郝春鳳　王化鵬　張正青　常勇　李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

?

花絨寄甲HSP70基因的特征與表達(dá)1)

郝春鳳王化鵬張正青常勇李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

摘要為闡明熱休克蛋白70(HSP70)在花絨寄甲(Dastarcus helophoroides)發(fā)育及雌雄成蟲抵抗環(huán)境脅迫中的作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了其在發(fā)育階段和環(huán)境脅迫時(shí)的表達(dá)情況。從花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中獲得3條HSP70基因，分別命名為D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88。發(fā)育階段定量結(jié)果顯示，3條HSP70在所有發(fā)育階段均有表達(dá)，D.hHSP69.09在1齡幼蟲期表達(dá)量最高；D.hHSP70.11和D.hHSP71.88在雄蟲中表達(dá)量最高。在檢測的成蟲組織中，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11在卵巢表達(dá)量最高；D.hHSP71.88在脂肪體中表達(dá)量最高。HSP70基因隨溫度升高(23 ℃升至44 ℃)、41 ℃下處理時(shí)間(0～270 min)延長、氧化劑濃度(0～70 mmol·L-1)的升高表達(dá)量先增加后減少，雌雄表達(dá)量差異較大。饑餓試驗(yàn)顯示，雌雄蟲表達(dá)模式不同；隨饑餓時(shí)間延長，雄蟲HSP70基因表達(dá)量有所降低，雌蟲一定時(shí)間內(nèi)有所上升。因此，花絨寄甲HSP70可能與不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)換、幼蟲的蛻皮行為相關(guān)； HSP70對溫度、氧化和饑餓脅迫的應(yīng)激敏感程度和表達(dá)水平不同，能夠有效應(yīng)對高溫、氧化、饑餓等環(huán)境脅迫。

關(guān)鍵詞花絨寄甲；逆境脅迫；HSP70；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

花絨寄甲(Dastarcus helophoroides)是多種林木蛀干害蟲如栗山天牛(Massicus raddei)、云斑天牛(Batocera horsfieldi)、松褐天牛(Monochamus alternatus)、光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)、銹色粒肩天牛(Apriona swainsoni)等最為有效的天敵昆蟲[1]，其幼蟲寄生在天牛末齡幼蟲和蛹上[2]。有報(bào)道指出，高溫等環(huán)境脅迫能夠顯著影響昆蟲的存活、發(fā)育和生殖[3-4]?；ńq寄甲成蟲有著相對較長的壽命，人工飼養(yǎng)8 a以上，在自然環(huán)境中，由于各種不利環(huán)境因素的影響，比如氣候變化、生態(tài)環(huán)境惡化、病原微生物的入侵等，花絨寄甲的壽命往往達(dá)不到人工飼養(yǎng)條件下的壽命。由自然界中的逆境傷害所引起的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集對細(xì)胞的生存造成重要的威脅[5]。然而，昆蟲已進(jìn)化出一系列生理方面的策略來避免逆境造成的傷害，如昆蟲通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白的合成來維持細(xì)胞蛋白平衡。熱休克蛋白作為分子伴侶，與其他保護(hù)蛋白和輔助蛋白一致，在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、定位和降解等必要的生理活動中發(fā)揮重要作用[6-7]。

熱激反應(yīng)是生物體自我保護(hù)的重要機(jī)制之一，首次發(fā)現(xiàn)于黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的短暫熱應(yīng)激過程[8]。熱休克蛋白家族作為一個(gè)大家族，依據(jù)分子質(zhì)量大小及其序列相似性，將HSP分為5個(gè)家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和small HSPs(sHSPs)[9]。其中，HSP70被認(rèn)為是最重要、最保守的熱休克蛋白家族,具有最高溫度敏感性。一般通過分子伴侶作用、抗氧化作用、協(xié)同免疫作用和抗細(xì)胞凋亡作用對出現(xiàn)的應(yīng)激有保護(hù)耐受作用[10]。

目前，熱休克蛋白在抵抗熱脅迫方面的重要作用已經(jīng)得到了人們的廣泛認(rèn)識[11-12]。當(dāng)環(huán)境溫度高于正常水平時(shí)，誘導(dǎo)性熱休克蛋白就會合成，從而能夠增加生物體對高溫的耐受力，保護(hù)機(jī)體免受熱損傷[13]。雖然熱休克反應(yīng)在果蠅中首次被發(fā)現(xiàn)，人們對昆蟲熱休克蛋白的認(rèn)識遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如細(xì)菌、植物和哺乳類動物。除了分子伴侶的基本功能外，最近研究表明，HSP70還可能與昆蟲的發(fā)育有關(guān)，特別是幼蟲到蛹的轉(zhuǎn)變過程。在斑潛蠅(Liriomyza sativae)的研究中蛹期3條sHSPs的表達(dá)量最高，3條sHSPs的表達(dá)量隨著發(fā)育不斷上升[14]。在小菜蛾(Mamestra brassicae)的研究中也表現(xiàn)出相似的結(jié)果[15]。

