宋燕郡于維森殷凡宋揚(yáng)

腺嘌呤、鳥嘌呤致高尿酸血癥大鼠肝臟損害的研究*

宋燕郡①于維森②殷凡②宋揚(yáng)①

目的：觀察腺嘌呤、鳥嘌呤作用高尿酸血癥大鼠肝臟時，肝臟功能變化情況及透射電鏡下肝臟超微結(jié)構(gòu)的變化。方法：選用實(shí)驗(yàn)用雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為A組（對照組）、B組（造模對照組）、C組（腺嘌呤組）、D組（腺嘌呤淀粉糊組）、E組（腺嘌呤、鳥嘌呤組）、F組（鳥嘌呤組），每組6只。B、C、D、E、F組連續(xù)給予酵母浸膏溶液15 g/（kg·d）灌胃7 d，誘導(dǎo)高尿酸血癥代謝模型。造模成功后，B組給予淀粉糊灌胃，C組給予20 mg/（kg·d）腺嘌呤淀粉糊混合液灌胃，D組給予10 mg/（kg·d）腺嘌呤淀粉糊混合液灌胃，E組10 mg/（kg·d）腺嘌呤混合10 mg/（kg·d）鳥嘌呤淀粉懸液灌胃，F(xiàn)組給予20 mg/（kg·d）鳥嘌呤淀粉糊混合液灌胃。持續(xù)14 d后，測定各組大鼠血清ALT、AST、UA，并作肝臟組織電鏡切片觀察肝臟損傷情況。結(jié)果：（1）電鏡下觀察C組溶酶體明顯增多，分散在細(xì)胞核周圍，并有深色顆粒物質(zhì)。D組溶酶體數(shù)量略有增多，脂滴增多，開始進(jìn)入溶酶體。E組溶酶體增多，脂滴增多，出現(xiàn)深色顆粒狀物質(zhì)。F組膽小管中有少量深色顆粒狀物質(zhì)。（2）C～F組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；C～E組血尿酸值與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C、D、E組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血尿酸水平均高于F組。結(jié)論：腺嘌呤、鳥嘌呤對高尿酸血癥大鼠的肝臟均有損害，腺嘌呤損害作用較大。腺嘌呤致使大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高，其作用高于同等劑量的鳥嘌呤。腺嘌呤對大鼠血尿酸水平有明顯作用。

腺嘌呤； 高尿酸血癥； 鳥嘌呤； 肝臟損害； 超微結(jié)構(gòu)

First-author’s address：Qingdao University Medical College Public Health School，Qingdao 266021，China

高尿酸血癥是痛風(fēng)的發(fā)病前兆，它指的是血液中尿酸濃度高出正常范圍的一種機(jī)體狀態(tài)[1]。痛風(fēng)及高尿酸血癥好發(fā)于男性中老年人群，其患病率與年齡增長呈逐正相關(guān)[2-4]。伴隨生活水平的提高及居民飲食結(jié)構(gòu)的變化，亞洲地區(qū)無癥狀高尿酸血癥及痛風(fēng)的發(fā)病率逐漸升高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢[3，5]。其產(chǎn)生的兩大主要原因是，尿酸排泄減少以及嘌呤代謝障礙[6]。目前研究多認(rèn)為，高尿酸血癥的發(fā)生，多是由于體內(nèi)細(xì)胞的DNA 分解代謝、產(chǎn)生的嘌呤代謝障礙[7-9]。腺嘌呤、鳥嘌呤是構(gòu)成人類及大鼠DNA的主要嘌呤。本實(shí)驗(yàn)通過研究腺嘌呤、鳥嘌呤的不同組合對大鼠肝臟功能及肝臟超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，初步探究兩者對肝臟的損傷程度差異及兩者間有無相互作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性Wistar大鼠36只（青島市實(shí)驗(yàn)動物和動物實(shí)驗(yàn)中心提供），體質(zhì)量（230±20）g。

1.2主要儀器與試劑 OLMPUS AU2700Beckman全自動生化分析儀（日本OLMPUS公司），JEM-1200EX透射電鏡（日本JEOL公司）。腺嘌呤V900471-25G（美國Sigma公司），鳥嘌呤V900473-25G（美國Sigma公司），酵母浸膏（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，批號20140320）。ALT、AST、UA試劑盒（上?？迫A診斷用品有限公司）。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及動物模型制備 雄性Wistar大鼠36只，按體重隨機(jī)分為六組，每組6只。環(huán)境溫度保持在15～24 ℃，相對濕度45%～55%，晝夜各12 h。實(shí)驗(yàn)動物給予普通大鼠顆粒飼料，自由取食。A組為空白對照組。B、C、D、E、F組每天給予酵母浸膏15 g/（kg·d）灌胃，持續(xù)7 d，制備高尿酸血癥模型[10-12]。B組為造模對照組，每天給予實(shí)驗(yàn)組同體積的淀粉糊（濃度40 g/L）灌胃。C組腺嘌呤組，給予腺嘌呤20 mg/（kg·d）與混合淀粉糊灌胃。D組腺嘌呤淀粉糊組，給予腺嘌呤10 mg/（kg·d）與混合淀粉糊灌胃。E組腺嘌呤鳥嘌呤組，給予腺嘌呤10 mg/（kg·d）與鳥嘌呤10 mg/（kg·d）混合淀粉糊灌胃。F組鳥嘌呤組，給予鳥嘌呤20 mg/（kg·d）與混合淀粉糊灌胃。實(shí)驗(yàn)持續(xù)14 d，末次灌胃后12 h進(jìn)行剪尾采血，分離血清。并取肝臟組織，低溫下將組織修成1 mm×1 mm×2 mm大小長條形，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛中保存。

