傅江燕+徐晟+夏冰+汪仁

摘要：以山桃葉片為材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到1個(gè)山桃醇腈酶基因全長(zhǎng)編碼序列，并命名為[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]。[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 737 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白包含539個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]編碼的蛋白具有葡萄糖甲醇膽堿氧化還原酶的序列特征，與黑櫻桃醇腈酶PsHNL4蛋白相似度為92%，與桃假定的HNL蛋白相似度為77%。通過(guò)將[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因連接到原核表達(dá)載體pET28（a）上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 （DE3）后，成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組菌株。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組蛋白受IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分子量大小約為62.4 ku，與已報(bào)道的其他薔薇科植物的醇腈酶蛋白大小基本一致。

關(guān)鍵詞：山桃；醇腈酶；基因克隆；原核表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：S662.101；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0020-05

利用酶作為催化劑用于合成單一對(duì)映體或直接分離特定手性異構(gòu)體，被廣泛應(yīng)用于不對(duì)稱(chēng)合成領(lǐng)域。醇腈酶作為一種不對(duì)稱(chēng)催化手性反應(yīng)的酶，自20世紀(jì)初在扁桃中發(fā)現(xiàn)以來(lái)，受到愈來(lái)愈多的關(guān)注[1]。它可逆地催化HCN和醛/酮類(lèi)化合物反應(yīng)生成手性氰醇[2]，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成為羥基化合物等多種手性中間體，并用于合成多種手性藥物，從而克服了為得到純手性化合物而采用光學(xué)拆分所帶來(lái)的生產(chǎn)工序復(fù)雜、成本高等一系列問(wèn)題[3-4]。此外，在植物體內(nèi)，醇腈酶可催化氰基糖苷類(lèi)化合物，反應(yīng)生成羰基化合物和HCN，而后者在植物防御草食類(lèi)動(dòng)物攝食或其他致病菌感染中起到作用，即植物的生氰作用[5-6]。

HNL在自然界中是廣泛存在的。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有3 000～12 000 種植物內(nèi)含有HNL。HNL主要分為兩大類(lèi)：R構(gòu)型和S構(gòu)型。目前，已分離純化并進(jìn)行酶活分析的R型HNL多來(lái)自于薔薇科植物[7]，如扁桃、黑櫻桃、梅、枇杷、西番蓮等[8-13]；而S型HNL多來(lái)自于木薯、橡膠樹(shù)、海檀木與高粱[14-17]。筆者所在研究組根據(jù)前期公布的桃的基因組數(shù)據(jù)[18]，通過(guò)序列同源比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其中有3條序列為編碼推測(cè)的HNL蛋白。此外，山桃、桃與扁桃同屬于薔薇科桃屬，目前有關(guān)山桃中HNL的研究并未報(bào)道。因此，本研究采用生物信息學(xué)結(jié)合PCR的方法，克隆得到1個(gè)山桃HNL基因，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析與原核表達(dá)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山桃[Prunus davidiana （Carr.） C.]葉片取自江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，采集后迅速放入液氮中冷凍，于 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

高純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，表達(dá)載體pET28（a）購(gòu)自Novagen公司，rTaq DNA聚合酶、克隆載體pMD19-T、Oligo （dT）18、DNA Markers、限制性?xún)?nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV （RNase H—）等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。大腸桿菌DH5α、TOP10和BL21 （DE3）菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，引物合成和測(cè)序工作分別委托北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司與上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 按照高純總RNA快速提取試劑盒的操作說(shuō)明，提取山桃葉片的RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度與完整性，并以此為模板，根據(jù)TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄得到山桃cDNA。

1.2.2 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)桃基因組測(cè)序組公布的序列，通過(guò)比對(duì)搜索出編碼假定醇腈酶蛋白的基因序列，并根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)特異引物，上游引物為 F0：5′-ATGGTGAAATCAACAATGTC-3′，下游引物為 R0：5′-AGTATCAAACGCAAAGGAT-3′。以反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，純化后的產(chǎn)物連接到 pMD19T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆進(jìn)行PCR與質(zhì)粒酶切檢測(cè)，鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的重組子送交公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI的ORF finder在線軟件查找該序列的開(kāi)放閱讀框，得到其編碼的氨基酸序列，將該序列使用BlastP進(jìn)行比對(duì)，選擇與PdHNL同源的其他植物的醇腈酶蛋白序列，進(jìn)一步利用DNAman軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)并使用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；使用ExPASy的Compute pI/MW計(jì)算蛋白的等電點(diǎn)與分子量；用TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)；用SignalP 4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽；用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)并建模。