隨著對熱休克蛋白認(rèn)識的不斷深入，熱休克蛋白應(yīng)對高溫、低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究，雖然人們已經(jīng)明確知道熱休克蛋白的功能還有很多，如抗氧化、饑餓等，但對于其他抗性的研究并不多見。近年來，抗逆性研究是科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展與成熟使研究基因表達(dá)不再局限于模式物種[16-17]。

利用釋放花絨寄甲防治天牛類害蟲，高效、對環(huán)境友好?；ńq寄甲具有耐高溫、耐饑餓等特性，對不利環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)。在中國，花絨寄甲作為防治天牛類害蟲的重要天敵昆蟲，在生物的防治中具有重要的地位，而對于花絨寄甲熱休克蛋白方面的研究尚未開展。不同種類的熱休克蛋白在抵抗環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮的作用及表達(dá)模式尚不明確。因此，研究花絨寄甲熱休克蛋白70家族是十分必要的。

從花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中獲得3條HSP70基因，通過RT-qPCR分析其在不同發(fā)育階段與組織中的表達(dá)模式。檢測花絨寄甲對不同環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)用RT-qPCR的方法探究HSP基因在非生物應(yīng)激(如高溫、氧化、饑餓處理)中的表達(dá)特性，分析HSP70在非生物應(yīng)激中的作用。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx和處理方式

花絨寄甲幼蟲、蛹和成蟲由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林害蟲生物防治實(shí)驗(yàn)室提供?；ńq寄甲成蟲用主要成分為蠶蛹粉的人工飼料飼養(yǎng)在人工氣候箱內(nèi)。飼養(yǎng)條件為，溫度(23±1)℃、相對濕度70%～80%、光照周期16 h光照8 h黑暗。

溫度處理：用干式恒溫器對雌雄成蟲進(jìn)行溫度處理，包括不同溫度(26、29、35、38、41、44 ℃)刺激2 h后保存；41 ℃處理不同時(shí)間(0、30、60、90、120、150、180、210、240、270 min)后保存。

饑餓處理：將待試雌雄成蟲分為對照組和試驗(yàn)組，飼養(yǎng)在相同條件下，對照組正常喂食，試驗(yàn)組不進(jìn)行喂食，按照時(shí)間梯度(2 d)收集后保存。

氧化處理：用百草枯作為氧化劑。成蟲用0、10、20、30、40、50、60、70 mmol·L-1的百草枯處理2 h，選取HSP表達(dá)敏感的濃度進(jìn)行不同時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6 h)處理。

饑餓處理：由于雌雄成蟲在饑餓條件下存活時(shí)間不同，選取雌蟲饑餓條件下(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 d)的樣品，雄蟲饑餓條件下(0、2、4、6、8、10、12、14、16 d)的樣品。

成蟲組織分離：將活的成蟲置于冰上解剖，迅速分離頭、胸、中腸、后腸、脂肪體、精巢、卵巢及殘?bào)w，用生理鹽水沖洗后立即保存。

所有試驗(yàn)樣本選取后立即放入液氮中冷凍，并于冰箱中-80 ℃保存。每個(gè)處理均進(jìn)行3個(gè)生物重復(fù)。

1.2花絨寄甲HSP70序列檢索

花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中所有序列已經(jīng)通過NCBI中的Blastx工具在Nr數(shù)據(jù)庫中得到注釋，注釋截點(diǎn)E值為10-5。通過在轉(zhuǎn)錄組中的注釋文件中檢索關(guān)鍵詞(HSP或者h(yuǎn)eat shock protein)篩選出花絨寄甲的HSP70序列。

1.3序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

采用NCBI中的ORF finder工具，分析HSP70其可能的開放閱讀框并翻譯為氨基酸。對所有的HSP70氨基酸序列進(jìn)行氨基酸組成分析；獲得的氨基酸序列通過ExPASy的compute pI/Mw工具預(yù)測蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。通過Blast將cDNA和氨基酸序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的其他物種序列進(jìn)行比較。同時(shí)對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫下載鞘翅目的赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、異色瓢蟲(Harmonia axyridis)、馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata)、大猿葉甲(Colaphellus bowringi)，鱗翅目的八字地老虎(Xestia cnigrum)、二化螟(Chilo suppressalis)，半翅目的扶桑綿粉(Phenacoccus solenopsis)、褐飛虱(Nilaparvata lugens)，以及雙翅目的致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)的HSP70氨基酸序列，利用ClastalW軟件對所有下載的HSP70和花絨寄甲的HSP70進(jìn)行序列比對，比對后用Mega 5.02分析其演化關(guān)系，采用Neighbor-joining算法構(gòu)建進(jìn)化樹，置信度設(shè)置為1 000[16]。

