王化鵬　郝春鳳　張正青　張偉　常勇　李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

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花絨寄甲methuselah-like基因的鑒定和表達(dá)1)

王化鵬郝春鳳張正青張偉常勇李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

摘要采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲取了花絨寄甲(Dastarcus helophoroides)methuselah-like基因的cDNA全長序列，命名為mth-like2，采用多種生物信息學(xué)軟件分析了Mth-like2受體蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并采用Real-time qPCR技術(shù)分析了該基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：mth-like2基因cDNA全長為2 117 bp，開放閱讀框的大小為1 458 bp，編碼485個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為56 750，理論等電點(diǎn)為8.83，存在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，該基因?qū)?yīng)的受體蛋白序列與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)Mth2-like親緣關(guān)系最近。mth-like2基因在不同組織和不同蟲態(tài)均有表達(dá)，其中雄性生殖系統(tǒng)的表達(dá)量顯著高于其他組織，6齡幼蟲顯著高于其他蟲態(tài)；mth-like2基因的表達(dá)量隨存活時(shí)間的延長顯著下調(diào)；在氧化、高溫和饑餓條件下，mth-like2基因的表達(dá)量也均有顯著變化，且在氧化和高溫下雌雄有顯著差異。

關(guān)鍵詞花絨寄甲；Mth-like受體；基因克??；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

瑪士撒拉基因編碼一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，亦稱瑪士撒拉受體(Methuselah，Mth)。Mth受體屬于B家族G蛋白偶聯(lián)受體，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅(Drosophila)中。研究表明，mth基因的突變使果蠅的壽命延長了35%，并且對饑餓、高溫和百草枯等一系列外界脅迫因素的抵抗能力也顯著提高[1]。隨后的研究表明，mth基因不僅延緩了衰老而且加強(qiáng)了果蠅的感知運(yùn)動能力[2]。但是，mth基因突變會抵消果蠅的生殖能力[3]，這也證明了壽命和生殖能力之間的互抵效應(yīng)。果蠅的小分子肽Stunted是科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的首個(gè)Mth受體內(nèi)源性配體。而且，當(dāng)編碼Stunted的基因sun發(fā)生突變也會延長果蠅的壽命并且增強(qiáng)果蠅對氧化脅迫的耐受能力[4]。Mth/Stunted系統(tǒng)與果蠅的壽命、應(yīng)激能力和生殖能力相關(guān)。至于其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，只知道Dorsal 蛋白可以在mth基因的啟動子區(qū)與2個(gè)激動元件(PE1 and PE2)相結(jié)合，并且最大程度抑制果蠅S2細(xì)胞中mth基因的表達(dá)[5]。除mth基因外，在昆蟲中一系列mth同源基因也相繼被發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)稱為methuselah-like (mth-like, mthl)基因。到目前為止，果蠅中發(fā)現(xiàn)15條，岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)7條，家蠶(Bombyx mori)4條，意蜂(Apis mellifera)4條，豌豆長管蚜(Acyrthosiphon pisum)3條，赤擬谷盜(Tribolium castaneum)5條[6-10]。然而，這些研究都表明mth基因不存在于非果蠅昆蟲中?？茖W(xué)家們認(rèn)為mth和mth-like基因在昆蟲中起源于一個(gè)共同的祖先基因，這個(gè)基因在后來的進(jìn)化過程中發(fā)生了加倍[10]，但現(xiàn)在還不清楚它們是否具有相同的功能。

花絨寄甲(Dastarcus helophoroides)是一種重要的天敵昆蟲，它的幼蟲寄生在天牛末齡幼蟲和蛹上[11-12]，可有效防治大型天牛類林木蛀干害蟲[13-14]?；ńq寄甲的成蟲有著相對較長的壽命，在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)條件下可以存活8年以上[15]。到目前為止，關(guān)于花絨寄甲分子層面的研究還比較少，衰老機(jī)制方面的研究更是鮮有報(bào)道。本研究從分子水平研究花絨寄甲mth-like基因與壽命和抗逆能力的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示mth-like基因的功能，花絨寄甲衰老機(jī)制和抗逆能力提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