1.3.2透射電鏡觀察 將肝組織樣品切至1 mm× 1 mm×1 mm大小，至于2.5%戊二醛固定4 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，10 min/次；1%鋨酸固定1 h，pH 7.3；0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，10 min/次；丙酮脫水，在30%、50%、70%、80%、90%丙酮中依次脫水10 min，100%丙酮脫水3次，10 min/次；丙酮溶液，環(huán)氧樹脂（EPON812）包埋劑混合液（2∶1）浸透0.5 h；丙酮溶液，環(huán)氧樹脂（EPON812）包埋劑混合液（1∶2）浸透1.5 h；將樣品移到EPON812包埋劑中，溫箱固化。37、45、60 ℃ 24 h超薄切片機(jī)（Ultracue E）切片，厚度為1～10 μm，將切下的片子轉(zhuǎn)移到干凈的滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，切片展平，干燥后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡觀察定位。超薄切片機(jī)（Ultracue E）切片至厚度50～70 nm；醋酸雙氧鈾染色15 min后，徹底水洗3次；檸檬酸鉛染色15 min后徹底水洗3次；透視電鏡下觀察。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用配對t檢驗(yàn)或單因素方差分析，兩兩比較采用HSD檢驗(yàn)法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血清尿酸值變化 B～F組初始與造模后的血尿酸值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示造模成功，見表1。

表1　各組大鼠造模前后血清尿酸值（±s） μmol/L

表1　各組大鼠造模前后血清尿酸值（±s） μmol/L

*與初始比較，P<0.05

組別　初始　造模后A組（n=6）　158.17±18.08　166.17±11.60 B組（n=6）　156.50±15.35　208.83±15.14*C組（n=6）　161.83±16.02　226.83±19.05*D組（n=6）　153.17±7.94　221.83±14.74*E組（n=6）　155.67±27.64　234.83±8.30*F組（n=6）　169.00±17.25　210.50±37.69*

2.2各組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血尿酸比較 C～F組谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶值與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C～E組血尿酸值與B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C、D、E組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血尿酸水平均高于F組，見表2。

表2　各組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血尿酸比較（±s）

表2　各組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血尿酸比較（±s）

組別　ALT（IU/L）　AST（IU/L）　UA（μmol/L）A組（n=6）　58.17±1.94　167.83±2.23　165.67±11.34 B組（n=6）　73.00±2.34　198.33±4.80　208.83±12.29 C組（n=6）　136.67±2.07　308.17±9.80　294.83±13.30 D組（n=6）　109.33±2.34　279.17±3.97　267.67±9.37 E組（n=6）　93.67±2.07　251.50±6.35　244.67±7.76 F組（n=6）　83.83±2.79　221.83±8.50　214.00±11.37

2.3各組大鼠肝臟透射電鏡觀察情況 A組肝臟細(xì)胞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核核膜邊界清晰完整，線粒體結(jié)構(gòu)正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常，有少量脂滴分布（圖1）。B組肝臟細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常（圖2）。C組溶酶體、脂滴明顯增多，分散在細(xì)胞核周圍，并有深色顆粒物質(zhì)（圖3）。D組溶酶體數(shù)量略有增多，脂滴增多，開始進(jìn)入溶酶體（圖4）。E組溶酶體增多，脂滴增多，出現(xiàn)深色顆粒狀物質(zhì)（圖5）。F組膽小管中有少量深色顆粒狀物質(zhì)（圖6）。

圖1　A組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×6000）

圖2　B組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×20000）

圖3　C組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×10000）

圖4　D組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×20000）

圖5　E組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×20000）

圖6　F組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×60000）

3 討論

高尿酸血癥是一種嘌呤代謝紊亂癥狀，并且是痛風(fēng)的前兆表現(xiàn)。它指的是血液中尿酸濃度高出正常范圍的一種機(jī)體狀態(tài)[13]。本實(shí)驗(yàn)通過連續(xù)灌胃酵母浸膏溶液，造模高尿酸血癥大鼠模型[10-12]，造模后大鼠體重較重，飲食飲水正常。經(jīng)檢驗(yàn)，造模后血檢血尿酸值與初始水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對比均值，造模后血尿酸值明顯增高。

