尹萬瑞　朱天輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都，611130)

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核桃枝枯病病原菌生物學(xué)特性及藥劑防治1)

尹萬瑞朱天輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都，611130)

摘要對核桃枝枯病的新病菌新殼梭孢(Neofusicoccum parvum)研究發(fā)現(xiàn),菌落生長初期顏色為白色，逐漸成灰黑色，培養(yǎng)3周后變成黑色。最佳培養(yǎng)條件為：PDA培養(yǎng)基、溫度25～30 ℃、pH=7～8、全光照、100%濕度、碳源為葡萄糖，氮源為谷氨酸。選取9種化學(xué)藥劑對病菌進行了室內(nèi)藥劑的篩選，通過菌絲生長抑制試驗，篩選出70%甲基托布津可濕性粉劑、50%多菌靈可濕性粉劑和75%百菌清可濕性粉劑3種高效藥劑，其抑制率依次為66.67%、64.44%、44.44%。

關(guān)鍵詞核桃；核桃枝枯?。缓颂抑莶∩飳W(xué)特性；核桃枝枯病化學(xué)防治

核桃枝枯病在世界各地均有發(fā)生，不同的地域其病原也并非全相似。我國的核桃枝枯病也尤其嚴(yán)重，多分布在遼寧、山東、四川等地[1-3]。作為核桃(Juglans regia)主要常見的病害，大量的專家學(xué)者也對引起核桃枝枯病的病原進行了大量的調(diào)查研究并取得了一定的成就[4]，研究認為核桃枝枯病的病原有胡桃楸擬莖點霉(Phomopsis juglandina)，半知菌亞門黑盤孢[5-7]，葡萄座腔菌屬的Botryosphaeria dothidea、B.fabicercianum[8-10]、B.obtusa[11-14]等。筆者對四川地區(qū)核桃枝枯病的病害調(diào)查表明，引起四川地區(qū)核桃枝枯病的病原為新殼梭孢(Neofusicoccum parvum)，在國內(nèi)關(guān)于該病害的相關(guān)資料文獻較少，但是這一病原菌在國外先后引起過核桃、柑橘(Citrus reticulata)、葡萄(Vitis vinifera)等的枝枯病，引起國外植物保護專家學(xué)者的重視[13，15-16]。筆者研究該病害的發(fā)病規(guī)律，并進行相應(yīng)的藥劑試驗，為生產(chǎn)實踐中防治該核桃枝枯病提供一些理論和實踐依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

2014年3月—12月，對四川雅安、綿陽等核桃種植區(qū)域采樣，進行組織分離培養(yǎng)，經(jīng)過病原菌形態(tài)、培養(yǎng)形狀、及致病性等方面的研究，確定該病原菌為新殼梭孢(Neofusicoccum parvum)。本菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護實驗室鑒定并提供菌株。

1.2病原菌的生物學(xué)特性

培養(yǎng)基對菌絲生長的影響：用直徑為5 mm的滅菌打孔器打取在PDA平板上培養(yǎng)5 d的核桃枝枯病病菌菌餅，分別接種到PDA、PDA+維生素B6、燕麥、玉米、查氏、淀粉6種培養(yǎng)基上，并設(shè)置對照，于恒溫箱中25 ℃培養(yǎng)3 d，重復(fù)3次，3 d后用十字交叉法[17]測量菌落直徑，每個處理5次重復(fù)。

溫度對菌絲生長的影響：將菌株用無菌打孔器取直徑5 mm的菌餅接種于PDA平板中央，分別置于5～40 ℃，每5 ℃為一梯度，共9種溫度下培養(yǎng)，于48 h后分別用十字交叉法檢測菌落直徑及萌發(fā)狀況，每個處理5次重復(fù)。

光照條件對菌絲生長的影響：用無菌打孔器取直徑5 mm的菌餅接種于PDA平板中央，分別置于24 h全光照、12 h光暗交替、24 h全黑暗3種光照條件下，培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，十字交叉法測量菌落直徑，每個處理5次重復(fù)。

pH值對菌絲生長的影響：將滅菌后的PDA用1 mol·L-1的HCL和1 mol·L-1的NaOH調(diào)配成pH值5～11，以1為1個梯度，共7種。用無菌打孔器取5 mm的菌餅接種于上述7種不同pH值的PDA中，置于人工氣候箱中25 ℃培養(yǎng)，分別于2、3 d后測量菌落直徑，每個處理5次重復(fù)。

碳源、氮源對菌絲生長的影響：以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用果糖、淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖等量替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)的碳源，用磷酸銨、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨等量替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)的氮源，以不加碳源和不加氮源的查氏培養(yǎng)基為空白對照(CK)。取直徑5 mm的菌餅接種于上述培養(yǎng)基平板中央，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)3 d，按十字交叉法測量菌落直徑，每個處理5重復(fù)。

濕度對菌絲生長的影響：利用氣候培養(yǎng)箱設(shè)置相對濕度為100%、95%、90%、85%、80%、75%的6個層次，取直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)2 d，按照上述方法每隔1 d測量菌落直徑，每個處理5次重復(fù)。

