江紹鋒，黃金清，于曉宇，李云飛，陸祖軍

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541006；2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西桂林541006；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州510462)

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產(chǎn)酸克雷伯氏菌基因組文庫的構(gòu)建及鑒定

江紹鋒1，2，3，黃金清1，2，于曉宇1，2，李云飛1，2，陸祖軍1，2

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541006；2.珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室，廣西桂林541006；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州510462)

摘要：為了給基因功能研究提供基礎(chǔ)，以pWEBTM質(zhì)粒構(gòu)建產(chǎn)酸克雷伯氏菌KO108基因組文庫，克隆數(shù)目為1 329個。通過EcoR Ⅰ酶切分析隨機挑取的20個文庫克隆的重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示所有質(zhì)粒均有8.2 kb載體條帶同時含有外源DNA，且外源DNA的帶型并不相同，這表明所構(gòu)建的KO108基因組文庫中插入的外源DNA隨機性較好。分析外源DNA電泳條帶的大小，結(jié)果顯示克隆的外源DNA片段最小約為25 kb，最大約為50 kb，平均大小估算為40 kb，文庫克隆容量約52 Mb，證明該基因組文庫包含基因組任意一個基因的概率為99.8%，是KO108基因組覆蓋率的5倍。該文庫的構(gòu)建為產(chǎn)酸克雷伯氏菌功能基因克隆和比較基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)酸克雷伯氏菌；基因組文庫；pWEBTM質(zhì)粒；覆蓋率；庫容

0引言

產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca屬于克雷伯氏菌屬，為革蘭氏陰性桿菌。它不僅能自生固氮，而且不少菌株具有高效的2，3-丁二醇合成特性而成為重要的工業(yè)菌株[1-2]。分離和鑒定生產(chǎn)2，3-丁二醇性能最佳的工業(yè)用菌株的工作仍在不斷進行[3]。該菌的耐氧產(chǎn)氫特性逐漸被人們重視[4]，另外其有望成為降解少見工業(yè)污染物的環(huán)保用菌株[5]。產(chǎn)酸克雷伯氏菌與植物根系聯(lián)合固氮、促進植物生長及增強植物抗性的特性，在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域也得到應(yīng)用[6]。本實驗室從桉樹林土壤分離篩選到一株高固氮酶活性的產(chǎn)酸克雷伯氏菌KO108，通過紙片擴散法發(fā)現(xiàn)其對多粘菌素、青霉素G、四環(huán)素、紅霉素耐藥[7]。我們將對該菌株的固氮、代謝和免疫等相關(guān)功能基因作深入研究。

基因組文庫是指含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA的克隆集合[8]。構(gòu)建重要物種的基因組文庫是物種全部遺傳基因組信息得到長期有效保存的重要途徑?；蚪M文庫構(gòu)建后的文庫質(zhì)量檢測至關(guān)重要，文庫質(zhì)量參數(shù)包括克隆數(shù)目、插入DNA片段的平均大小、載體的空載率、對基因組的覆蓋率等[8]。本研究用大小為8.2kbpWEBTM的克隆載體，以Sma Ⅰ在單一位點切割線性化并去磷酸化和純化處理，可直接高效連接大片段進行克隆，該載體具有如下特性：(1)在Sma Ⅰ位點兩側(cè)有成對的BamHⅠ、EcoRⅠ、Not Ⅰ位點，用于切除并插入DNA片段；(2)具有大腸桿菌ColE1復(fù)制起點；(3)氨芐青霉素抗性用于篩選細(xì)菌目標(biāo)克?。?4)具有在真核細(xì)胞中復(fù)制的SV40復(fù)制起點；(5)新霉素抗性用于篩選真核細(xì)胞克??；(6)噬菌體cos位點用于λ的包裝和λ末端酶的裂解；(7)在多克隆位點兩側(cè)有M13正向引物和T7啟動子引物，可用于未知序列的擴增測序；(8)噬菌體T7RNA聚合酶啟動子位于克隆位點側(cè)翼。用于侵染的菌株為大腸桿菌EPI100TM-T1R，它既缺乏重組系統(tǒng)又缺乏限制系統(tǒng)，從而使體內(nèi)克隆的丟失最小化[9]。為了開展產(chǎn)酸克雷伯氏菌基因組、功能基因組及蛋白組研究做準(zhǔn)備，本實驗以上述質(zhì)粒建立產(chǎn)酸克雷伯氏菌高效穩(wěn)定的基因組文庫，以期為今后產(chǎn)酸克雷伯氏菌功能基因定位及菌落原位雜交、染色體步移等打下必要的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗材料