實(shí)驗(yàn)中，分組施加處理因素后，大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。根據(jù)各組均值比較，結(jié)果表明，腺嘌呤致使大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高，其作用高于同等劑量的鳥嘌呤。腺嘌呤鳥嘌呤混合作用時，其谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平低于腺嘌呤淀粉糊組，不能排除鳥嘌呤與腺嘌呤之間存在相互作用的可能性。大鼠血尿酸結(jié)果顯示，鳥嘌呤對實(shí)驗(yàn)中大鼠的血尿酸水平的影響小于腺嘌呤，對比可見腺嘌呤對血尿酸水平有明顯作用。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)造模后的高尿酸血癥大鼠，在灌胃不同濃度的腺嘌呤、鳥嘌呤后，均有不同程度的變化。其中，單純施加鳥嘌呤的大鼠，超微結(jié)構(gòu)改變較輕，與正常大鼠肝臟形態(tài)較為接近。結(jié)合血清檢測指標(biāo)，可以看出鳥嘌呤對高尿酸血癥大鼠的肝臟損害較輕。實(shí)驗(yàn)中，C、D、E三組大鼠分別施加了不同程度的腺嘌呤，三組大鼠的透射電鏡切片可看到較為清晰的結(jié)構(gòu)改變。結(jié)合血清檢測可以看出，腺嘌呤對高尿酸血癥大鼠的肝臟有一定的毒性作用。主要表現(xiàn)在溶酶體不同程度的增多，脂滴進(jìn)入溶酶體，并引起溶酶體破裂。膽小管處有深色顆粒狀物質(zhì)沉積。其中C組腺嘌呤組的腺嘌呤施加量最多，肝臟超微結(jié)構(gòu)的改變也最為明顯。

腺嘌呤是一種含氮雜環(huán)嘌呤類化合物，在體內(nèi)代謝的最終產(chǎn)物為尿酸[14-15]。大鼠進(jìn)行腺嘌呤灌胃后，磷酸核糖焦磷酸和/或谷酰胺增加，谷酰胺磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)移酶及黃嘌呤氧化酶活性亦增加，促進(jìn)尿酸合成，進(jìn)一步加重高尿酸血癥大鼠尿酸代謝負(fù)荷[16-18]，致使實(shí)驗(yàn)組大鼠肝腎損傷。另外，腺嘌呤在體內(nèi)代謝時，黃嘌呤氧化酶介導(dǎo)的氧自由基生成增加，亦可引發(fā)肝臟損傷[19-20]。以往研究發(fā)現(xiàn)腺嘌呤對大鼠腎臟的影響較為明顯[14，16-17]，本實(shí)驗(yàn)中研究肝臟超微結(jié)構(gòu)變化，亦有相似之處。有關(guān)腺嘌呤與鳥嘌呤之間的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，建議高尿酸血癥及痛風(fēng)患者的飲食指導(dǎo)中，控制嘌呤攝入總量的基礎(chǔ)上，控制腺嘌呤的攝入量。對痛風(fēng)患者的并發(fā)癥及其他慢性癥狀的控制有較好的作用。

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Studies of Hepatic Lesion on Hyperuricemia Rat-model Induced by Adenine and Guanine

SONG Yan-jun，YU Wei-sen，YIN Fan，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：013-016

Objective：To observe adenine and guanine effect liver function of hyperuricemia-model rat，and the changes under ultra microstructure.Method：The 36 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups （A-control group，B-model group，C-adenine group，D-adenine starch paste group，E-adenine and guanine group，F(xiàn)-guanine group），each group of 6 cases.Groups B， C， D， E， F continuously given Yeast Extract Solution 15 g/（kg·d） to fill the stomach，7 days induced hyperuricemia-model rats.After the success of the building，group B for starch paste to fill the stomach.Group C：20 mg/（kg·d） adenine starch paste mixture.Group D：10 mg/（kg·d） adenine starch paste mixture.Group E：10 mg/（kg·d） adenine mixed 10 mg/（kg·d） guanine starch suspension.Group F：20 mg/（kg·d） guanine starch paste mixture to fill the stomach.For 14 days，the determination serum ALT，AST，UA and liver tissue electron microscope observation of liver injury of each group rats.Result：（1）Ultra microstructure observation the lysosome of group C increased obviously，scattered around the nucleus，and had dark grain material.Group D lysosome amount increased slightly，increased lipid drops，enter the lysosome.Group E the amount of lysosome increasing， increased lipid droplets， appear dark granular material.Group F bile duct in a small dark granular material.（2）ALT，AST of C-F groups were compared with group B，the differences were statistically significant（P<0.05），UA of C-E groups were compared with group B，the differences were statistically significant（P<0.05）.And ALT，AST，UA levels of group C，D，E were higher than group F.Conclusion：Adenine and guanine both lead to liver damage of hyperuricemia-model rats. Adeninecause ALT and AST levels significantly in hyperuricemia-model rats， the effect is higher than the same dose of guanine.Adenine has obvious effect to rat blood uric acid levels.

Adenine； Hyperuricemia； Guanine； Liver damage； Ultra microstructure

青島市衛(wèi)計(jì)委立項(xiàng)項(xiàng)目（2010-WSZD099）

①青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 山東 青島 266021

②山東省青島市疾病預(yù)防控制中心

宋揚(yáng)

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.004

2016-04-12） （本文編輯：蔡元元）