喬姝孫海鳳白強(qiáng)馬俊兵李雪飛解彩霞

胃腸癌貧血患者EPO、EPO-R和MVD的相關(guān)性研究*

喬姝①孫海鳳①白強(qiáng)①馬俊兵①李雪飛①解彩霞①

目的：探討胃腸癌貧血患者EPO、EPO-R和微血管密度（MVD）表達(dá)的關(guān)系。方法：對177例胃腸癌患者進(jìn)行常規(guī)方法檢測Hb、血漿EPO濃度，免疫組化法檢測EPO、EPO-R、MVD，并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果：（1）57例貧血患者的EPO水平明顯高于無貧血者（P<0.05）；血清EPO水平和Hb值呈明顯負(fù)相關(guān)（P<0.001）。（2）EPO、EPO-R陽性患者的MVD明顯高于EPO、EPO-R陰性患者（P<0.05）；MVD與EPO、EPO-R呈正相關(guān)（P<0.001）。結(jié)論：胃腸癌貧血患者的EPO水平明顯增高，并與Hb值呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系；EPO、EPO-R的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)。

胃腸癌； 貧血； 血紅蛋白； 促紅細(xì)胞生成素； 促紅細(xì)胞生成素受體； 微血管密度

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China

消化道腫瘤最常見的是胃癌和腸癌，而往往患者在病情處于晚期時就診者居多，且部分患者已并發(fā)貧血。胃腸癌貧血腫瘤相關(guān)性貧血（cancer related anemia，CRA）的發(fā)生率高達(dá)40%以上[1]。對于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或者不能手術(shù)切除的患者多采用以化療為主的綜合療法[2]。當(dāng)患者接受化療后發(fā)生貧血的幾率急劇增加，可上升至90%[3]。貧血是由多種原因引起外周血單位容積內(nèi)血紅蛋白（Hb）濃度、紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）及血細(xì)胞比容（HCT）低于本地區(qū)、相同年齡和性別的人群的參考值下限的一種癥狀。CRA主要是指腫瘤患者在其疾病的發(fā)展過程中以及治療過程中發(fā)生的貧血。近年來的多項研究證實腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)較多的實屬促紅細(xì)胞生成素（EPO），它可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育，引發(fā)惡性腫瘤組織中新生血管的生長。一項meta分析的研究結(jié)果表明，肺癌、頭頸癌、前列腺癌、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者較短的存活時間均與Hb的水平降低有關(guān)，患者合并貧血的死亡風(fēng)險高達(dá)54%～77%[4]。癌癥患者血紅蛋白濃度也是疾病發(fā)展的一個診斷因子，但是其潛在機(jī)制是復(fù)雜且未知的[5]。

胃腸癌患者最為常見的并發(fā)癥就是貧血，貧血與許多因素有關(guān)[6]，文獻(xiàn)對EPO、EPO-R相關(guān)性多有報道，而腫瘤性貧血與微血管密度（MVD）相關(guān)性分析結(jié)果報道不一。為了研究胃腸癌患者貧血與ERO、EPO-R濃度及MVD表達(dá)等關(guān)系。本案對177例胃腸癌患者的Hb、EPO血漿濃度及腫瘤組織ERO、EPO-R和MVD進(jìn)行了檢測和分析，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2012年7月-2014年8月本院住院的胃腸癌患者177例，其中男119例，年齡34～92歲，平均（63.78±10.98）歲；女58例，年齡34～92歲，平均（63.78±10.98）歲。根據(jù)我國血液學(xué)專業(yè)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以血紅蛋白值（Hb）男性<120 g/L、女性<110 g/L診斷為貧血。將患者按診斷標(biāo)準(zhǔn)分為貧血組57例和無貧血組120例，其中貧血組男36例，女21例，無貧血組男83例，女37例，兩組患者的性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=0.633，P=0.426），具有可比性。

1.2方法

1.2.1Hb檢測 清晨抽取患者靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝管中，在2 h內(nèi)應(yīng)用美國Beckman Coulter公司LH-750血細(xì)胞分析儀進(jìn)行Hb等血常規(guī)項目檢測。

1.2.2血清EPO檢測 抽取1.5 mL靜脈血置于K2-EDTA抗凝管中，使用全自動化學(xué)發(fā)光法免疫分析儀按照EPO檢測說明書（美國德普診斷產(chǎn)品有限公司）定量測定血清EPO的濃度。

1.2.3癌性組織EPO、Epo-R檢測

1.2.3.1SABC免疫組化法 制作石蠟標(biāo)本4～5 μm切片3～4張；烤箱溫度設(shè)置為60 ℃烘烤1 h。經(jīng)過二甲苯脫蠟三缸各10 min、無水乙醇二缸各5 min等不同濃度乙醇脫苯后水冼、水化。選1張進(jìn)行病理診斷復(fù)核，余分別按試劑盒說明書操作，經(jīng)過SABC染色，分別檢測MVD和EPO、EPO-R。陰性對照以PBS代替，陽性對照由試劑生產(chǎn)公司提供已知陽性切片。