本研究所使用的菌株與質(zhì)粒列于表1。

表1　本研究用到的菌株與質(zhì)粒

1.2主要試劑

氨芐青霉素(Amp)和基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ等購自Takara公司，pWEBTMCosmidCloningKit購自Epicentre公司。

1.3培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：Tryptone10g、YeastExtract5g、NaCl10g，蒸餾水定容至1L，pH7.0～7.2；LA固體培養(yǎng)基為每升LB液體培養(yǎng)基加入15g瓊脂。

1.4實驗方法

1.4.1插入DNA片段的準(zhǔn)備及其優(yōu)化

以cosmid為載體建立基因組文庫獲得每個外源片段唯一克隆的效果很大程度上取決于外源DNA的平均分子大小和連接時的濃度，40kb的大小最合適。以4個1.5mL離心管每管40μL體系溶解4μg基因組DNA溶液，用100μL小截面槍頭按150、200、250、300次梯度吹打，使其成40kb左右的片段(可取4μL進行電泳同時以EPI100TM-T1R試劑盒提供的36kbMarker對照確定)。電泳條件是瓊脂糖含量為8g/L的電泳膠(20cm長)35V電壓過夜電泳，100ng36kb的MarkerDNA作為對照。如果大于10%的基因組DNA與對照DNA同步遷移，證明基因組DNA片段大小適合(40kb左右)，如果基因組DNA遷移過慢，即相對分子質(zhì)量過大，則需再吹打50次。如果大于10%基因組DNA遷移速度大于對照，即相對分子質(zhì)量過小，需要重新操作。

1.4.2目的DNA末端補平方法

補平反應(yīng)體系為：8μL10×end-repairbuffer，8μL2.5mmol/LdNTPmix，8μL10mmol/LATP，約20μg打碎的DNA，4μLEnd-repairEnzymeMix，加ddH2O至80μL(冰上配制體系，使用前需徹底解凍和混勻)。反應(yīng)體系室溫放置45min反應(yīng)，之后70 ℃水浴鍋加熱10min滅活End-repair酶終止補平反應(yīng)，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3DNA大小篩選

(1)溶膠：100mL1×TAE加0.8g低熔點瓊脂，微波爐中加熱3min，加熱過程中每隔1min震蕩1次以使瓊脂糖充分溶解。

(2)制膠：室溫下冷卻至膠溶液不燙手時倒膠(選用梳齒薄而寬的梳子，樣品孔以干凈的標(biāo)簽紙包封2～4個梳齒形成)，待膠室溫條件下完全冷卻凝固后(約30min)再于4 ℃冰箱內(nèi)冷卻2～3h(連同梳子)。

(3)電泳：拔出梳子，點加末端補平的DNA(以36kbMarker和λ-HindⅢMarker作為Marker)35V電壓低溫過夜電泳約14h，染色觀察。

(5)目標(biāo)DNA片段的回收(事先準(zhǔn)備好70 ℃和45 ℃的水浴鍋)。

①確定凝膠塊的質(zhì)量(一般1mg凝膠溶化后產(chǎn)生1μL溶液)。

②將膠塊置70 ℃水浴鍋10～15min使其完全溶解，同時在45 ℃水浴鍋內(nèi)保溫GELase50×Buffer5min。

③將完全溶解的膠液快速轉(zhuǎn)移至新的離心管并在45 ℃保溫，加入適量的GELase50×Buffer到終濃度1×，同時小心地加入3μL(3U)的GELase酶輕柔混勻，45 ℃下溫育至少1h(過夜也不會有影響)。

④混合液移回70 ℃水浴鍋水浴 10min以滅活GELase酶終止反應(yīng)。

⑤每500μL溶液為1份移入2mL離心管。

預(yù)算編制結(jié)果將直接影響預(yù)算執(zhí)行情況。因為在進行預(yù)算編制過程中，沒有從企業(yè)各個環(huán)節(jié)入手，導(dǎo)致預(yù)算活動參與度相對不高。并且因為預(yù)算編制自身不具備嚴(yán)謹(jǐn)性和規(guī)范性，在執(zhí)行預(yù)算工作時，時常和實際情況相背離，使得預(yù)算監(jiān)管存在盲區(qū)，管理人員不能發(fā)揮自身擔(dān)具的監(jiān)管作用，從而使得預(yù)算編制結(jié)果差強人意。