致死溫度的測定：將待測菌放入試管中，在水浴鍋內(nèi)處理10 min，水浴鍋的溫度設(shè)置為40、45、50、55、60、65 ℃。每個處理重復(fù)5次。將處理后的菌絲塊和菌核接種于PDA培養(yǎng)基上，確定其致死溫度。

1.3藥劑防治

選用9種殺菌劑(表1)用于室內(nèi)毒力測定。將殺菌劑用無菌水配制成1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mg·L-1的藥液，取1 mL藥液加入到溫度降至50 ℃左右的滅菌培養(yǎng)基(9 mL)中，搖勻后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，制成PDA含藥平板培養(yǎng)基。取培養(yǎng)3 d的病菌菌落，用無菌的打孔器打取5 mm的菌餅，移入加藥的PDA平板中央，每皿一個菌餅，另設(shè)不含藥培養(yǎng)基為對照，每個處理5次重復(fù)，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑大小，計算出抑制率。將對菌絲的抑制率換算成機率值，以各處理的殺菌劑的質(zhì)量濃度對數(shù)值為自變量(x)，以相應(yīng)處理對病原菌菌絲機率值為因變量(y)，應(yīng)用統(tǒng)計回歸方法，擬合出質(zhì)量濃度對數(shù)-抑制百分率機率值毒力曲線(y=ax+b)。并且把抑制率為50%時的機率值代入毒力方程求出x，再轉(zhuǎn)化成抑菌中濃度EC50[18]。EC50越小，即濃度越小，說明該藥劑對病菌菌絲的抑制作用越好。抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

表1　供試菌劑

2結(jié)果與分析

2.1病原菌培養(yǎng)性狀

該菌在PDA培養(yǎng)基平板長勢較快，形成圓形或者近似圓形的菌落。菌落的氣生菌絲發(fā)達，菌絲有隔，邊緣整齊，菌落初期顏色由白色轉(zhuǎn)變成灰黑色，3周后變成黑色。該菌在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d左右開始產(chǎn)生分生孢子器，經(jīng)過紫外線照射10 min左右再培養(yǎng)3 d，產(chǎn)孢子較快。分生孢子器近似圓形或者不規(guī)則的形狀。分生孢子近似橢圓形，單孢子，壁薄，顏色透明，無隔，大小相當(dāng)，為(15.2～17.2)μm×(4.6～6.4)μm(圖1)。

A-C.在PDA培養(yǎng)基中的顏色變化；D.菌絲形態(tài)；E-F.分生孢子。

2.2病原菌的生物學(xué)特性

2.2.1不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

通過試驗發(fā)現(xiàn)，病原菌在不同培養(yǎng)基上均能夠生長，接種于維生素B2、PSA、查氏培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、PDA分別培養(yǎng)3 d后，其菌落平均直徑分別為4.35、5.30、4.70、4.05、3.30、5.50 cm，其中對照培養(yǎng)基(水+瓊脂)平均菌落直徑為2.70 cm。結(jié)果表明，選擇PDA培養(yǎng)基最有利于菌絲生長發(fā)育、其次是PSA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和維生素B2培養(yǎng)基。

2.2.2不同溫度對菌絲生長的影響

病原菌在5～45 ℃不同梯度(每5 ℃為一梯度)培養(yǎng)2 d后，其菌落平均直徑分別為0.52、0.52、1.28、2.33、4.92、4.58、3.87、3.67、3.33 cm。結(jié)果表明，菌絲生長趨勢隨著溫度遞增由低到高再降低，整體上適合高溫生長。其中，在25～30 ℃下菌絲生長活力最旺盛，而在10 ℃以下生長極度緩慢或者不生長。

2.2.3不同光照條件對菌絲生長的影響

在全光照、24 h光黑暗交替、全黑暗條件下培養(yǎng)該菌2 d后，其菌落平均直徑分別為2.21、2.07、1.82 cm。結(jié)果表明，該菌在全光照條件生長較快、其次為光暗交替，而在黑暗條件下生長速度最慢。

2.2.4不同pH值對菌絲生長的影響

由表2可見，病原菌在酸性條件下能生長，在中性(pH=7～8)條件下生長快且穩(wěn)定，而當(dāng)堿性增強時，其生長逐漸受到抑制。

表2　pH值對核桃枝枯病病原菌菌絲生長的影響

2.2.5不同碳源、氮源對菌絲生長的影響

在以甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉為碳源的生長試驗中，培養(yǎng)3 d后，病原菌的平均菌落直徑分別為2.88、3.87、4.38、3.31、2.97 cm。結(jié)果表明，葡萄糖是最利于病原菌生長的碳源，其次為蔗糖和麥芽糖。

在以谷氨酸、尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀為氮源的生長的試驗中，培養(yǎng)3 d后，病原菌的平均菌落直徑分別為5.22、1.72、4.51、3.81、4.32 cm。結(jié)果表明，谷氨酸是最有利于菌絲生長的氮源，其次為硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨，尿素對菌絲生長有一定的抑制。