1.2.3.2結(jié)果判定 測定MVD采用weidner等的評判標(biāo)準(zhǔn)方先低倍鏡（×40）掃視，確定FⅧ明顯棕褐色微血管最密集的標(biāo)記區(qū)，血管之間必須要有清楚的分離，與鄰近的腫瘤細(xì)胞、微血管及其他結(jié)締組織成分不相連，一條獨立的血管應(yīng)該是染色為棕黃色的EC或EC簇，對于染色標(biāo)記清晰且源于同一微血管的EC，也可作為獨立的MVD。計數(shù)結(jié)果換成高倍鏡（×200），結(jié)果以3個視野血管的均數(shù)表示。ERO、EPO-R計數(shù)：陽性細(xì)胞胞質(zhì)均呈棕黃色顆粒，至少觀察5個視野（×200），各計數(shù)100個細(xì)胞。參考值：陽性細(xì)胞<5%為陰性，>5%為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 對實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（±s）表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料比較采用x2檢驗，相關(guān)性分析用簡單相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EPO水平表達(dá)和Hb值的關(guān)系 貧血組患者的EPO水平為（50.06±18.97）mU/mL，明顯高于無貧血組的（24.23±9.40）mU/mL（t=11.700，P=0.000）。EPO水平和Hb值呈明 顯 負(fù) 相 關(guān)（r=-0.648，P<0.001）。

2.2EPO的表達(dá)與MVD的關(guān)系 貧血組57例中EPO表達(dá)陽性者有36例，MVD計數(shù)為（25.89±5.01）條；EPO表達(dá)陰性者21例，MVD計數(shù)為（16.36±8.01）條，EPO表達(dá)陽性組高于EPO表達(dá)陰性組，兩組比較差異有統(tǒng)計意義（t=2.040，P=0.000），見圖1。MVD與EPO呈正相關(guān)（r=0.400，P<0.001）。

圖1　EPO表達(dá)陽性組和陰性組MVD的比較

2.3EPO-R表達(dá)與MVD的關(guān)系 貧血組57例中EPO-R表達(dá)陽性者有54例，MVD計數(shù)為（30.18±9.87）條，EPO-R表達(dá)陰性者有3例，MVD計數(shù)為（13.69±4.50）條，EPO-R表達(dá)陽性組的MVD計數(shù)值明顯高于陰性組，比較差異有統(tǒng)計意義（t=1.970，P=0.000），見圖2。MVD與EPO-R呈正相關(guān)（r=0.600，P<0.001）。3 討論

圖2　EPO-R表達(dá)陽性組和陰性組MVD的比較

貧血是胃癌患者常見的并發(fā)癥，發(fā)病率較高的為胃癌，以輕度貧血和中度貧血為主，表現(xiàn)為正常細(xì)胞性貧血和小細(xì)胞性貧血，而且病程越長貧血發(fā)生越有可能。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期癌性患者貧血發(fā)生率明顯高于早期的癌性患者，因此臨床上可以根據(jù)胃癌患者貧血的發(fā)生及貧血程度初步估計胃癌患者的病理分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌灶大小及腫瘤浸潤深度，同時表明了腫瘤相關(guān)性貧血是影響胃癌患者的一個預(yù)后因素，可以作為評估胃癌患者預(yù)后的一項參考指標(biāo)[7]。

人體中的促紅細(xì)胞生成素是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成，是另一個會因腫瘤缺氧而啟動的靶基因，缺氧是其最強(qiáng)的誘導(dǎo)因子[9]。從而使血漿促紅細(xì)胞生成素（EPO）含量增加。EPO的水平與血液中的血紅蛋白的濃度呈負(fù)相關(guān)，但臨床檢驗醫(yī)學(xué)表明腫瘤患者血清EPO升高時，患者依然處于貧血狀態(tài)，常規(guī)思維補(bǔ)充EPO已無益處，限制了EPO在腫瘤性貧血中的應(yīng)用[10]。陳濤功等[11]的研究說明重組人促紅細(xì)胞生成素在治療腫瘤相關(guān)性貧血方面不良反應(yīng)小，效果也確切，值得在臨床上生產(chǎn)應(yīng)用。對于一些血透的貧血患者，為了防止缺鐵，在治療的過程中應(yīng)該適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充鐵元素。劉秋平等[12]的研究說明促紅細(xì)胞生成素可有效改善患者的代謝功能，另外，目前國內(nèi)外對重組人促紅細(xì)胞生成素治療腫瘤相關(guān)性貧血的劑量還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，只能根據(jù)病情的實際發(fā)展情況而定。但EPO對于其使用時機(jī)、劑量、頻次、生存的影響、潛在風(fēng)險及副作用等有許多不明確的地方，仍需臨床進(jìn)一步深入研究及探討[13]。

