姚恩輝黃津華周振智方軍石黎明葉洪

LOX-1受體啟動子基因調(diào)控及其抗大鼠腎臟損害的作用*

姚恩輝①黃津華①周振智①方軍①石黎明①葉洪①

目的：研究吡咯-咪唑聚酰胺（PIP）對凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）受體啟動子基因的調(diào)控，并探討其對抗大鼠腎臟損害的作用。方法：雄性SD大鼠50只，按隨機數(shù)字法將大鼠分為五組，每組10只。A組：普通飼料，未用PIP。B組：高脂飼料（含3%膽固醇+10%豬油），未用PIP。C組：高脂飼料，PIP干預組，C1組按10 μg/（kg·d）靜脈注射；C2組按5 μg/（kg·d）靜脈注射。D組：高脂飼料，他汀干預組，瑞舒伐他汀5 mg/（kg·d）灌胃給藥。治療時間均為8周。檢測腎組織LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平，測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，測定24 h尿蛋白定量、血尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）水平。結(jié)果：C1組、C2組大鼠腎組織LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平均較B組低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；C1組、C2組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平與B組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；C1組、C2組大鼠24 h尿蛋白定量較B組明顯降低（P<0.01），而血BUN、Scr水平與A組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：PIP化合物能明顯下調(diào)高脂血癥大鼠腎組織LOX-1 mRNA表達，改善腎功能及抑制腎臟損害。

凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1； 吡咯-咪唑聚酰胺； 腎臟損害

First-author’s address：Union Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China

脂質(zhì)代謝紊亂是慢性腎臟病進展的獨立危險因素。脂質(zhì)異?？墒鼓I組織內(nèi)生物代謝紊亂、血流動力學及流變學改變，導致并加重蛋白尿和腎臟病理變化[1]。研究報道，氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）在腎臟病的發(fā)病機制中起關(guān)鍵性作用。凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）是OX-LDL的膜受體，分布于腎小球內(nèi)皮細胞、腎小球系膜細胞及腎組織間隙細胞等，并在高膽固醇血癥時表達顯著上調(diào)[2]。LOX-1通過與OX-LDL特異性結(jié)合介導腎臟損傷的病理過程，包括誘導黏附因子和炎癥因子表達、加劇局部炎癥等作用。針對LOX-1的吡咯-咪唑聚酰胺（PIP）是一種人工合成的小分子化合物，能特異性結(jié)合于LOX-1受體啟動子基因，有效抑制LOX-1基因表達[3]。本實驗觀察針對LOX-1的PIP對高脂血癥大鼠腎組織LOX-1基因表達的影響及其抗腎臟損害的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠50只，體重160～200 g。以數(shù)字法將大鼠隨機分為五組，每組10只。五組大鼠在體重及其他方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.01），具有可比性。A組：普通飼料，未用PIP。B組：高脂飼料（含3%膽固醇+10%豬油），未用PIP。C組：高脂飼料，PIP干預組，C1組按10 μg/（kg·d）靜脈注射；C2組按5 μg/（kg·d）靜脈注射。D組：高脂飼料，他汀干預組，瑞舒伐他汀5 mg/（kg·d）灌胃給藥。治療時間均為8周。

1.2檢測方法

1.2.1標本留取 實驗期間，每兩周采用套尾法測量血壓，以及代謝籠采集24 h尿液各一次。血漿和腎臟標本在苯巴比妥麻醉狀態(tài)下采集，其中腎組織首先行生理鹽水灌注沖洗，然后切片放入10%福爾馬林（pH 7.4）固定，石蠟包埋，用于組織學檢查。剩余腎組織放入液氮冷凍或-80 ℃深低溫冰箱保存。

1.2.2Real-time PCR 提取總RNA，合成cDNA文庫，通過Real-time PCR檢測腎皮質(zhì)LOX-1 mRNA表達水平，以及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表達水平。

1.2.3血液生化學及尿液檢測 試驗結(jié)束前，取血測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。測定24 h尿蛋白定量、血尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）水平。測定血漿鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）和醛固酮水平。

