，而后各吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL 置25 mL具塞比色瓶中，分別加新鮮配制的5%苯酚1 mL，98%濃硫酸5 mL，各自震蕩搖勻，40 ℃水浴加熱30 min，冷至室溫，以蒸餾水為空白對(duì)照，490 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程y=12.9083x+0.0077（r=0.9998）。精密吸取前述定容的款冬花多糖溶液1.0 mL，按照前法測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，按照下式計(jì)算多糖得率：款冬花多糖得率（%）=（提取液中多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%

1.3.6抗氧化性實(shí)驗(yàn) 分別配制50、100、200、400、800、960、1200 μg/mL不同濃度的款冬花多糖溶液各進(jìn)行羥基自由基清除能力、超氧陰離子的清除作用的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，其中采用Fenton反應(yīng)-分光光度法測(cè)定羥基自由基清除能力[18]。采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧陰離子的清除作用[19-20]。

2　結(jié)果

2.1單因素考察結(jié)果

2.1.1料液比對(duì)多糖得率的影響 由圖1可知，隨著料液比的增加，款冬花多糖得率逐步增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）后，款冬花多糖提取得率達(dá)最大值，后續(xù)隨著料液比再增加，得率不增且有降低的趨勢(shì)，分析原因可能是因?yàn)槿軇┝康脑黾?，?dǎo)致其他成分的溶出從而影響到多糖的溶出，因而同等提取時(shí)間下得率下降。故本研究確定最佳料液比為1∶30（g/mL）。

圖1　料液比對(duì)多糖得率的影響

2.1.2微波功率對(duì)多糖得率的影響 設(shè)置微波功率在200～500 W范圍內(nèi)，隨著其功率不斷的增加，由圖2可知，款冬花多糖的的得率逐漸升高，而當(dāng)微波功率超過(guò)500 W后，多糖得率逐步下降，分析原因可能是因微波功率過(guò)高，產(chǎn)生的熱量增加，破壞了款冬花多糖結(jié)構(gòu)，從而引起多糖降解，致使多糖得率下降，故款冬花多糖微波最佳的提取功率為500 W。

2.1.3微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 設(shè)定微波提取時(shí)間在3～6 min范圍內(nèi)，由圖3結(jié)果可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)多糖得率隨之增加，當(dāng)微波提取時(shí)間到6 min時(shí)達(dá)到最大值，而后隨著時(shí)間的增加，款冬花多糖得率降低，分析原因可能是微波長(zhǎng)時(shí)間作用，使多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使多糖降解，從而導(dǎo)致多糖得率下降，故設(shè)定6 min為微波最佳提取時(shí)間。

圖2　微波功率對(duì)多糖得率的影響

圖3　微波時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.2款冬花多糖微波提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 依據(jù)前面單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以料液比、微波提取時(shí)間、微波功率3個(gè)顯著影響款冬花多糖得率的因素為對(duì)象結(jié)合款冬花多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以篩選微波提取款冬花多糖的最佳工藝，見(jiàn)表2。

表2　微波提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)極差R值的比較可以看出，影響款冬花多糖得率因素的主要因素為料液比>微波時(shí)間>微波功率，款冬花多糖微波提取的最佳條件為A2B2C3，即料液比為1∶30（g/mL），微波提取功率為600 W，微波提取時(shí)間為7 min。以此條件，進(jìn)行款冬花多糖3次平行提取實(shí)驗(yàn)，款冬花多糖得率分別為14.856%、14.753%、14.811%平均值為14.806%，表明該條件穩(wěn)定可行。

2.3款冬花多糖抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1羥基自由基清除能力測(cè)定 由圖4可知，隨著款冬花多糖濃度的增加其對(duì)羥基自由基的清除能力隨之升高，且當(dāng)多糖濃度為1200 μg/mL時(shí)，其清除率達(dá)57.89%，而羥基自由基是人體內(nèi)最主要的自由基，其消除率是反映藥物抗氧作用的重要指標(biāo)。此實(shí)驗(yàn)表明款冬花多糖具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

圖4　多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

2.3.2超氧陰離子清除能力測(cè)定 由圖5可知，隨著款冬花多糖濃度的增大其清除超氧陰離子的能力也隨之增加，當(dāng)款冬花多糖濃度為時(shí)1200 μg/mL，清除率達(dá)47.85%，表明款冬花多糖具有較好的抗氧化活性。

圖5　多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用

3　討論

本論文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)，以提取的料液比、微波功率和微波時(shí)間為影響因素結(jié)合款冬花多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察多糖得率影響的主要因素次序?yàn)椋毫弦罕?微波時(shí)間>微波功率，篩選出款冬花多糖微波提取的最佳條件為：料液比為1∶30（g/mL），微波功率為600 W，微波時(shí)間為7 min，多糖得率為14.806%，與傳統(tǒng)水提及超聲提取比較，不但節(jié)約了時(shí)間，而且提高了多糖得率。另外，抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著款冬花多糖濃度的增加其分別對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除能力也隨之增加，具有一定的量效關(guān)系，說(shuō)明款冬花多糖具有一定的抗氧化活性。

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Study on Microwave-assisted Extraction and the Antioxidant Activeties of Polysaccharide from Tussilagofar-fara

SONG Xiao，DUAN Xi，TANG Zhi-shu，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：027-030

Objective：The microwave extraction process of polysaccharide from Tussilagofar-fara and its antioxidant activity were investigated.Method：Orthogonal test was carried out on the basis of single-factorexperiments to determine the optimum process parameters.Additional，the reducing power of Tussilagofar-fara polysaccharide and the clearance effect of hydroxyl radicals，superoxide anion were investigated.Result：The experimental results showed that the Tussilagofar-fara polysaccharide microwave assisted extraction optimum experiment conditions for the material liquid ratio was 1∶30 （g/mL），microwave power 600 W，extracting time was 7 min，and the crude polysaccharide yield was up 14.806%.With the increased of Tussilagofarfara polysaccharide concentration，its ability to scavenge hydroxyl radicals，superoxide anion also increased. Conclusion：Furthermore，the Tussilagofar-fara polysaccharide had better reducing power to scavenge hydroxyl radicals，superoxide anion and natural antioxidant.

Tussilagofar-fara； Polysaccharide； Microwave extraction； Antioxidant activity

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014JQ4146）；陜西省中藥制藥重點(diǎn)學(xué)科專(zhuān)項(xiàng)基金資助（1008）；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（1580）

①陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 陜西 咸陽(yáng) 712046

②陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

宋逍

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.008

2016-03-03） （本文編輯：蔡元元）