國內(nèi)外的研究報道已經(jīng)證實，ERO、促紅細(xì)胞生成素受體（EPO-R）在多種人類腫瘤中表達(dá)[14]，ERO、EPO-R表達(dá)陽性組的微血管密度（MVD）值明顯高于其陰性組，說明當(dāng)機(jī)體血紅蛋白降低時可激發(fā)EPO的增加進(jìn)而促進(jìn)紅細(xì)胞的生成；血紅蛋白濃度上升。而當(dāng)血紅蛋白增高時，EPO的分泌減少，形成了一個負(fù)反饋的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究通過計學(xué)分析，得出結(jié)論為ERO、EPO-R表達(dá)陽性組的MVD計數(shù)高、陰性組計數(shù)低，說明ERO、EPO-R的表達(dá)和腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)，也可能是腫瘤血管生成的一個促進(jìn)因素，與Ribatti等[15]研究報告一致，他的研究報道了胃癌組織內(nèi)皮細(xì)胞EPO-R的表達(dá)與新生血管生成程度具有相關(guān)性。Rózsás等[16]認(rèn)為腫瘤患者內(nèi)源性EPO升高，可能是EPO受體對EPO產(chǎn)生耐受，EPO受體對EPO刺激的閾值大大提高，不能充分利用 因此，臨床通過補(bǔ)充EPO來特異性刺激早期紅細(xì)胞祖細(xì)胞，提高造血速度并降低EPO受體刺激閾值，增強(qiáng)骨髓反應(yīng)性，是外源性EPO治療腫瘤性貧血的主要機(jī)制。劉飛德[17]證明了EPO-R在腫瘤中的高表達(dá)，與血漿內(nèi)EPO特異性結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，形成功能成熟的紅細(xì)胞，促使紅細(xì)胞增生，腫瘤血管分芽，增殖生長，起到了對血管生成的營養(yǎng)作用，又為腫瘤的自身維持和生長提供了不可或缺的條件，從而促進(jìn)腫瘤演進(jìn)，浸潤和轉(zhuǎn)移。

對于惡性實體腫瘤的生長侵襲最為重要的根源就是新血管生成。通過臨床檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的MVD明顯高于周圍正常組織。目前，用以表明腫瘤組織中新生血管程度常以計數(shù)腫瘤中MVD作為主要指標(biāo)，大多數(shù)研究者認(rèn)為腫瘤組織的MVD與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切。腫瘤中新生的血管數(shù)量越多，癌組織發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性就越大。腫瘤組織中MVD值高是預(yù)后差的一個指標(biāo)[18]。

綜上所述，導(dǎo)致大多數(shù)腫瘤患者發(fā)生貧血的原因是由于惡性腫瘤在人體組織中生長迅速從而增加了機(jī)體的負(fù)荷。因此為提高患者的生活質(zhì)量，臨床上需積極治療癌性患者貧血。對于癌性貧血的治療主要有：輸注紅細(xì)胞懸液（補(bǔ)充紅細(xì)胞）、使用rh-EPO治療、補(bǔ)充鐵和維生素。但近幾年來的報道認(rèn)為rh-EPO有可能直接或間接的促進(jìn)腫瘤血管的新生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展及浸潤[19-20]。因此可將貧血、ERO、EPO-R的表達(dá)與血管新生的關(guān)系可以概括為腫瘤組織內(nèi)部缺氧，使瘤細(xì)胞內(nèi)許多缺氧反應(yīng)基因作出反應(yīng)，使ERO、EPO-R VEGF（血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子）等分子的信號轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[21]，從而誘導(dǎo)和促進(jìn)腫瘤血管的新生。

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Correlation Study between ERO，EPO-R and MVD on Patients with Gastrointestinal Cancer Anemia

QIAO Shu，SUN Hai-feng，BAI Qiang，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：009-012

Objective：To discuss the relationship between EPO，EPO-R and microvascular density （MVD） expression on patients with gastrointestinal cancer anemia.Method：Used conventional methods to detect Hb and serum EPO concentration，EPO，EPO-R and MVD was detected by immunohischemical method for 177 patients with gastrointestinal cancer.Finally correlation analysis was carried on.Result：（1）EPO levels of 57 patients with anemia was obviously higher than that of Hb in without-anemia（P<0.05）.There was obvious negative correlation between serum EPO level and Hb values（P<0.001）.（2）MVD of EPO and EPO-R express positive patients was obviously higher than that of negative patients（P<0.05）. There was obvious positive correlation between EPO and EPO-R and MVD（P<0.001）.Conclusion：The Epo levels were increased significantly on patients with gastrointestinal cancer anemia and it’s relationship with Hb are significantly negative correlation. The expression of EPO，EPO-R and MVD were positively correlated.

Gastrointestinal cancer； Anemia； Hemoglobin； Erythropoietin； Erythropoietin receptor； Microvascular density

內(nèi)蒙古包頭社會發(fā)展科技支撐項目（2014S2003-5-8）

①包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 內(nèi)蒙古 包頭 014010

喬姝

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.003

2016-03-04） （本文編輯：蔡元元）