1.4生物信息學(xué)分析

保守區(qū)域檢測：NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

等電點(diǎn)及分子質(zhì)量預(yù)測：http://us.expasy.org/tools/peptidemass.html。

蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)預(yù)測：PROSITE數(shù)據(jù)庫http://cn.expasy.org/prosite。

DNAman 5.5.2軟件用于氨基酸或者核苷酸的多序列比對；MEGA 5.2軟件用于系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及分析；Photoshop 10軟件用于圖像處理。

1.5總RNA提取和第1鏈cDNA合成

花絨寄甲樣品均用Trizol reagent試劑盒(Sangon，上海)提取其總RNA。總RNA的質(zhì)量和濃度在Maestro-NANO UV spectrophotometer上用分光光度法測定。每個(gè)重復(fù)各取1 μg的總RNA構(gòu)建20 μL的反應(yīng)體系，使用oligo(dT)18引物和Moloney Murine Leukemia virus(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶(Sangon，上海)進(jìn)行第1鏈cDNA的合成。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR)表達(dá)分析

完成每個(gè)樣第1鏈cDNA的合成后，用RT-qPCR技術(shù)在Bio-rad IQ5儀器上測定HSP70 mRNA的表達(dá)量。染料選用SYBR Green Mix(CWBIO，北京)。根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果，內(nèi)參基因用EF-1α和α-Tubulin。每對定量引物通過10倍稀釋的模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證，引物見表1。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)中所用引物

RT-qPCR試驗(yàn)采用20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行，循環(huán)條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.7數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)用相對定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算分析[18]。數(shù)據(jù)顯著差異性分析采用SPSS中的Tukey方法。用Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1花絨寄甲HSP70基因的檢索和序列分析

通過搜索花絨寄甲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫得到3條HSP70基因，經(jīng)NCBI的Blastp工具在線比對，發(fā)現(xiàn)其同源性與其他昆蟲的HSP70基因同源性最高，根據(jù)相對分子質(zhì)量大小分別命名為D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88。

D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88基因的ORF大小分別為1 980、1 967、1 910 bp，編碼626、636和655個(gè)氨基酸。利用在線軟件對HSP70進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88的理論等電點(diǎn)分別為5.57、6.01和5.93，相對分子質(zhì)量約為69 092、70 112、71 881。

編碼的氨基酸組成中，D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88分別含有73、70、73個(gè)谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)，占總氨基酸的比例分別為11.7%、11.0%和11.2%。

多序列比對結(jié)果顯示，D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88與其他昆蟲(T.castaneum、H.axyridis、L.decemlineata、X.cnigrum、C.suppressalis、P.solenopsis、N.Culex quinquefasciatus)的HSP基因的同源性在65%～100%(圖1)。

暖風(fēng)器入口風(fēng)溫是暖風(fēng)器設(shè)計(jì)的一個(gè)重要參數(shù)，按照《GB 50660—2011大中型火力發(fā)電廠設(shè)計(jì)規(guī)范》：“選擇暖風(fēng)器所用的環(huán)境溫度，對采暖地區(qū)宜取用冬季采暖室外計(jì)算溫度,對非采暖區(qū)宜取用冬季最冷月平均溫度，并適當(dāng)留有加熱器面積”[1]，但是在實(shí)際運(yùn)行中發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)寒地區(qū)暖風(fēng)器出口風(fēng)溫不滿足空預(yù)器入口溫度的要求。

利用PROSITE數(shù)據(jù)庫對氨基酸序列進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測(表2)，3條HSP70基因中均具有3個(gè)HSP70簽名序列，位置大致相同。3條HSP70基因的簽名序列1均相同，D.hHSP69.09與D.hHSP70.11的簽名序列2相同，3條HSP70的簽名序列3均有所不同。

表2　花絨寄甲HSP70基因氨基酸序列功能位點(diǎn)預(yù)測

在D.hHSP69.09和D.hHSP70.11的C-末端存在V/IEEVD基序。有研究表明，C-末端保守的V/IEEVD基序與分子伴侶輔助因子的識別有關(guān)，能夠使HSP70綁定到其他協(xié)同伴侶上[19]，表明D.hHSP69.09和D.hHSP70.11是一種細(xì)胞質(zhì)型HSP。D.hHSP71.88的C-末端為IDEAD，目前尚未找到關(guān)于該序列的研究。

從NCBI上通過比對下載氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。圖2表明，3條序列分為3個(gè)獨(dú)立進(jìn)化支，其中，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11所在分支親緣關(guān)系更近，D.hHSP71.88單獨(dú)在另一分支。從進(jìn)化樹上可見，D.hHSP69.09和同屬鞘翅目的大猿葉甲、馬鈴薯葉甲的HSP70基因遺傳距離較近；D.hHSP70.11與同屬鞘翅目的赤擬谷盜的HSP70基因遺傳距離最近。