⑥冰浴5min后10 000r/min離心20min沉淀不溶的凝膠，小心地吸取含DNA的上清液(90%～95%)放入1個干凈的離心管中(注意避免吸入凝膠塊)。

⑦DNA回收通過如下操作完成：a.加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH7.0)并輕柔混勻；b.再加入2.5倍的無水乙醇，輕柔混勻；c.室溫下沉淀10min后4 ℃ 12 000r/min離心20min，小心除去上清；d.用體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇洗滌2次(4 ℃ 12 000r/min離心20min，小心除去上清，如果沉淀離開原位，需再次離心復(fù)位)；e.小心地倒置離心管，干燥5～10min(注意時間過長會使DNA難以再溶)；f.ddH2O重新溶解沉淀以備用，同時取少量電泳估計濃度。

1.4.4連接反應(yīng)

參考Epicentre公司提供的方法。按順序加入下列試劑并在每次加入試劑后混勻。載體和插入DNA摩爾濃度比按10∶1加入。10μL連接體系為：1μL10×Fast-LinkBuffer，1μL10mmol/LATP，0.5μgpWEBVector(0.5g/L)，0.25μg插入DNA，1μLFast-LinkLigase，加ddH2O至10μL。充分混合后，室溫下反應(yīng)2h，然后70 ℃水浴10min滅活連接酶，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5體外包裝反應(yīng)

采用Epicentre公司pWEBTMCosmidCloningKit蛋白包裝。

①從-80 ℃取出1管新鮮的包裝提取物(每管50μL)置冰水混合物上解凍10min，吸取25μL蛋白轉(zhuǎn)移到另外1個1.5mL預(yù)冷的離心管中，置于冰上；剩下的25μL包裝提取物可放回-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，也可繼續(xù)放于冰上用于后續(xù)的包裝。

②向1個管中加入10μL連接好的cosmidDNA，用小型移液槍輕輕混合均勻，吹打時最好不要讓槍頭離開液相，目的是避免引入氣泡(氣泡會影響包裝效率)，萬一有氣泡形成則需離心幾秒鐘以驅(qū)走產(chǎn)生的氣泡。

③30 ℃水浴溫育反應(yīng)90min后，再次向離心管加入25μL解凍的包裝提取物，30 ℃水浴再溫育90min。

④向離心管加入500μL噬菌體稀釋緩沖液(PDB，10mmol/LTris-HClpH8.3，100mmol/LNaCl，10mmol/LMgCl2)輕柔漩渦混勻。

⑤加入25μL三氯甲烷輕柔漩渦混勻，保存于4 ℃冰箱備用。

1.4.6轉(zhuǎn)染反應(yīng)

轉(zhuǎn)染前的菌體準(zhǔn)備：在轉(zhuǎn)染的前一天，以含10mmol/LMgSO4和2g/L麥芽糖的50mLLB培養(yǎng)基接種單一菌落的大腸桿菌EPI100TM-T1R并37 ℃震蕩過夜；轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，以50mL上述培養(yǎng)基接種5mL過夜培養(yǎng)的EPI100TM-T1R并37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.8～1.0后(儲存于4 ℃?zhèn)溆茫疃?2h)。

轉(zhuǎn)染反應(yīng)操作步驟：①取1.5mL菌液于無菌離心管中，10 000r/min離心去掉上清，再吸取1.5mL菌液于同一個離心管中，混合均勻；②取不同體積的包裝產(chǎn)物(5、10、15、20μL)加入到準(zhǔn)備好的100μL細(xì)胞中；③37 ℃水浴30min，間隔15min輕柔搖動1次；④5 000r/min離心1min，去上清后加入200μLLB重懸；⑤各處理取100μL懸浮液涂布于含100mg/L的Amp平板上(盡量不要涂到平板邊緣，便于挑菌保存)，37 ℃培養(yǎng)12～18h長出的菌落即為文庫的克??；⑥確定當(dāng)菌落數(shù)為100個左右時所需包裝產(chǎn)物的量，根據(jù)此用量再次進行包裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)染，方法同上；⑦最終得到的所有單菌落的數(shù)量即構(gòu)成KO108的基因組文庫。

1.4.7文庫保存

采用甘油保藏法保存單克隆文庫，共2份，1份存于1.5mL離心管，另1份存于無菌96孔板，具體操作如下：

從平板上挑取單克隆子轉(zhuǎn)接于含有Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，菌株生長到OD600為0.8～1.2，分別吸取500μL菌液轉(zhuǎn)移到事先準(zhǔn)備好的1.5mL離心管中，再加入500μL體積分?jǐn)?shù)為50%的無菌甘油，混合均勻，并做好編號；取混勻菌液另存于96孔平板，每個孔200μL(編號與離心管保存的文庫一一對應(yīng))，2個文庫均-80 ℃冰箱長期保存。

