丘　琴，甄漢深，陳明偉，黃培倩，2，范秀春

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001；2. 欽州市中醫(yī)院，廣西欽州535000)

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壯藥龍利葉莖HPLC指紋圖譜研究

丘琴1，甄漢深1，陳明偉1，黃培倩1，2，范秀春1

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001；2. 欽州市中醫(yī)院，廣西欽州535000)

摘要：采用高效液相色譜法建立了壯藥龍利葉莖的HPLC指紋圖譜。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.08%醋酸溶液(體積比)為流動相，梯度洗脫，檢測波長為280 nm，柱溫為25 ℃，流速為1 mL/min，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004A版)進(jìn)行分析。結(jié)果表明10批龍利葉莖的HPLC指紋圖譜共標(biāo)定14個共有指紋峰，相似度均達(dá)到0.9以上，為建立龍利葉質(zhì)量控制方法提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：龍利葉莖；指紋圖譜；高效液相色譜

龍利葉，又名龍脷葉、牛耳葉、龍舌葉、龍味葉，來源于大戟科守宮木屬植物龍利葉Sauropus rostratusMiq. [Sauropus Spatuli foliusBeille]，為常綠小灌木[1-2]，主產(chǎn)于廣西、廣東等地[3]，為廣西常用壯藥之一，常用來治療咽喉炎，可和多種中藥合用，在壯族民間常作湯飲、涼茶。其各個部位均可藥用，具有清熱止咳、潤肺化痰之功效，可用于痰火咳嗽、喉痛、急性支氣管炎、上呼吸道炎癥、支氣管哮喘、肺結(jié)核咳嗽、大便秘結(jié)等[2-4]，現(xiàn)代藥理研究表明其具有較好的抗炎和鎮(zhèn)痛作用[5-6]。但尚未見對龍利葉指紋圖譜進(jìn)行研究的公開報道。本文對龍利葉莖的指紋圖譜進(jìn)行研究，為龍利葉的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)儀器、材料與藥品

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)，色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；CG-16W高速微量離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯)；SB3200T超聲波清洗儀(上海能信超聲有限公司)；B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；MilliporeSimplicity-185超純水儀(美國密里博公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料與藥品

10批采自不同產(chǎn)地的龍利葉莖藥材，經(jīng)廣西一心藥業(yè)馬利飛副主任藥師鑒定為大戟科守宮木屬植物龍利葉Sauropus rostratusMiq. [Sauropus Spatuli foliusBeille]的莖，藥材編號及產(chǎn)地對應(yīng)關(guān)系見表1。藥材陰干，粉碎為粗粉。

甲醇、乙腈(美國Fisher試劑公司，色譜純)；水為超純水；槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院)；其他試劑均為分析純。

表1　不同產(chǎn)地龍利葉莖藥材

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1內(nèi)標(biāo)參照物溶液的制備

精密稱定0.54mg槲皮素對照品，置5mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，得濃度為0.108g/L槲皮素對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備

取過4號篩(孔徑0.25mm)的龍利葉莖藥材粗粉0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇20.00mL，密塞，回流提取30min后放冷，補(bǔ)重，加入5mL30%鹽酸(體積比)酸化后回流提取30min，放冷，過濾，濾液置蒸發(fā)皿中，揮干溶劑，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2mL容量瓶中，加入0.8mL內(nèi)標(biāo)參照物溶液，所得的混合溶液用甲醇稀釋定容至2mL，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3色譜條件

色譜柱：AgilentEclipseXDB-C18；檢測波長：280nm；流速：1mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10μL；流動相：乙腈(B)-0.08%醋酸(體積分?jǐn)?shù))，梯度洗脫(0～16min，5∶95～13∶87B(體積比，余同)；16～18min，13∶87～17.5∶82.5B；18～35min，17.5∶82.5～26∶74B；35～38min，26∶74～32∶68B；38～41min，32∶68～35∶65B；41～61min，35∶65～45∶55B；61～70min，45∶55～50∶50B；70～90min，50∶50～70∶30B)。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，按2.3節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄圖譜，結(jié)果表明：各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.21%，相對峰面積的RSD為0.28%～1.61%，均小于3%，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.4.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，按2.3節(jié)色譜條件分別在第0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.46%，相對峰面積的RSD為0.19%～2.12%，均小于3%，表明供試液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一產(chǎn)地藥材，分別制備6份供試品，以2.3節(jié)下色譜條件測定，結(jié)果表明：各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.17%，相對峰面積的RSD為0.07%～1.22%，均小于3%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

3指紋圖譜與共有峰的確定

采用國家藥典頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2004A版計算機(jī)軟件對指紋圖譜進(jìn)行自動匹配，共標(biāo)定共有指紋峰14個，以中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，系統(tǒng)依據(jù)龍利葉莖藥材的共有模式生成對照指紋圖譜(圖1)。匹配的相關(guān)參數(shù)見表2、表3。