黑色背景.一致性為100%；灰色背景.一致性大于等于75%。

圖2　花絨寄甲HSP70基因與GeneBank已登錄的其他物種的HSP70基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2定量PCR

2.2.1HSP70在花絨寄甲不同發(fā)育階段的表達(dá)

以EF-1α作為內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)，分析HSP70 mRNA在不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式。表3所示，3條基因的表達(dá)水平在花絨寄甲整個(gè)發(fā)育過程中波動很大。D.hHSP69.09在1齡幼蟲期表達(dá)量最高；D.hHSP70.11和D.hHSP71.88在雄蟲中表達(dá)水平最高。3條HSP70在蛹期的相對表達(dá)量均較高。表明，3條HSP70基因表達(dá)的增強(qiáng)總是與不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，包括幼蟲-蛹、蛹-成蟲的轉(zhuǎn)換。通過SPSS分析，老熟幼蟲、蛹、成蟲之間HSP70的表達(dá)量在生物學(xué)統(tǒng)計(jì)上差異顯著。

幼蟲階段HSP70基因隨齡期的增加，mRNA的表達(dá)量逐漸減小，因此，推測HSP70基因可能和花絨寄甲幼蟲的發(fā)育存在某種關(guān)系。

表3　花絨寄甲不同發(fā)育階段HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2HSP70在花絨寄甲不同組織中的表達(dá)

為探究花絨寄甲HSP70基因組織分布特性，以EF-1α作為內(nèi)參基因，對HSP70基因在頭、胸、精巢、卵巢、中腸、后腸和脂肪體中表達(dá)量進(jìn)行分析。HSP70基因在不同組織中表達(dá)量的異同可能反映在一個(gè)特定的組織對熱休克蛋白的需要。

表4所示，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11 mRNA的相對表達(dá)量在卵巢中最高，其次在中腸。D.hHSP71.88基因在脂肪體中相對表達(dá)量最高，其次在精巢。HSP70基因相對表達(dá)量在脂肪體和中腸中相對較高。

表4　花絨寄甲不同組織中HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.3高溫應(yīng)激反應(yīng)下花絨寄甲HSP70的表達(dá)

以α-Tubulin作為內(nèi)參基因，分析HSP70基因在高溫應(yīng)激下的表達(dá)模式。表5顯示，雌雄成蟲HSP70 mRNA的表達(dá)量存在明顯差異。在23 ℃時(shí)，D.hHSP69.09雌蟲mRNA的表達(dá)量顯著高于雄蟲，雌蟲的表達(dá)量約為雄蟲的2倍；與D.hHSP69.09不同，D.hHSP70.11和D.hHSP71.88雄蟲mRNA的表達(dá)量顯著高于雌蟲，D.hHSP70.11雄蟲的表達(dá)量約為雌蟲的5倍；D.hHSP70.11雄蟲的表達(dá)量約為雌蟲的150倍。

表5　不同溫度(處理2 h)下花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

高溫刺激下HSP70基因均被誘導(dǎo)，表達(dá)趨勢相似。隨溫度上升，表達(dá)量逐漸升高，至一定溫度后下降。但是，不同基因表達(dá)程度存在巨大差異，表達(dá)量最高點(diǎn)所對應(yīng)的溫度不同。雌雄成蟲中D.hHSP69.09在38 ℃高溫刺激時(shí)相對表達(dá)量最高，其中，雌蟲的mRNA表達(dá)量約為雄蟲的3倍。D.hHSP70.11雌蟲在38 ℃高溫刺激時(shí)相對表達(dá)量最高，雌蟲的mRNA表達(dá)量約為雄蟲的2倍，雄蟲在35 ℃高溫刺激時(shí)mRNA表達(dá)量最高，雄蟲的mRNA表達(dá)量約為雄蟲的12倍。D.hHSP71.88雌蟲在38 ℃高溫刺激時(shí)表達(dá)量最高，雄蟲的mRNA表達(dá)量約為雌蟲的3倍；雄蟲在38 ℃高溫刺激時(shí)表達(dá)量最高，雄蟲的mRNA表達(dá)量約為雌蟲的77倍。

為更好地分析HSP70基因在高溫刺激下的生理作用，對應(yīng)激反應(yīng)較為敏感的溫度41 ℃做不同時(shí)間熱激處理。由表6可見，3條基因均出現(xiàn)隨處理時(shí)間的延長而誘導(dǎo)增加的趨勢。41 ℃高溫刺激后短時(shí)間內(nèi)雌蟲HSP70基因表達(dá)量明顯高于雄蟲，隨著時(shí)間延長雄蟲的表達(dá)量高于雌蟲。

表6　41 ℃處理不同時(shí)間時(shí)花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.4氧化脅迫下花絨寄甲HSP的表達(dá)