試驗(yàn)所用的花絨寄甲幼蟲、蛹和成蟲均由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林害蟲生物控制實(shí)驗(yàn)室提供，成蟲由人工飼料喂養(yǎng)，飼料主要成分為蠶蛹粉、瓊脂等，幼蟲接種在替代寄主大麥蟲(Zophobas atratus)蛹上。成蟲和幼蟲均飼養(yǎng)在養(yǎng)蟲室內(nèi)，溫度(23±1)℃，相對濕度70%～80%[15]。

1.2花絨寄甲mth-like基因的檢索

西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林害蟲生物控制實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得完整的花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組序列[16]。所有unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比對(Evalue<10-5)，并對其進(jìn)行注釋。通過關(guān)鍵詞(methuselah-like, mth-like或mth)檢索，在注釋文件中篩選出花絨寄甲的mth-like序列。

1.3總RNA提取和cDNA合成

按照使用說明書，用UNIQ-10 Trizol 總RNA抽提試劑盒提取4頭新羽化花絨寄甲成蟲總RNA，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用微量核酸分析儀測定其濃度和純度，取1 μg總RNA，按照SMARTerTMRACE kit試劑盒說明書進(jìn)行操作制備3′RACE cDNA模板。

1.4PCR擴(kuò)增、克隆和測序

根據(jù)檢索到的基因片段，利用Premier Primer 5軟件設(shè)計(jì)基因特異引物3′GSPs(表1)。3′RACE-PCR的反應(yīng)體系為：9.5 μL RNase-free water，1 μL 3′cDNA模板，1 μL下游通用引物UPM，1 μL上游3′GSP1特異性引物，12.5 μL ES-Taq聚合酶。以第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板，上游引物換成(GSP2)，下游引物換成NUP(試劑盒自帶)，進(jìn)行第2輪巢式PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)程序均為：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，60 ℃、40 s，72 ℃、2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收后，連接到pUCm-T載體，轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞中，在LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，PCR篩選陽性克隆后測序。

1.5序列分析

將測序所得3′序列通過DNAMAN 6.0軟件與原序列進(jìn)行拼接，獲得完整的cDNA序列。得到全長序列后針對基因的ORF(開放閱讀框)設(shè)計(jì)全長驗(yàn)證引物(表1)進(jìn)行全長驗(yàn)證。將上述完整的cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用NCBI中的ORF finder(http:// http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具，分析其可能的開放閱讀框并翻譯為氨基酸序列；用ExPASy工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；用在線工具TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測；利用MEGA5.0軟件中的Neighbor joining法進(jìn)行1 000次重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[17]。

表1　試驗(yàn)中用到的引物

1.6樣品收集與定量分析

分別收集1～6齡幼蟲、蛹和成蟲，3次獨(dú)立采集作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；收集200頭成蟲進(jìn)行解剖，分別收集頭、胸、中腸、后腸、雄性生殖系統(tǒng)、雌性生殖系統(tǒng)、脂肪體和腹部殘?bào)w，將每個(gè)收集都平均分成3份，作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；將成蟲依據(jù)羽化后時(shí)間的長短(2、4、10、12、18、20、26、30個(gè)月)分為8個(gè)不同的組，每組雌雄1∶1，共設(shè)3個(gè)重復(fù)。提取各處理總RNA，用DNA I(Takara，日本)去除DNA污染，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測mth-like基因在不同處理中的表達(dá)量。不同蟲態(tài)和不同組織選用花絨寄甲EF-1α作為內(nèi)參基因，不同存活時(shí)間選用α-Tubulin基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)定量引物EF-1αF，EF-1αR和α-TubulinF，α-TubulinR；目的基因的定量引物mth-like2-F和mth-like2-R(表1)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、3 min ；95 ℃、30 s；60 ℃、30 s；72 ℃、30 s，50個(gè)循環(huán)。測定溶解曲線的反應(yīng)條件：65 ℃到95 ℃，每升高0.5 ℃停留10 s，采集熒光。

1.7脅迫處理與定量分析

氧化處理，用濃度為40 mmol·L-1的百草枯處理新羽化花絨寄甲成蟲，分別在處理后1、2、3、4、5、6、12、18、24 h收集樣品，以未處理為對照。高溫處理，41 ℃處理新羽化成蟲，分別在處理后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0、12.0 h收集樣品，以未處理為對照。饑餓處理，只給水，不放飼料，分別在處理后2、4、6、8、10、12、14 d收集樣品，以未處理為對照。以上操作對雌、雄成蟲分別進(jìn)行處理，重復(fù)3次。按照1.7的方法，檢測氧化脅迫、高溫脅迫和饑餓脅迫下mth-like2基因的表達(dá)量。內(nèi)參基因選用α-Tubulin。