2.2.6不同濕度對菌絲生長的影響

相對濕度在60%～100%時，對菌絲生長影響不明顯(表3)。相對濕度較高時，菌絲生長較快，在相對濕度為100%時，菌絲生長最旺盛，菌絲體發(fā)達。

表3　濕度對核桃枝枯病病原菌菌絲生長的影響

2.2.7致死溫度

病原菌在40～65 ℃不同梯度(每5 ℃為一梯度)處理后，培養(yǎng)3 d，測得菌落平均直徑分別為3.33、3.06、2.31、1.68、0、0 cm。結(jié)果表明，經(jīng)水浴鍋60 ℃高溫10 min后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，其菌絲也未生長。因此，確定60 ℃為其致死溫度。

2.3藥劑防治

將病原菌接種在含藥劑制成的培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)7 d，計算出菌絲在不同藥劑中的生長情況。由表4可知，不同質(zhì)量濃度的不同藥劑對菌絲抑制的情況差異較大。9種藥劑在1.25～40.00 mg·L-1時，隨著藥劑質(zhì)量濃度的增大菌落開始變小，在40 mg·L-1的時候，抑制率高于40%的有75%百菌清可濕性粉劑、70%甲基托布津可濕性粉劑、50%多菌靈可濕性粉劑；其中80%代森錳鋅可濕性粉劑、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、30%氟菌唑可濕性粉劑、40%氫氧化銅水分散粒劑對菌絲有一定的抑制作用，但抑制率很低；而50%退菌特可濕性粉劑對菌絲未見抑制作用。

表4　殺菌劑對核桃枝枯病病原菌的抑制情況

續(xù)(表4)

由篩選出的防治該菌效果較好的3種化學(xué)藥劑各處理質(zhì)量濃度對數(shù)值為自變量(x)，以相應(yīng)處理對病原菌菌絲機率值為因變量(y)，應(yīng)用統(tǒng)計回歸方法，擬合出質(zhì)量濃度對數(shù)-抑制百分率機率值毒力曲線(y=ax+b)，求出抑菌中濃度EC50(表5)。結(jié)果表明，70%甲基托布津?qū)颂也≡腅C50值最小，表明該藥劑對病原菌的抑制作用最好，其次為50%多菌靈和75%百菌清。

表5　有效殺菌劑對病原菌生長的回歸方程及EC50

3結(jié)論

本研究就核桃枝枯病菌新病原新殼梭孢進行生物學(xué)特性研究及防治試驗，結(jié)果表明，該菌在PDA培養(yǎng)基、25～30 ℃、pH=7～8、光照條件下適合生長，該菌的致死溫度為60 ℃。在藥劑防治試驗中，70%甲基托布津可濕性粉劑對核桃病原菌抑制的EC50值最小，為4.521 4 mg·L-1，抑制效果最好，較差的50%多菌靈可濕性粉劑和75%百菌清可濕性粉劑EC50值依次為4.624 0、7.193 0 mg·L-1，對菌絲抑制有一定的防效。

不同的營養(yǎng)、溫度、pH值、光暗條件等對菌絲的生長有較大地影響。生長的最佳條件與核桃枝枯病發(fā)病高峰期相吻合(7—8月份)。7—8月份，當(dāng)?shù)販囟容^高、光照充足、雨水天氣較多，濕度大，加劇了病原傳播速度，導(dǎo)致核桃枝枯病的大量發(fā)生。因此，應(yīng)該在病發(fā)初期進行預(yù)防，生產(chǎn)上進行施肥除草、修剪整形。當(dāng)發(fā)病時，應(yīng)做到及時施藥，減少病菌在核桃枝條的殘留，使核桃保持健康生長。

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第一作者簡介：尹萬瑞，男，1990年7月生，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:ywrui668@126.com。 通信作者：朱天輝，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:zhuth1227@tom.com。

收稿日期：2015年6月28日。

分類號S664.1；S763.1

Biological Characteristics of Walnut Branch Rot Pathogen and Its Chemical Prevention//

Yin Wanrui, Zhu Tianhui(Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：98-101.

We studied the walnut branch rot, a new pathogen called Neofusicoccum parvum, and found that the initial growth color of colony was white, ash black gradually, then black after it was cultured after three weeks.The optimum culture conditions for walnut branch pathogen were under the PDA medium, 25 ℃-30 ℃, full illumination, 100% of humidity, the carbon source of glucose, and a nitrogen source.We selected nine kinds of chemicals which were screened for bacteria pharmacy test chamber, then three kinds of effective pharmacy screened by using the mycelial growth inhibition test.The best control effect successively were 70% thiophanate-methyl wettable powder, 50% carbendazim WP and 75% chlorothalonil WP with inhibition ratios of 66.67%, 64.44% and 44.44%, respectively.

KeywordsWalnut; Walnut branch rot; Biological characteristics of walnut branch rot; Chemical prevention of walnut branch rot

1)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院基礎(chǔ)應(yīng)用研究專項課題。

責(zé)任編輯：程紅。