由表7可見，以α-Tubulin作為內(nèi)參基因，在不同濃度氧化處理下HSP70表現(xiàn)出被誘導(dǎo)，表達(dá)量先升高后下降；雌雄成蟲HSP70 mRNA的表達(dá)量存在顯著差異。D.hHSP69.09雌蟲mRNA的表達(dá)量顯著高于雄蟲，雌蟲在20 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，約為雄蟲的3.8倍；雄蟲在30 mmol·L-1時(shí)最高，雌蟲的表達(dá)量約為雄蟲的1.8倍；D.hHSP70.11和D.hHSP71.88雄蟲mRNA的表達(dá)量顯著高于雌蟲。D.hHSP70.11和D.hHSP71.88雌蟲在20 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，其中，D.hHSP70.11雌蟲的表達(dá)量約為雄蟲的3.8倍，D.hHSP71.88雌蟲的表達(dá)量約為雄蟲的100倍，D.hHSP70.11雄蟲在30 mmol·L-1時(shí)最高，雌蟲的表達(dá)量約為雄蟲的2.3倍；D.hHSP71.88雄蟲在20 mmol·L-1時(shí)最高，雌蟲的表達(dá)量約為雄蟲的19倍。

表7　氧化脅迫下花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.5饑餓處理下花絨寄甲HSP的表達(dá)

在相同的饑餓條件處理下，花絨寄甲雌蟲耐饑餓能力高于雄蟲，雌性成蟲可存活超過一月，但是雄成蟲只能存活半月。

以α-Tubulin作為內(nèi)參基因，由表8所示，在饑餓刺激下雌雄蟲表達(dá)水平不同。隨饑餓處理時(shí)間延長，雄蟲中HSP70基因mRNA的表達(dá)量降低，表現(xiàn)出被抑制。

3討論

昆蟲產(chǎn)生熱休克蛋白來抵御環(huán)境中的各種壓力，如極端高溫、種群密集、干燥缺水和低氧等不利生活條件。熱休克蛋白可以保護(hù)機(jī)體蛋白在壓力脅迫下發(fā)生不可逆變性，而且促進(jìn)在脅迫刺激后蛋白的折疊和降解。HSP70被認(rèn)為通過形成分子網(wǎng)絡(luò)在蛋白合成、抗壓能力和滯育方面等發(fā)揮著非常重要的作用。大量表達(dá)的熱休克蛋白是昆蟲生存的重要調(diào)節(jié)器，參與昆蟲的正常發(fā)育和滯育行為。熱休克蛋白在面對諸多非生物刺激時(shí)如高溫和寒冷、紫外輻射、重金屬、化學(xué)殺蟲劑等不良環(huán)境時(shí)，其表達(dá)量顯著被誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。

3.1花絨寄甲HSP70基因的結(jié)構(gòu)

對D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88氨基酸序列分析顯示，花絨寄甲HSP70與其他昆蟲HSP70具有較高的同源性。結(jié)構(gòu)與功能有著密切聯(lián)系，利用PROSITE數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測，3條HSP70基因中均具有3條HSP70家族的簽名序列，位置大致相同。此外，在D.hHSP69.09和D.hHSP70.11的C-末端存在的V/IEEVD基序，表明D.hHSP69.09和D.hHSP70.11是一種細(xì)胞質(zhì)型HSP70。而D.hHSP71.88的C-末端為IDEAD，目前尚未找到關(guān)于該序列的文獻(xiàn)。

表8　饑餓脅迫下花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

花絨寄甲HSP70基因編碼的氨基酸組成中，Gln和Glu在總氨基酸中的比例較高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白質(zhì)在遭受高溫脅迫時(shí)，Gln和Glu可能通過提供額外的靜電作用力維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[20]。

3.2花絨寄甲HSP70基因的時(shí)間和空間特異性

昆蟲的發(fā)育階段是決定一個(gè)昆蟲的耐熱性和耐寒性的一個(gè)重要的因素[21]。花絨寄甲HSP70基因mRNA表達(dá)在花絨寄甲整個(gè)發(fā)育過程中波動很大，波動總與不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，包括幼蟲-蛹、蛹-成蟲。在完全變態(tài)昆蟲中，不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)換總是伴隨相關(guān)基因表達(dá)水平的劇烈波動[22]。在意大利蜜蜂(Apis mellifera)中，卵-幼蟲的轉(zhuǎn)換改變了65種蛋白和34種磷蛋白的表達(dá)水平，新孵化幼蟲增強(qiáng)了蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞骨架及代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，以確保意大利工蜂的快速生長[23]。因此，花絨寄甲HSP70基因在不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)換時(shí)的高水平表達(dá)暗示著其可能通過調(diào)控蛋白質(zhì)折疊來參與花絨寄甲的發(fā)育過程。幼蟲階段HSP70基因隨著齡期的增加，mRNA的表達(dá)量逐漸減小，推測HSP70基因可能和花絨寄甲幼蟲的蛻皮存在某種關(guān)系。