1.2.4組織PIP含量分析 取肝、腎、肺、心臟及脂肪組織，制成勻漿，化學方法粗提PIP，高效液相色譜分析PIP。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，比較采用F檢驗，計數(shù)資料比較采用x2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1PIP對大鼠腎組織LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA表達水平的影響 B組大鼠腎組織LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA水平均較A組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。C1組、C2組及D組大鼠腎組織LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA水平較B組低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1。

表1　五組大鼠腎LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA水平比較（±s）

表1　五組大鼠腎LOX-1 mRNA、MMP-9 mRNA水平比較（±s）

*與A組比較，P<0.01；△與B組比較，P<0.01

組別　LOX-1 mRNA　MMP-9 mRNA A組（n=10）　1.31±0.11　1.21±0.19 B組（n=10）　2.83±0.23*2.64±0.31*C1組（n=10）　1.33±0.16△　1.41±0.12△C2組（n=10）　1.62±0.21△　1.73±0.23△D組（n=10）　1.65±0.29△　1.61±0.24△

2.2PIP對大鼠血脂水平的影響 B組大鼠血清TC、TG、LDL-C含量均較A組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而HDL-C水平較A組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。C1組、C2組大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平與B組比較無明顯差異（P>0.05）。見表2。

表2　五組大鼠血脂水平的比較（±s） mmol/L

表2　五組大鼠血脂水平的比較（±s） mmol/L

組別　TC　TG　HDL-C　LDL-C A組（n=10）1.96±0.32　0.45±0.07　1.43±0.21　0.82±0.13 B組（n=10）3.98±1.12*0.82±0.08*0.75±0.12*2.70±0.07*C1組（n=10）3.82±1.01　0.83±0.18　0.71±0.05　2.69±0.06 C2組（n=10）3.87±0.56　0.84±0.14　0.73±0.08　2.71±0.08 D組（n=10）2.57±0.25△0.78±0.09　1.02±0.13△1.85±0.04△

2.3PIP對大鼠24 h尿蛋白定量、血BUN及Scr水平的影響 B組大鼠24 h尿蛋白定量較A組明顯升高（P<0.01）。C1組、C2組及D組大鼠24 h尿蛋白定量較B組均明顯降低（P<0.01）。C1組、C2組大鼠血BUN、Scr水平與A組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

表3　五組大鼠24 h尿蛋白定量、血BUN及Scr比較（±s）

表3　五組大鼠24 h尿蛋白定量、血BUN及Scr比較（±s）

*與A組比較，P<0.01；△與B組比較，P<0.01

BUN （mmol/L）A組（n=10）　11.02±1.82　40.11±3.83　5.09±1.19 B組（n=10）　23.83±3.75*43.96±4.35　5.37±1.45 C1組（n=10）　12.26±3.12△　41.47±6.32　5.20±1.13 C2組（n=10）　15.63±2.74△　42.45±5.96　5.32±1.31 D組（n=10）　14.01±2.35△　41.22±4.61　5.24±1.37組別　24 h尿蛋白定量（mg/24 h）Scr （μmol/L）

2.4PIP對大鼠血漿Na+、K+及醛固酮水平的影響 C1組、C2組、D組大鼠Na+、K+及醛固酮水平與A組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

表4　五組大鼠血漿Na+、K+及醛固酮水平比較（±s）

表4　五組大鼠血漿Na+、K+及醛固酮水平比較（±s）

組別　Na+（mmol/L）　K+（mmol/L） 醛固酮（pmol/L）A組（n=10）　140.12±9.37　4.01±1.61　38.84±12.13 B組（n=10）　143.49±11.71　4.09±1.17　39.31±13.26 C1組（n=10）　141.43±10.56　3.96±1.06　37.69±9.87 C2組（n=10）　142.76±13.38　4.04±1.09　38.22±10.25 D組（n=10）　141.18±10.49　3.97±0.95　37.81±10.79

3　討論

脂質(zhì)代謝紊亂是造成腎臟損傷的獨立危險因素。動物實驗研究顯示[4-5]，高膽固醇飲食使腎臟疾病惡化。氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）被認為與腎臟疾病的進展密切相關(guān)[6]。血漿LDL水平升高時，由于氧自由基及其代謝產(chǎn)物的作用，使LDL發(fā)生氧化成為OX-LDL。OX-LDL可活化內(nèi)皮細胞和系膜細胞等，導致內(nèi)皮通透性增加、內(nèi)皮功能損傷，促進細胞因子和生長因子分泌，最終導致細胞損傷[7-8]。