圖1　龍利葉莖藥材指紋圖譜共有模式Fig.1　The common model of the test sample fingerprint

編號12345678910RSD/%10.09100.09050.09030.09030.09060.09030.09060.09030.09040.09020.253120.16950.16950.17010.16930.16930.16930.16930.16950.16940.16940.150730.19390.19970.19990.19950.19940.19950.19940.19970.19960.19940.901340.46770.46730.46690.46730.46670.46730.46670.46730.46700.46720.069050.51700.51680.51660.51690.51640.51690.51640.51680.51680.51690.038760.53870.53870.53840.53880.53840.53880.53840.53870.53880.53890.034270.58460.58450.58430.58460.58420.58460.58420.58430.58430.58440.025480.61300.61300.61290.61290.61260.61290.61260.61280.61280.61270.021590.83920.83900.83880.83900.83910.83900.83910.83890.83910.83920.0152100.87880.87840.87860.87860.87880.87860.87880.87810.87820.87850.0261110.94750.94720.94720.94730.94720.94730.94720.94710.94740.94740.013612(R)1.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00000.0000131.25661.25661.25581.25631.25601.25631.25601.25621.25641.25610.0220141.31181.31161.31091.31131.31091.31131.31091.31131.31161.31140.0230

由于龍利葉莖藥材指紋圖譜中目前未發(fā)現(xiàn)已知的化合物對照品，按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的要求，若無適宜的對照品，可選擇適宜的內(nèi)標(biāo)物作為參照物。通過實(shí)驗(yàn)，本文選擇化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、較常用的對照品槲皮素作為內(nèi)標(biāo)物，槲皮素出峰時間適宜，作為參照物進(jìn)行相對峰面積和相對保留時間的計算，符合指紋圖譜研究要求，見圖2、圖3。

本實(shí)驗(yàn)采集記錄了龍利葉莖指紋圖譜的時間為180min，由圖譜可知65min后無明顯色譜峰出現(xiàn)，從而確定指紋圖譜的采集時間為65min。10批不同產(chǎn)地的龍利葉莖HPLC指紋圖譜的疊加圖如圖4所示。計算均值相似度S1～S10分別為0.989、0.953、0.978、0.978、0.928、0.975、0.991、0.935、0.985、0.958，表明相似度良好。

表3　10批樣品共有峰相對峰面積

圖2　參照峰HPLC圖Fig.2　HPLC chromatograms of standard sample

4討論與小結(jié)

4.1供試品制備方法的考察

本實(shí)驗(yàn)首先比較了不加酸水解的情況下，不同極性的溶劑比如乙醇、甲醇、水飽和正丁醇、乙酸乙酯的提取效果，結(jié)果表明，如不加酸水解，不同極性的溶劑提取的成分極性比較接近，很難分離，而且樣品含較多油狀物及難溶性物質(zhì)，不易溶解；加酸水解的情況下，比較了乙醇、甲醇、水飽和正丁醇提取的效果，結(jié)果表明，提取的成分都較易溶解，其中水飽和正丁醇提取的色譜峰較多，分離度較好，故選水飽和正丁醇為提取溶劑。

圖3　樣品HPLC圖Fig.3　HPLC chromatograms of test sample

圖4　10批不同產(chǎn)地龍利葉莖供試品HPLC疊加色譜圖Fig.4　The HPLC superposition chromatogram of the stem of Sauropus rostratus Miq. from 10 batchs of different place

4.2指紋圖譜流動相考察

本實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動相系統(tǒng)，分別考察了甲醇-水、甲醇-有機(jī)酸流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明，色譜峰較少，基線不穩(wěn)定。又考察了乙腈-0.1%醋酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%醋酸所提供的信息較多，且色譜峰分離較好，故采用乙腈-0.1%醋酸作為流動相。

4.3洗脫程序的考察

由于中藥材成分復(fù)雜，等度洗脫較難把中藥成分洗脫和分離，梯度洗脫能夠使成分得到很好的分離。本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫程序，在65min能較好分離樣品中的成分，重復(fù)性良好。

綜上所述，10個不同產(chǎn)地龍利葉莖藥材HPLC指紋圖譜相似度均大于0.9，確定了14個特征峰，表明所建立的龍利葉莖藥材HPLC指紋圖譜具有較好的專屬性，可為龍利葉莖藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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(責(zé)任編輯王龍杰)

doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2016.02.017

收稿日期：2015-09-16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460601)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳2013年中醫(yī)藥民族醫(yī)藥繼承創(chuàng)新工程研究項(xiàng)目(GZZJ13-03)；廣西碩士研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(YCSZ2015180)

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-6600(2016)02-0116-06

HPLCFingerprintofStemofSauropus rostratusMiq．

QIUQin1，ZHENHanshen1，CHENMingwei1，HUANGPeiqian1，2，F(xiàn)ANXiuchun1

(1.GuangxiUniversityofChineseMedicine，NanningGuangxi530001，China；2.QinzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine，QinzhouGuangxi535000,China)

Abstract:High performance of liquid chromatography (HPLC) was adopted to study the HPLC fingerprint of stem of Sauropus rostratus Miq. The separation was performed on Agilent Eclipse XDB-C18column with acetonitrile-0.08% acetic acid solution as mobile phase using a gradientelution， the detection wavelength was 280 nm， the column temperature was set at 25 ℃ and the flow rate was 1 mL·min-1， the data calculation was performed with similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM (Version 2004A)； The results showed that in the fingerprint，14 common peaks were confirmed and the similarity of 10 batches of Stem of Sauropus rostratus Miq．were above 0.9. The experiment result could provide scientific foundation for the quality control method of Sauropus rostratus Miq.

Keywords:stem of Sauropus rostratus Miq．；fingerprint；HPLC

通信聯(lián)系人：甄漢深(1957—)，男，廣東臺山人，廣西中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：8zhen@163.com