1.8數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用相對定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算分析[18]。對于不同蟲態(tài)的分析，以1齡幼蟲基因的表達(dá)量數(shù)值為參照(設(shè)為1)，不同組織以頭部基因的表達(dá)量數(shù)值為參照(設(shè)為1)，不同蟲齡則以羽化后2個(gè)月的成蟲基因表達(dá)量數(shù)值為參照(設(shè)為1)，氧化、高溫和饑餓條件下均以未處理成蟲基因的表達(dá)量數(shù)值為參照(設(shè)為1)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)顯著差異性分析采用SPSS 20中的Tukey方法。

2結(jié)果與分析

2.1花絨寄甲mth-like2基因的檢索和cDNA序列測定

通過檢索花絨寄甲成蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫得到1個(gè)mth-like基因序列，Unigene 23675，長度為1 597 bp，用NCBI中的ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具分析發(fā)現(xiàn)序列的5′端已完整，3′端不全。通過3′RACE-PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)600 bp左右的條帶(圖1)。測序獲得604 bp的序列，經(jīng)DNAMAN 6.0軟件拼接后獲得2 117 bp的序列，含有完整的開放閱讀框，全長驗(yàn)證的測序結(jié)果與拼接序列一致。

M.DM2000 Marker；1-3.目的條帶。

2.2花絨寄甲mth-like2基因核苷酸與氨基酸序列

經(jīng)ORF finder工具分析，將上述序列的開放閱讀框翻譯成氨基酸序列(圖2)。通過Blastp工具在線比對，發(fā)現(xiàn)其與赤擬谷盜的mth-like2基因(XP-008190990.1)的同源性最高(54%)，與果蠅mth(NP-523871.1)的相似度為30%、與果蠅mth-like2 (NP-788462.2)的相似度為26%。將序列命名為mth-like2(GenBank登錄號：KU363814)，相對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列命名為Mth-like2。mth-like2的開放閱讀框的大小為1 458 bp，編碼485個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為56 750，理論等電點(diǎn)為8.83。用在線工具TMHMM對mth-like2編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)此受體蛋白具有7個(gè)α螺旋跨膜區(qū)，跨膜區(qū)的位置分別是第185～204、216～233、243～265、287～309、338～360、389～411、421～443位氨基酸，并且該受體的N端序列在細(xì)胞膜外,C端在膜內(nèi)。為了明確花絨寄甲Mth-like2氨基酸序列與其他昆蟲之間的進(jìn)化關(guān)系，對來自5個(gè)目的13條昆蟲Mth-like2(Mth2-kike)氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 3)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所有物種在進(jìn)化樹上分為兩個(gè)大的分枝，雙翅目(Diptera)的果蠅和桔小實(shí)蠅(Bactrocera dorsalis)聚為一枝，其他物種則聚在另一分枝，其中膜翅目(Hymenoptera)的阿根廷蟻(Linepithema humile)、佛羅里達(dá)弓背蟻(Camponotus floridanus)、紅收獲蟻(Pogonomyrmex barbatus)、意蜂、大蜜蜂(Apis dorsata)和蠅蛹金小蜂(Nasonia vitripennis)聚在一起，等翅目(Isoptera)的內(nèi)華達(dá)古白蟻(Zootermopsis nevadensis)和同翅目(Homoptera)的豌豆長管蚜(Acyrthosiphon pisum)聚在一起，花絨寄甲則與其同為鞘翅目昆蟲的赤擬谷盜聚為一組?；ńq寄甲Mth-like2氨基酸序列與赤擬谷盜親緣關(guān)系最近，與膜翅目、同翅目和等翅目昆蟲親緣關(guān)系較近,與雙翅目昆蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3花絨寄甲mth-like2基因表達(dá)量