1.4.8基因組文庫質(zhì)量檢測

從KO108基因組文庫中隨機選取20個克隆子，以含有Amp的LB培養(yǎng)基37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)后分別以堿裂解法提取質(zhì)粒[10]，EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶消化(一般需要在37 ℃下酶切3～4h，根據(jù)質(zhì)粒的濃度和質(zhì)量而定)并電泳檢驗酶切結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌DNA的提取及優(yōu)化

以天根公司的試劑盒提取KO108基因組DNA，取1μLDNA溶液用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，可以看到清晰的DNA條帶如圖1。以超微量分光光度計檢測OD260/OD280比值為1.84，DNA含量為487.8mg/L，可見所獲得的DNA符合下一步實驗的質(zhì)量要求。

M： λ-Hind Ⅲ Marker；泳道1-3： 菌株KO108基因組DNA圖1　菌株KO108基因組DNAFig.1　The genomic DNA of stain KO108

M1：36 kb Marker；M2：λ-Hind Ⅲ Marker； 泳道1-4分別為150、200、250、300次打斷圖2　菌株KO108基因組 DNA不同吹打次數(shù)優(yōu)化Fig.2　Optimization of interrupted frequency for genomic DNA of strain KO108

2.2KO108基因文庫的質(zhì)量檢測

pWEBTM載體的相對分子質(zhì)量為8.2kb，對外源DNA片段長度的要求接近于40kb，以之構(gòu)建基因組文庫有相當(dāng)大的優(yōu)勢，因此本工作以pWEBTM質(zhì)粒構(gòu)建KO108基因組文庫。

對符合質(zhì)量要求的KO108基因組總DNA優(yōu)化吹打次數(shù)(如圖2)，根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果選擇經(jīng)300次吹打進行下一步實驗。將吹打后的DNA進行末端補平，經(jīng)8g/L低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收片段長度約為40kb的高純度外源DNA(如圖3)，以約2μg的DNA與pWEBTM載體連接，再用包裝蛋白提取物體外包裝重組DNA，之后轉(zhuǎn)染大腸桿菌EPI100TM-T1R得到KO108基因組文庫(如圖4)。該文庫由1 329個克隆組成。文庫分2份保存于-80 ℃冰箱，第一份為每個克隆裝于一個1.5mL離心管，第二份用96孔平板保存。

為檢測所構(gòu)建的KO108基因組文庫的質(zhì)量，隨機從文庫中挑取20個克隆，以堿裂解法分別提取質(zhì)粒，電泳檢測顯示均出現(xiàn)大于pWEBTM空載體(8.2kb)的條帶(圖5)，表明每個克隆子都包含外源DNA。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶完全酶切的電泳檢測如圖6。由圖6可見，所有質(zhì)粒均有pWEBTM載體條帶和載體以外的外源DNA，各質(zhì)粒的酶切帶型并不相同，表明所構(gòu)建的KO108基因組文庫中插入的外源DNA隨機性較好。

由圖6同時可見KO108基因組文庫中克隆的外源DNA片段最小為25kb，最大約為50kb，估算平均大小約為40kb，由此推斷該文庫的容量約為52Mb。在NCBI數(shù)據(jù)庫上選擇同屬的幾個克雷伯氏菌(Klebsiella oxytocaE718、Klebsiella oxytocaKCTC1686和Klebsiella oxytoca 10-5242)計算它們的基因組全長的平均值為6.1Mb。按照公式N=Ln(1-P)/Ln(1-f)推算P=1-(1-f)N值，本文所構(gòu)建的文庫中包含基因組中任一個基因的概率(公式中的N表示重組質(zhì)?？寺〉臄?shù)量，P表示從文庫中得到一個基因的概率，f表示文庫克隆平均大小/基因組大小)[11]，證實所構(gòu)建的KO108基因組文庫是該菌株基因組5倍的覆蓋率，包含該菌株任何一個基因的概率為99.8%。

M1：36 kb Marker；M2：λ-Hind Ⅲ Marker；泳道1：回收DNA圖3　菌株KO108基因組 DNA回收Fig.3　Recovery of genomic DNA of strain KO108

圖4　重組載體轉(zhuǎn)染結(jié)果Fig.4　Transfection results of recombinant vector

M：λ-Hind Ⅲ Marker；泳道1-20：克隆子質(zhì)粒DNA圖5　菌株KO108基因組文庫克隆重組質(zhì)粒DNAFig.5　The recombinant plasmid DNA from the genomic library of stain KO108