昆蟲中HSP70的表達(dá)模式顯示出明顯的組織特異性。HSP70基因相對表達(dá)量在脂肪體和中腸中較高，推測其可能參與對外源毒物的解毒和氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，說明熱休克蛋白可能在保護(hù)昆蟲機(jī)體免受外源毒物損害存在潛在作用[23]。

D.hHSP69.09和D.hHSP70.11 mRNA在精巢中相對表達(dá)量最高，表明其可能與雄性生殖系統(tǒng)存在某種關(guān)系。精子發(fā)育對高溫極其敏感。果蠅的初級精母細(xì)胞在導(dǎo)入HSP70后對高溫遲鈍[24]。對中國樟木天蠶蛾(Antheraea pernyi)的研究中發(fā)現(xiàn)，Ap-sHSP21在高溫誘導(dǎo)后，在精巢中的表達(dá)水平明顯高于其他組織[25]。在黑腹果蠅的雄配子發(fā)育過程中觀察到熱休克蛋白。HSP26在精子和卵子的發(fā)育中表達(dá)水平需要被調(diào)整[26]。HSP27在精子細(xì)胞減數(shù)分裂后期也被檢測到[27]。由組織特異性分析結(jié)果推測，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11可能參與花絨寄甲雄性生育調(diào)節(jié)過程。

3.3花絨寄甲HSP70基因在不同非生物應(yīng)激中的表達(dá)特性

溫度是重要的環(huán)境因素，它能誘導(dǎo)生物體發(fā)生相關(guān)生理變化而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[28]。在高溫脅迫下，昆蟲會出現(xiàn)各種熱害反應(yīng)。高溫會加快昆蟲體內(nèi)水分的散失，影響昆蟲正常的生理代謝；高溫還會改變昆蟲體內(nèi)代謝途徑，誘發(fā)細(xì)胞中的活性氧簇(ROS)大量增加，從而對蟲體造成傷害。同時(shí)，昆蟲具有一定程度的環(huán)境適應(yīng)性。熱休克蛋白在昆蟲耐溫度脅迫中發(fā)揮著重要作用，可提高昆蟲對不良環(huán)境的耐受性，保護(hù)昆蟲免受或少受脅迫傷害[29]?；ńq寄甲作為變溫動物，它的分布及生存深受環(huán)境溫度的限制，花絨寄甲具有較高的耐高溫特性，最高生存溫度能達(dá)到47 ℃；雌雄成蟲HSP70 mRNA的表達(dá)量存在明顯差異，在高溫刺激下，HSP70基因均被誘導(dǎo)，表達(dá)模式相同，隨溫度上升，表達(dá)量逐漸升高至一定溫度后下降。但不同基因表達(dá)程度存在巨大差異，表達(dá)量最高點(diǎn)所對應(yīng)的溫度不同。因此，花絨寄甲HSP70基因被高溫誘導(dǎo)表達(dá)下過表達(dá)，意味著HSP70基因可能在花絨寄甲熱應(yīng)激反應(yīng)中，通過分子伴侶活性發(fā)揮重要的保護(hù)作用。

以往研究已經(jīng)揭示高濃度的活性氧會對機(jī)體生物大分子產(chǎn)生嚴(yán)重危害，如蛋白、核苷酸和其他細(xì)胞組件等[30]。為減輕過氧化物的損傷，機(jī)體產(chǎn)生了相應(yīng)的防御系統(tǒng)。許多研究已經(jīng)證實(shí)，氧化損傷可被多種環(huán)境條件誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括溫度、殺蟲劑、紫外輻射和重金屬等[31]。

熱休克蛋白被認(rèn)為是響應(yīng)氧化損傷時(shí)細(xì)胞中重要的調(diào)節(jié)器[32]。采用百草枯作為氧化刺激源，結(jié)果表明，根據(jù)花絨寄甲在百草枯氧化應(yīng)激后熱休克蛋白表達(dá)量的變化模式推測，熱休克蛋白在花絨寄甲抗氧化脅迫中發(fā)揮著重要作用。本結(jié)果為熱休克蛋白的抗氧化功能提供了又一理論依據(jù)。

饑餓刺激會對昆蟲產(chǎn)生一系列的復(fù)雜影響，包括營養(yǎng)缺乏、離子平衡被打破以及水平衡失調(diào)等[14]。大量研究報(bào)導(dǎo)表明，饑餓可誘導(dǎo)熱休克蛋白基因的表達(dá)[33]。在對蝶蛹金小峰(Pteromalus puparum)的研究中發(fā)現(xiàn)，饑餓處理24 h后，4條熱休克蛋白基因的表達(dá)水平發(fā)生明顯變化[34]。花絨寄甲雌蟲的耐饑餓能力高于雄蟲。在相同的饑餓條件下，雌性成蟲可存活超過一月，但雄成蟲只能存活半月。饑餓脅迫環(huán)境下花絨寄甲雌雄蟲HSP70 mRNA的表達(dá)水平不同，雄蟲中3條HSP70基因均被抑制；短時(shí)間的饑餓處理，雌成蟲中HSP70基因出現(xiàn)上調(diào)趨勢。推測HSP70基因在雌雄成蟲中的不同表達(dá)模式可能與花絨寄甲耐饑能力以及饑餓壽命相關(guān)。有研究指出，HSP70與昆蟲衰老有重要關(guān)系[24]，這也為下一步的研究提供了方向。