1.2.3 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的載體構(gòu)建與原核表達(dá) 根據(jù)獲得的[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因與pET28（a）載體圖譜，分析并設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ的引物PdHNL1-pETF和PdHNL1-pETR （表1），使用rTaq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將pMD19T-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]重組質(zhì)粒與pET28（a）載體質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收并純化目的片段，并使用T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)卡那霉素篩選，PCR擴(kuò)增并進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證后，最后挑去陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]和空載體pET28（a）分別轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21（DE3）中，挑取克隆并使用 T7通用引物進(jìn)行PCR，篩選陽(yáng)性菌株。

1.2.4 原核表達(dá)及SDS-PAGE電泳檢測(cè) 將PCR驗(yàn)證正確的重組菌株與對(duì)照菌株分別接種于50 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm約為0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG于16 ℃進(jìn)行低溫誘導(dǎo)；分別在誘導(dǎo)后的0、3、6、18、24 h時(shí)取菌液1 mL，10 000 r/min離心1 min收集菌體，制備SDS-PAGE電泳樣品；按照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》配制蛋白膠，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的RNA質(zhì)量

取提取的山桃葉片總RNA 2.5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，其28S rRNA和18S rRNA條帶清晰可見(jiàn)，5S rRNA呈現(xiàn)一條較弱的條帶（圖1），表明提取的RNA濃度比較高且完整性較好，可以用于進(jìn)一步的基因克隆試驗(yàn)。

2.2 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的克隆與生物信息學(xué)分析

通過(guò)PCR方法擴(kuò)增[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]目標(biāo)基因的全長(zhǎng)cDNA的ORF序列，將其命名為[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]，軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)（CDS）長(zhǎng)度為1 737 bp，編碼579個(gè)氨基酸，理論分子量為624 ku，理論等電點(diǎn)為4.98，預(yù)測(cè)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定系

數(shù)為29.36，屬于穩(wěn)定蛋白，不含跨膜區(qū)。疏水性分析結(jié)果顯示PdHNL1屬于親水性蛋白（圖2）；信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，該蛋白N端有一段信號(hào)肽序列。PdHNL1蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，無(wú)規(guī)則卷曲是山桃 PdHNL1的主要結(jié)構(gòu)元件；統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，PdHNL1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含 1672% α-螺旋、17.55%β-折疊和 65.73%無(wú)規(guī)則卷曲。此外，結(jié)構(gòu)功能分析結(jié)果還表明，PdHNL1蛋白有類(lèi)似葡萄糖甲醇膽堿氧化還原酶的序列特征 （圖3）。氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果顯示PdHNL1與黑櫻桃PsHNL4同源性較高（圖4）。

從GenBank上獲得多個(gè)植物HNL同源基因編碼蛋白的氨基酸序列。利用進(jìn)化分析MEGA 5.0，采用中鄰位相接算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。分析結(jié)果顯示，山桃PdHNL1與同[CM（25]為薔薇科的黑櫻桃PsHNL4進(jìn)化關(guān)系最近；與其他薔薇科[CM）]植物的HNL蛋白遺傳距離也比較接近，同在一個(gè)進(jìn)化分支上。

使用SWISS-MODEL對(duì)PdHNL1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，軟件自動(dòng)選擇PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的梅的 PmHNL isozyme-1蛋白為模板 （同源性為77.65%），對(duì) PdHNL1蛋白進(jìn)行建模（圖6）。結(jié)果表明，PdHNL1結(jié)構(gòu)主要為無(wú)規(guī)則卷曲，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.3 [WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因的原核表達(dá)[JP2]

對(duì)PdHNL1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白N端具有1段信號(hào)肽序列。因此，設(shè)計(jì)去除該信號(hào)肽的引物，對(duì)PdHNL1的成熟蛋白進(jìn)行原核表達(dá)。將[WTBX][STBX]pMD19T-PdHNL1與pET28（a）[WTBZ][STBZ]質(zhì)粒使用EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切（圖7-A、圖7-B），分別純化回收后，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切試驗(yàn)結(jié)果顯示，[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]成功連接到原核表達(dá)載體pET28（a） （圖7-C、圖7-D）。提取重組質(zhì)粒pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]并轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3），菌液PCR檢測(cè)結(jié)果表明獲得了用于原核標(biāo)的重組菌 （圖7-E）。