LOX-1是一種單鏈跨膜蛋白，屬C型選擇素家族。LOX-1除了分布于內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞外，還分布在腎小球內(nèi)皮細胞、腎小球系膜細胞及腎組織間隙細胞等。LOX-1是OX-LDL的膜受體，通過與OX-LDL特異性結(jié)合介導腎臟損傷的病理過程，包括誘導黏附因子和炎癥因子表達、加劇局部炎癥等作用[9-13]。本研究結(jié)果顯示，高脂血癥大鼠腎組織中LOX-1 mRNA表達水平明顯升高，表明在高脂血癥的病理狀態(tài)下，大鼠腎組織LOX-1表達水平顯著上調(diào)，參與介導腎臟損傷過程。

吡咯-咪唑聚酰胺（PIP）是一種新型的小分子化合物，它能不借助載體進入細胞核，特異性結(jié)合于相關(guān)啟動子基因的DNA序列中，阻止基因啟動子序列與相應的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，而從源頭上抑制目的基因的表達。目前已經(jīng)合成了多種特異性PIP，用于冠心病、動脈粥樣硬化、腎病等疾病的實驗研究[3，14-15]。本研究應用針對LOX-1的PIP進行干預，結(jié)果顯示，針對LOX-1的PIP可顯著抑制高脂血癥大鼠腎組織LOX-1 mRNA表達，表明針對LOX-1 的PIP能明顯下調(diào)腎組織LOX-1受體啟動子基因的活性，起到有效調(diào)控LOX-1基因表達的目的。

本研究結(jié)果顯示，高脂飲食組大鼠24 h尿蛋白定量較普通飲食組明顯升高，表明高脂組大鼠腎功能下降，存在腎臟損傷。應用針對LOX-1的PIP干預后，可顯著減少高脂組大鼠24h尿蛋白定量，提示針對LOX-1的PIP能有效減輕腎臟損害，保護腎功能。

綜上所述，合成的PIP化合物能明顯下調(diào)高脂血癥大鼠腎組織LOX-1 mRNA表達，改善腎功能及抑制腎臟損害，具有一定的腎臟保護作用。

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The Effects of LOX-1 Receptor Gene Promoter Regulation on the Rat Renal Injury

YAO En-hui，HUANG Jin-hua，ZHOU Zhen-zhi，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：017-020

Objective：To explore the regulative effects of pyrrole-imidazole polyamide （PIP） on the lectin-like oxidized Low-density lipoprotein receptor-1（LOX-1）receptor gene promoter，and to analyze the effects of PIP on the rat renal injury.Method：The 50 male Sprague Dawley rats were randomly divided into five groups with 10 rats in each group：group A，normal diet，no PIP；group B，high-fat diet，no PIP；group C1，high-fat diet，PIP 10 μg/（kg·d）i.v.；group C2， high-fat diet，PIP 5 μg /（kg·d）i.v.；group D，highfat diet，rosuvastatin 5 mg/（kg·d）intragastric administration.At the 8thweek，the mRNA expressions of LOX-1 and MMP-9 in renal tissue were detected by real-time PCR. The levels of serum cholesterol （TC），triglycefide （TG），HDL-C and LDL-C were measured.The 24 hour urine protein excretion，serum BUN and Scr were measured.Result：Compared with group B，the mRNA expressions of LOX-1 and MMP-9 were significantly decreased in the rat kidney of group C1 and C2（P<0.01）.Compared with group B，the serum TC，TG，HDL-C and LDL-C had no statistical differences in group C1 or C2（P>0.05）.Compared with group B，the levels of 24 hour urine protein excretion were significantly decreased in the rats of group C1 and C2（P<0.01），but the serum BUN and Scr had no statistical differences compared with group A（P>0.05）.Conclusion：The expression of LOX-1 mRNA was significantly decreased by the PIP in the kidney of high-fat diet rats，which may be involved in the inhibition of the renal injury.

Lectin-like oxidized Low-density lipoprotein receptor-1； Polyamide； Renal injury

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.005

福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題資助（2012-CX-19）

①福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院 福建 福州 350001

姚恩輝

2016-02-22） （本文編輯：蔡元元）