由表2可見，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù),檢測mth-like2基因在花絨寄甲不同蟲態(tài)中的表達(dá)情況,mth-like 2基因在各蟲態(tài)均有表達(dá)，6齡幼蟲表達(dá)量顯著(p<0.05)高于其他蟲態(tài)；不同組織的表達(dá)情況顯示，mth-like2基因在成蟲的不同組織內(nèi)均有表達(dá)，雄性生殖系統(tǒng)的表達(dá)量顯著(p<0.05)高于其他組織；隨著存活時(shí)間的延長，mth-like2基因的表達(dá)量從第18個(gè)月開始明顯下調(diào)，隨后維持在較低的水平。

2.4花絨寄甲成蟲在脅迫下mth-like2基因表達(dá)量

在氧化脅迫的條件下，雌成蟲mth-like2基因的表達(dá)量(表3)隨時(shí)間的延長緩慢上調(diào)，3 h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量，隨后緩慢恢復(fù)，最后略高于起始水平但差異不顯著。雄成蟲mth-like2基因的表達(dá)量也隨時(shí)間延長緩慢上調(diào)，4 h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)量，隨后緩慢下降，最后維持在較低的水平，約為起始水平的1/4。0～2 h雄性基因表達(dá)量顯著低于雌性，3～5 h雌雄無顯著差異，6 h以后雄性顯著低于雌性。

在41 ℃高溫環(huán)境下雌成蟲mth-like2基因的表達(dá)量(表3)整體呈升高趨勢，1.5 h后達(dá)到較高水平。雄成蟲基因的表達(dá)量顯著低于雌蟲，且表達(dá)量無顯著變化。

饑餓條件下，雌成蟲mth-like2基因的表達(dá)量(表3)在第4天上調(diào)并達(dá)到最高表達(dá)量，隨后緩慢下降，最后降到較低水平，約為起始水平的1/2。雄成蟲基因的表達(dá)趨勢與雌蟲基本一致，在第2天達(dá)到最高，隨后下降，整體上看雌蟲和雄蟲基因表達(dá)量無顯著差異。

圖2　花絨寄甲mth-like2 cDNA核苷酸及預(yù)測的氨基酸序列(方框標(biāo)注為起始密碼子和終止密碼子)

發(fā)育階段基因表達(dá)量組織基因表達(dá)量存活時(shí)間/月基因表達(dá)量1齡幼蟲(參照)(1.00±0.07)b頭部(參照)(1.00±0.05)b2(參照)(1.00±0.20)a2齡幼蟲(2.44±0.11)b胸部(5.81±0.33)b4(1.04±0.25)a3齡幼蟲(0.76±0.10)b中腸(0.34±0.03)b10(1.15±0.11)a4齡幼蟲(1.20±0.21)b后腸(3.00±0.10)b12(1.11±0.20)a5齡幼蟲(1.16±0.12)b雄性生殖系統(tǒng)(106.55±12.57)a18(0.78±0.11)ab6齡幼蟲(32.11±1.77)a雌性生殖系統(tǒng)(1.01±0.07)b20(0.60±0.15)b蛹(2.64±0.39)b脂肪體(11.00±0.76)b26(0.44±0.12)b成蟲(5.00±0.87)b腹部殘?bào)w(9.35±0.34)b30(0.56±0.09)b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同發(fā)育階段、不同組織、不同存活時(shí)間下，基因表達(dá)量數(shù)據(jù)后的字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

圖3　花絨寄甲與其他昆蟲Mth-like2氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法，Mth2-like=Mth-like2)

氧化脅迫時(shí)間/h基因表達(dá)量雌雄高溫脅迫時(shí)間/h基因表達(dá)量雌雄饑餓脅迫時(shí)間/h基因表達(dá)量雌雄0(1.83±0.31)cde(1.00±0.14)g 0 (2.54±0.38)cde(1.00±0.16)e0(1.14±0.08)cd (1.00±0.15)cde 1(2.24±0.39)abc(1.37±0.11)efg0.5(3.63±0.49)bc(1.16±0.08)e2(1.03±0.15)cde(1.82±0.04)a2(2.36±0.33)abc(1.64±0.03)def1.0(3.37±0.44)cd(1.24±0.06)e4(1.64±0.12)ab(1.28±0.04)bc3(2.80±0.28)a(2.54±0.39)ab1.5(5.75±0.13)a(1.60±0.20)de6(1.01±0.19)cde(1.23±0.19)bc4(2.27±0.11)abc(2.57±0.18)ab2.0(5.58±0.19)a(1.69±0.22)de8(1.00±0.07)fg(0.86±0.15)cdef5(2.31±0.12)abc(2.34±0.08)abc3.0(5.45±1.20)ab(1.89±0.35)de10(1.17±0.17)cd(0.89±0.20)cdef6(2.22±0.34)abc(1.56±0.32)defg6.0(5.31±1.11)ab(1.24±0.19)e12(0.83±0.22)cdef(0.67±0.13)defg12(1.63±0.34)def(1.11±0.09)fg12.0(7.05±0.83)a(1.31±0.22)e14(0.61±0.17)efg(0.24±0.02)g18(2.04±0.30)bcd(0.27±0.04)h24(1.94±0.14)cde(0.19±0.02)h