M：λ-Hind Ⅲ Marker；泳道1-20：EcoR Ⅰ酶切后的克隆子質(zhì)粒圖6　菌株KO108基因組文庫克隆中重組質(zhì)粒的EcoR Ⅰ酶切分析Fig.6　EcoR Ⅰ enzymes restriction digestion analysis on the recombinant plasmid from the genomic library of strain KO108

3結(jié)論與討論

產(chǎn)酸克雷伯氏菌K.oxytoca屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬的一個種，在臨床上發(fā)現(xiàn)其是一種條件性致病菌，發(fā)現(xiàn)較少與人類疾病有關(guān)[12]。全基因組測序結(jié)果表明同種不同菌株基因組上具有多重耐藥基因，或存在由質(zhì)粒介導(dǎo)的多重耐藥基因[12-13]。以基因敲除技術(shù)獲得充分利用氧、高效生產(chǎn)2，3-丁二醇的突變株成為分析該菌代謝產(chǎn)物的重要手段[14]。

由于pWEBTM質(zhì)粒具有插入外源DNA片段大、操作靈活等優(yōu)點，因此使用pWEBTM質(zhì)粒構(gòu)建基因組文庫的研究不斷增多。優(yōu)質(zhì)的基因組DNA制備是成功構(gòu)建pWEBTM基因組文庫的關(guān)鍵，DNA必須是高純度同時不能過度斷碎。齊冬梅等通過酶切基因組片段，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌，成功構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌的基因組文庫[15]。本實驗采用機械物理隨機打斷基因組DNA再分離回收目標(biāo)片段的方法進行，既方便又準(zhǔn)確，同時避免因基因組酶切位點過少而造成外源隨機片段過少的弊端，檢測結(jié)果表明平均插入片段達(dá)到40kb。打斷的DNA通過末端修復(fù)酶修復(fù)，可以有效提高DNA與載體連接的效率。在轉(zhuǎn)染過程中，適量蛋白包裝提取物和高質(zhì)量的感受態(tài)大腸桿菌EPI100可以大大提高文庫的克隆數(shù)量。本文庫的克隆數(shù)目為1 329個，隨機挑選20個克隆子提取質(zhì)粒檢測顯示都包含有外源片段；對重組質(zhì)粒EcoRⅠ酶切檢測顯示均有pWEBTM載體條帶和載體以外的外源DNA，各質(zhì)粒的酶切帶型并不相同，表明文庫中的重組質(zhì)粒為不同大小的外源DNA與pWEBTM載體隨機連接所得。所構(gòu)建的基因組文庫中的克隆的外源DNA片段最小為25kb，最大約為50kb，估算平均大小約為40kb，由此推斷本文庫的容量約為52Mb，包含KO108菌株任一個基因的概率為99.8%，是該菌基因組5倍的覆蓋率。本文庫的構(gòu)建為產(chǎn)酸克雷伯氏菌功能基因和比較基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯馬殷華)

doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2016.02.023

收稿日期：2015-07-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31060120)；廣西自然科學(xué)基金資助項目(2013GXNSFAA019059)；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目基金資助(YCSZ2014090)

中圖分類號：Q933

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-6600(2016)02-0151-07

ConstructionandCharacterizationoftheGenomicLibraryofKlebsiella oxytoca

JIANGShaofeng1，2，3，HUANGJinqing1，2，YUXiaoyu1，2，LIYunfei1，2，LUZujun1，2

(1.CollegeofLifeScience，GuangxiNormalUniversity，GuilinGuangxi541006，China；2.KeyLaboratoryofEcologyofRareandEndangeredSpeciesandEnvironmentalProtection(MinistryofEducation)，GuilinGuangxi541006，China；3.CollegeofAgriculture，SouthChinaAgricultureUniversity，GuangzhouGuangdong510462，China)

Abstract:The 1 329-clones genomic library of Klebsiella oxytoca KO108 was constructed by pWEBTMCosmid. Its coverage and randomness was confirmed by the electrophoresis profiles of 20 recombination plasmids digestion with EcoR Ⅰ，which were randomly selected from the library. The results showed that all tested plasmids contained the 8.2 kb cosmid fragment and an exogenous one diverse in size from 25 to 50 kb(about 40 kb in average)， this suggested that the total capacity of this library was about 52 Mb， 5 times of KO108 genome， 99.8% theoretical possibility including any gene in this strain. The library lays a foundation for functional gene cloning and comparative genomics research for Klebsiella oxytoca.

Keywords:Klebsiella oxytoca； genomic library；pWEBTMCosmid； coverage； library capacity

通信聯(lián)系人：陸祖軍(1963—)，男(壯族)，廣西百色人，廣西師范大學(xué)教授，博士。E-mail：luzujun2002@aliyun.com