4結(jié)論

從花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中獲得3條熱休克蛋白70基因，分析序列的基本結(jié)構(gòu)特征以及與其他昆蟲HSP70之間的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)花絨寄甲具有HSP70多樣性，在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性。利用Real-time PCR技術(shù)對花絨寄甲HSP70在不同發(fā)育階段以及在高溫、氧化、饑餓刺激下的表達(dá)模式研究，HSP70在花絨寄甲生長發(fā)育、繁殖過程中和抗氧化、抗饑餓等不良環(huán)境刺激下發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果將有助于在分子水平上來評估花絨寄甲的抗逆性能力，而花絨寄甲作為生物防治中重要的天敵昆蟲，在天牛類害蟲生物防治中具有更廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1]魏建榮,楊忠岐,牛艷玲,等.花絨寄甲的分布與生態(tài)學(xué)習(xí)性補(bǔ)充調(diào)查[J].中國森林病蟲,2009,28(1):16-18.

[2]李孟樓,王培新,馬峰,等.花絨堅(jiān)甲對光肩星天牛的寄生效果研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,35(6):152-156.DOI:doi:10.3321/j.issn:1671-9387.2007.06.031.

[3]MIRONIDIS G K, SAVOPOULOU-SOULTANI M.Effects of heat shock on survival and reproduction of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) adults[J].Journal of Thermal Biology,2010,35(2):59-69.

[4]CHEN H, XU X L, LI Y P, et al.Characterization of heat shock protein 90, 70 and their transcriptional expression patterns on high temperature in adult of Grapholita molesta (Busck)[J].Insect Science,2014,21(4):439-448.

[5]BASHA E, O’NEILL H, VIERLING E.Small heat shock proteins and α-crystallins: dynamic proteins with flexible functions[J].Trends in Biochemical Sciences,2012,37(3):106-117.

[6]SONNA L A, FUJITA J, GAFFIN S L, et al.Invited review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression[J].Journal of Applied Physiology,2002,92(4):1725-1742.

[7]S?RENSEN J G, KRISTENSEN T N, LOESCHCKE V.The evolutionary and ecological role of heat shock proteins[J].Ecology Letters,2003,6(11):1025-1037.

[8]RITOSSA F.A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in drosophila[J].Experientia,1962,18(12):571-573.

[9]GARRIDO C, PAUL C, SEIGNEURIC R, et al.The small heat shock proteins family: the long forgotten chaperones[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2012,44(10):1588-1592.

[10]黃文聰.熱休克蛋白70熱耐受性獲得與運(yùn)動應(yīng)答的反應(yīng)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(24):4735-4739.doi:10.3321/j.issn:1673-8225.2008.24.017.

[11]HOFFMANN A A, PARSONS P A.Evolutionary genetics and environmental stress[J].New York: Oxford University Press,1991.

[12]FEDER M E, HOFMANN G E.Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology[J].Annual Review of Physiology,1999,61(1):243-282.

[13]GEHRING W J, WEHNER R.Heat shock protein synthesis and thermotolerance in Cataglyphis, an ant from the Sahara desert[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1995,92(7):2994-2998.

[14]HUANG L H, WANG C Z, KANG L.Cloning and expression of five heat shock protein genes in relation to cold hardening and development in the leafminer, Liriomyza sativae[J].Journal of Insect Physiology,2009,55(3):279-285.

[15]SHOJI S, MUHAMMAD A, HISAAKI T.A comparison of heat shock protein genes from cultured cells of the cabbage armyworm, Mamestra brassicae, in response to heavy metals[J].Archives of Insect Biochemistry & Physiology,2007,65(4):210-222.

[16]LI Z W, LI X, YU Q Y, et al.The small heat shock protein (sHSP) genes in the silkworm, Bombyx mori, and comparative analysis with other insect sHSP genes[J].BMC Evol Biol,2009,9:215.

[17]LIU Z H, XI D M, KANG M J, et al.Molecular cloning and characterization of Hsp27.6: the first reported small heat shock protein from Apis cerana cerana[J].Cell Stress & Chaperones,2012,17(5):539-551.

[18]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D.Analysis or relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2001,25:402-408.

[19]DAUGAARD M, ROHDE M, JTTELM.The heat shock protein 70 family: Highly homologous proteins with overlapping and distinct functions[J].FEBS Letters,2007,581(19):3702-3710.

[20]JACOBSEN J V, SHAW D C.Heat-Stable proteins and abscisic acid action in barley aleurone cells[J].Plant Physiology,1989,91(4):1520-1526.