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。氧化脅迫中雄性0 h處理為參照，表達(dá)量設(shè)為1；高溫脅迫中雄性0 h處理為參照，表達(dá)量設(shè)為1；饑餓脅迫中雄性0 d處理為參照，表達(dá)量設(shè)為1。同一脅迫處理下，同列數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

3結(jié)論與討論

本研究在從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得基因片段的基礎(chǔ)上，應(yīng)用RACE-PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了花絨寄甲mth-like2基因具有完整開放閱讀框的cDNA序列。該基因的開放閱讀框的大小為1 458 bp，編碼485個(gè)氨基酸，預(yù)測該氨基酸序列有7個(gè)α螺旋跨膜區(qū)，并且該受體蛋白的N端序列在細(xì)胞膜外，C端位于胞內(nèi)，符合Mth-like受體蛋白和Mth受體蛋白的特征[19-20]，也與B家族G蛋白偶聯(lián)受體的基本結(jié)構(gòu)保持一致[6，21]。通過Blastp工具在線比對發(fā)現(xiàn)，花絨寄甲mth-like2基因與其他物種mth-like2基因的同源性都比較低。通過與其他5個(gè)目的13條昆蟲mth-like2(Mth2-like)氨基酸序的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，隨著昆蟲漫長的選擇和進(jìn)化，mth-like2 在不同昆蟲間的親緣關(guān)系也有所分歧?；ńq寄甲mth-like2與鞘翅目的赤擬谷盜親緣關(guān)系最近。這預(yù)示著，找到合適的mth-like2靶標(biāo)位點(diǎn)，可能是以后利用mth-like2 防治害蟲和研究新型藥物的突破口。

mth/mth-like基因在果蠅胚胎發(fā)育過程中，在不同組織的不同發(fā)育時(shí)段是不對稱表達(dá)分布的，具有一定的時(shí)空特性[20]。mth-like2基因在赤擬谷盜卵的早期階段和蛹的后期階段表達(dá)量高于其他階段，也表現(xiàn)出一定的時(shí)空特性。并且，mth-like2基因?qū)己陀鸹^程起到了至關(guān)重要的作用[22]。筆者的研究表明，花絨寄甲mth-like2基因的表達(dá)也表現(xiàn)出了不同蟲態(tài)的差異性，在6齡幼蟲、蛹和新羽化成蟲中都維持著相對較高的表達(dá)量，6齡幼蟲最高，這表明花絨寄甲mth-like2基因也可能在化蛹和羽化的過程中起到重要作用。從mth-like2基因在花絨寄甲不同組織中的表達(dá)情況來看，其在雄性生殖系統(tǒng)中的表達(dá)量顯著高于其他組織，這表明mth-like2基因可能與花絨寄甲的生殖能力相關(guān)。這種情況在赤擬谷盜中也得到了驗(yàn)證，RNA干擾以后，mth-like2基因的表達(dá)量降低，一對赤擬谷盜的日均產(chǎn)卵量顯著減少，并且卵的孵化率也會降低[22]。在果蠅中的研究表明，mth基因突變或抑制mth基因的表達(dá)都會延長果蠅的壽命[1，23]。隨著存活時(shí)間的增長，花絨寄甲mth-like2基因的表達(dá)量明顯下調(diào)，這可能提示花絨寄甲mth-like2基因與果蠅mth基因擁有相似的功能，mth-like2基因一直維持在較低表達(dá)水平可能是花絨寄甲壽命長的一方面原因。