將含有重組質(zhì)粒pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]的陽(yáng)性菌株和含空載體pET28（a）的對(duì)照菌株培養(yǎng)至D600 nm為0.5，隨后加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；分別于IPTG誘導(dǎo)后[CM（25]的0、3、6、18、24[KG*3]h 取樣，并制備SDS-PAGE檢測(cè)樣品。[CM）]

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，含pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]的宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在62 ku左右有1條清晰的目的條帶，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，該目的條帶表達(dá)量增加（圖8）。這與[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]預(yù)測(cè)的分子量相一致，表明山桃 pET28（a）-[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]重組質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

HNLs是合成純光學(xué)氰醇類(lèi)化合物的重要的酶催化劑，其在植物體內(nèi)催化分解氰基糖苷類(lèi)化合物生成氰化物，從而起到保護(hù)植物的作用[19]。自1997年就已經(jīng)有研究者在植物體內(nèi)篩選可能的HNL[20]；此后，Asano等采用HPLC方法檢測(cè)[FL）]

了163種產(chǎn)氰植物的HNL活性及其催化產(chǎn)生手性醇氰的能力，發(fā)現(xiàn)桃HNL具有R型HNL活性[5]。桃與山桃同屬于薔薇科李亞科桃屬，親緣關(guān)系相近。本研究通過(guò)篩選桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，PCR擴(kuò)增得到山桃中克隆得到醇腈酶cDNA序列，生物信息學(xué)與分析發(fā)現(xiàn)其核苷酸長(zhǎng)度、編碼蛋白的分子量等與已報(bào)道的薔薇科HNL蛋白相似；進(jìn)一步的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有大量無(wú)規(guī)則卷曲和少量 α-螺旋與β-折疊，除N端信號(hào)肽外，無(wú)明顯跨膜螺旋區(qū)域，表明同科的HNL具有較高的保守性。

先前的研究表明，R型HNL主要具有氧化還原酶活性，而S型HNL具有α/β水解酶活性。擬南芥HNL則是第1個(gè)從非產(chǎn)氰植物中發(fā)現(xiàn)的具有α/β水解酶活性的R型HNL[21]。另一方面，HNL蛋白依據(jù)是否含有FAD輔基分為FAD-HNLs與非FAD-HNLs。本研究中對(duì)包括PdHNL1在內(nèi)的11種植物的17個(gè)HNL蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)薔薇科R型HNL在一個(gè)進(jìn)化分支，且均為FAD-HNLs， 推測(cè)薔薇科

HNL在進(jìn)化過(guò)程中具有高度的保守性。山桃同屬薔薇科且PdHNL1與薔薇科其他物種的HNL在同一個(gè)進(jìn)化分支上，暗示其可能屬于R型HNL。蛋白比對(duì)分析結(jié)果同樣顯示，PdHNL1與同屬于的薔薇科的梅、黑櫻桃、扁桃的HNL蛋白序列相似度較高，均達(dá)75%以上。結(jié)構(gòu)功能分析結(jié)果顯示，PdHNL1屬于葡萄糖甲醇膽堿氧化還原酶家族，且PdHNL1氨基酸序列中具有薔薇科植物HNL推測(cè)的保守氨基酸序列YWHYHGG。此外，擬南芥和亞麻HNL雖屬于R型HNL，但與S型醇腈酶親緣關(guān)系較近，歸為一個(gè)進(jìn)化分支。

本研究還將[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因連接到原核表達(dá)載體pET28（a） 上，通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得了重組菌種。上述結(jié)果為進(jìn)一步純化目標(biāo)蛋白，并進(jìn)行PdHNL1催化活性研究奠定了基礎(chǔ)。另外，本研究對(duì)山桃醇腈酶[WTBX][STBX]PdHNL1[WTBZ][STBZ]基因進(jìn)行的序列分析與原核表達(dá)，還豐富了植物HNL基因的來(lái)源，并為推進(jìn)手性醇腈的酶法制備奠定了基礎(chǔ)。

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