[21]FIELDS P G.The control of stored-product insects and mites with extreme temperatures[J].J Stored Prod Res,1992,28(2):89-118.

[22]GALA A, YU F, WOLTEDJI D, et al.Changes of proteome and phosphoproteome trigger embryo-larva transition of honeybee worker (Apis mellifera ligustica)[J].Journal of Proteomics, 2013, 78(1):428-446.

[23]ENAYATI A A, RANSON H, HEMINGWAY J.Insect glutathione S-transferases and insecticide resistance[J].Insect Molecular Biology,2005,14(1):3-8.

[24]王海鴻，雷仲仁.昆蟲熱休克蛋白的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(10):2023-2034.

[25]LIU Q N, ZHU B J, DAI L S, et al.Overexpression of small heat shock protein 21 protects the Chinese oak silkworm Antheraea pernyi, against thermal stress[J].Journal of Insect Physiology,2013,59(8):848-854.

[26]GLASER R L, LIS J T.Multiple, compensatory regulatory elements specify spermatocyte-specific expression of the Drosophila melanogaster hsp26 gene[J].Molecular & Cellular Biology,1990,10(1):131-137.

[27]PAULI D, TONKA C H, TISSIERES A, et al.Tissue-specific expression of the heat shock protein HSP27 during Drosophila melanogaster development[J].Journal of Cell Biology,1990,111(3):817-828.

[28]AN M I, CHOI C Y.Activity of antioxidant enzymes and physiological responses in ark shell, Scapharca broughtonii, exposed to thermal and osmotic stress: Effects on hemolymph and biochemical parameters[J].Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2010,155(1):34-42.

[29]段小鳳，王曉慶，李品武，等.幾種環(huán)境因子對昆蟲適應(yīng)性影響的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015,31(14):79-82.

[30]FINKEL T, HOLBROOK N J.Oxidants, oxidative stress and biology of ageing[J].Nature,2000,408:239-247.

[31]KOTTUPARAMBIL S, SHIN W, BROWN M T, et al.UV-B affects photosynthesis, ROS production and motility of the freshwater flagellate, Euglena agilis Carter[J].Aquatic Toxicology,2012,122(3):206-213.

[32]CHRISTIANS E S, ISHIWATA T, BENJAMIN I J.Small heat shock proteins in redox metabolism: Implications for cardiovascular diseases[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2012,44(10):1632-1645.

[33]BENOIT J B, LOPEZ-MARTINEZ G, TEETS N M, et al.Responses of the bed bug, Cimex lectularius, to temperature extremes and dehydration: levels of tolerance, rapid cold hardening and expression of heat shock proteins[J].Medical & Veterinary Entomology,2009,23(4):418-425.

[34]WANG H, LI K, ZHU J Y, et al.Cloning and expression pattern of heat shock protein genes from the endoparasitoid wasp, Pteromalus puparum in response to environmental stresses[J].Archives of Insect Biochemistry & Physiology,2012,79(4/5):247-263.

第一作者簡介：郝春鳳，女，1989年4月生，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:hlzsdau2009@163.com。 通信作者：李孟樓，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:limenglou@hotmail.com。

收稿日期：2015年12月21日。

分類號S763.3 Q786

Characterization and Expression Analysis of HSP70 Gene in Dastarcus helophoroides//

Hao Chunfeng, Wang Huapeng, Zhang Zhengqing, Chang Yong, Li Menglou(Northwest A&F University, Yangling 712100, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：108-115，124.

Three full-length HSP70 genes, D.hHSP69.09, D.hHSP70.11 and D.hHSP71.88, were obtained from Dastarcus helophoroides.The development stage expression analysis by real-time qPCR displayed that three HSP70 genes were expressed in all development stage.The highest expression level of D.hHSP69.09 was detected in the first instar larva.The highest expression level of D.hHSP70.11 and D.hHSP71.88 were in the adult of male.The same condition of three HSP70 genes were the relative expression were high at the stage of pupal.By the tissue distribution analysis, the highest expression level of D.hHSP69.09 and D.hHSP70.11 was in the spermary.The relatively highest level of D.hHSP71.88 appeared in the corpus adiposum.The three HSPs of female and male adults were both up-regulated with the rise of temperature, time duration for 41 ℃ and concentration of oxidizing agent, then decreased.When treated with starvation stress, the expression patterns of male and female were different.When the processing time was prolonged, for male, the expression of three HSP70 genes were declined.However, in female adult, they were up-regulated.Therefore, HSP70 genes were correlated with the transition of different development stages and molting of larva in D.helophoroide.Moreover, HSP70 genes have direct relationship with resistibility to environmental stress including high temperature, oxidative stress, and starvation.

KeywordsDastarcus helophoroides; Environmental stress; HSP70; Real-time qPCR

1)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170608)。

責(zé)任編輯：程紅。