為探究mth-like2基因在抗逆過程中的作用，測定了mth-like2基因在氧化、高溫和饑餓條件下的表達(dá)情況。在40 mmol·L-1百草枯處理下，花絨寄甲mth-like2基因的表達(dá)量隨時(shí)間呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，后期雌性表達(dá)量顯著高于雄性。mth基因突變會增強(qiáng)果蠅的抗氧化脅迫能力[20，10]，花絨寄甲mth-like2基因可能也跟抗氧化脅迫能力相關(guān)，且雌性和雄性的抗氧化能力可能有所不同，但對赤擬谷盜的mth-like2基因進(jìn)行RNA干擾后其抗氧化脅迫的能力無顯著變化[1]，所以對mth-like2基因的功能還應(yīng)進(jìn)一步研究。41 ℃環(huán)境條件下，雌性花絨寄甲mth-like2基因的表達(dá)量整體呈上調(diào)趨勢，雄性則無顯著變化。mth-like2基因下調(diào)會減弱赤擬谷盜對高溫的耐受性，mth-like2基因?qū)S持對高溫的耐受性非常重要[1]。所以，花絨寄甲mth-like2基因的上調(diào)可能也提高了其對高溫的耐受性，并且雌性可能比雄性更耐高溫。在饑餓條件下，花絨寄甲mth-like2基因的表達(dá)量先升后降，這可能因?yàn)閙RNA達(dá)到一定的量后抑制了基因的轉(zhuǎn)錄使mRNA的相對量又會降低。本研究分析認(rèn)為，花絨寄甲mth-like2基因可能與赤擬谷盜一樣，基因下調(diào)時(shí)降低其耐饑性[1]，期初花絨寄甲mth-like2基因上調(diào)，其耐饑性可能也得以加強(qiáng)。至于為什么在持續(xù)饑餓的情況下，花絨寄甲mth-like2基因又會降低到如此低的水平，還需要進(jìn)一步深入研究。

本研究克隆了一條花絨寄甲mth-like2基因，獲得具有完整開放閱讀框的序列，并對其表達(dá)情況進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)了花絨寄甲mth-like2基因在不同情況下是差異性表達(dá)的，這表明花絨寄甲mth-like2基因的功能可能與其他昆蟲相似，在變態(tài)發(fā)育過程中起重要作用，影響成蟲的壽命，并且與成蟲的抗氧化脅迫、抗高溫脅迫和抗饑餓脅迫能力相關(guān)。本研究為進(jìn)一步研究mth-like2受體及其他Mth-like受體的功能奠定了基礎(chǔ)。

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第一作者簡介：王化鵬，男，1989年2月生，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:hppWang@163.com。 通信作者：李孟樓，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:limenglou@hotmail.com。

收稿日期：2015年12月29日。

分類號S763.3；Q786

Identification and Expression of methuselah-like Gene in Dastarcus helophoroides//

Wang Huapeng, Hao Chunfeng, Zhang Zhengqing, Zhang Wei, Chang Yong, Li Menglou(Northwest A&F University, Yangling 712100, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：102-107.

The experiment was conducted to clone and identify the Mth-like receptor gene in Dastarcus helophoroides, and study its expression profiles.mth-like2 was cloned using the method of rapid amplification of cDNA ends.The structure of Mth-like2 receptor was analyzed by bioinformatic methods.The expression profiles were analyzed by real-time qPCR.The full length cDNA sequence (2 117 bp) was obtained from D.Helophoroides and named as mth-like2.By sequence analysis, the open reading frame of mth-like2 was 1 458 bp in length, encoding 485 amino acid residues with an estimated molecular weight of 56.77 kDa and PI 8.83, with 7 transmembrane domains.By phylogenetic analysis, the amino acid sequences of the protein showed high identity to the corresponding protein from Tribolium castaneum.Real time quantitative PCR analysis showed variation in expression patterns of mth-like2 in different tissues (highly expressed in reproductive systems) and at different developmental stages (highly expressed in the 6-year instar larva), indicating that mth-likes were likely to involved in reproduction and development.mth-like2 expression was also significantly altered or remained stable in aging adults and under oxidation, high temperature and starvation stress, indicating that mth-like2 was to involved in aging and the resistance of oxidation, high temperature and starvation.

KeywordsDastarcus helophoroides; Mth-like receptor; Gene cloning; Real-time qPCR

1)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170608)。

責(zé)任編輯：程紅。