胡　群，鄒春穎，馬思杰，童淑梅，梅　勇

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5株鼠樣品中分離漢坦病毒毒株S基因序列比較與分析

胡群，鄒春穎，馬思杰，童淑梅，梅勇

大榭出入境檢驗檢疫局，寧波315812

摘要：目的了解近年來從寧波口岸捕獲的鼠類樣品中分離的5個漢坦病毒株遺傳學(xué)差異。方法利用RT-PCR方法，對5個漢坦病毒株S基因全長進行擴增、克隆和測序，并將這5個毒株的S基因序列分別與GenBank登錄的20個漢坦病毒感毒株進行比較分析。結(jié)果DX1507株和DX1408株S基因核苷酸序列長度為1766 bp與漢城型(SEOV)病毒株 Rn-Dp7同源性最為接近，LJ1112株S基因核苷酸序列長度為1772 bp與漢城型(SEOV)病毒株Cherwell同源性最為接近，DX0903株和BL1402株S基因核苷酸序列長度為1725 bp與大別山型(DABV)病毒株 Yongjia-Nc-95和Yongjia-Nc-38同源性最為接近。結(jié)論寧波口岸分離到的漢坦病毒株分別為漢城型和大別山型，對寧波口岸開展?jié)h坦病毒傳播防控有重要意義。

關(guān)鍵詞：漢坦病毒；寧波；序列分析；S基因

漢坦病毒(Hantavirus, HV)是重要的人獸共患病病原體，人類感染HV后主要導(dǎo)致2種嚴(yán)重疾病，即腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever withrenal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(hantaviruspulmonary syndrome，HPS)。HV流行范圍之廣泛、危害嚴(yán)重，已經(jīng)成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題[1-2]，近年來不斷有新型或新亞型病毒被發(fā)現(xiàn)，已知HV至少可分為40個血清型/基因型，其中已證實至少有22個型的HV可引起人類疾病[3-4]。

鼠類是HV的主要自然宿主，它感染后無臨床癥狀，生長繁殖也不受影響，并能長時間攜帶并排出病毒，是人感染HV的主要傳染源[5]。在國境口岸開展鼠類攜帶漢坦病毒的監(jiān)測，對于防控漢坦病毒的傳播具有重要意義。本文就近年來在寧波口岸分離到的5株不同來源的漢坦病毒S基因全序列進行測序分析，并與其他毒株進行比較，了解寧波口岸漢坦病毒的基因型別及遺傳變異情況。

1材料與方法

1.1病毒毒株5株漢坦病毒株均為本實驗室分離及鑒定。病毒株代號為MS1507為從寧波梅山港區(qū)媒介監(jiān)測捕獲的小家鼠中分離；病毒株代號為DX1408為從寧波大榭港區(qū)媒介監(jiān)測捕獲的褐家鼠中分離；病毒株代號為DX0903為從寧波大榭港區(qū)媒介監(jiān)測捕獲的社鼠中分離；病毒株代號為BL1402為從寧波北侖港區(qū)媒介監(jiān)測捕獲的褐家鼠中分離；病毒株代號為LJ1112為從英國入境集裝箱中捕獲的褐家鼠中分離。

1.2主要試劑RNA提取試劑盒和一步法RT-PCR試劑盒購自Qiagen公司，瓊脂糖、5×TBE電泳緩沖液、6×Loading buffer溶液均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3引物參照文獻設(shè)計[6]，上游引物SF：5′-TAGTAGTAGACTCCCTAAAGA-3′，下游引物SR：5′-TAGTAGTAGTATGCTCCCTAA-3′用于擴增S片段全基因。

1.4病毒RNA的制備將病毒株感染Vero E6細(xì)胞，培養(yǎng)6～ 7 d后, 用間接免疫熒光法檢測細(xì)胞感染的程度, 待75%細(xì)胞有病毒感染時, 收獲病毒, 利用RNA提取試劑盒按說明書從病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中提取總RNA。

1.5一步RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序一步RT-PCR反應(yīng)體系為50 μL，無RNA酶水20.2 μL，5×RT-PCR 緩沖液 10 μL，10 mmol/L dNTP 混合液 2 μL，酶混合液 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，20 μmol/L上下游引物SF、SR各2.4 μL，RNA模板10 μL。反應(yīng)程序為60 ℃ 1 min，42 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

1.7PCR擴增產(chǎn)物檢測、測序PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈觀察結(jié)果。切下擴增條帶，用膠回收試劑盒純化后，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.8基因序列的分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建用Mega 5.0生物學(xué)軟件對5個漢坦病毒分離毒株和Genbank錄入的三個基因型別的20個漢坦病毒流行株S基因(見表1)進行核苷酸同源性分析，計算遺傳距離，并以鄰位相連法(Neighbor-joining)繪制系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果

2.1不同毒株的測序結(jié)果將5個毒株的S基因核苷酸序列測序結(jié)果拼接后顯示，DX1507株和DX1408株S基因核苷酸序列長度為1 766 bp，LJ1112株S基因核苷酸序列長度為1 772 bp, DX0903株和BL1402株S基因核苷酸序列長度為1 725 bp。

表1HV毒株及來源

Tab.1Hantavirus strains and source used in the study

TypeStrainSourceGenBanklocusSEOVGM04-38Shandong,ChinaDQ469397.1HB55Henan,ChinaAF035832.1IR461UKAF458104.1L99Jiangxi,ChinaAF288298.1ZT71Zhejiang,ChinaEF117248.1Rn-DH27ChinaGQ279393.1HuBJ22ChinaGQ279379.1GaomiRn9ChinaGU592941.1CherwellUKKC626089.1HumberUKJX879769.1ShenyangRn139ChinaGU592951.1HTNV76-118KoreaM14627C1-1JapanD25529NC167Anhui,ChinaAB02711584FliShanxi,ChinaAF366569.1LR1Shanxi,ChinaAF288293.1DABVYongjia-Nc-95Zhejiang,ChinaJF796023.1Yongjia-Nc-38Zhejiang,ChinaJF796021.1Wencheng-Nc-470Zhejiang,ChinaJF796019.1Yongjia-Nc-15Zhejiang,ChinaJF796020.1

2.2不同毒株的同源性分析經(jīng)Mega 5.2軟件將5個毒株S基因序列與從GenBank中獲得的20個漢坦病毒S基因分別進行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較，表2可知，DX1507株和DX1408株與漢城型(SEOV)病毒株 Rn-Dp7同源性最為接近，遺傳距離分別為0.024和0.015；LJ1112株與漢城型(SEOV)病毒株Cherwell同源性最為接近，遺傳距離為0.027；DX0903和BL1402與大別山型(DABV)病毒株 Yongjia-Nc-95和Yongjia-Nc-38同源性最為接近，遺傳距離分別為0.062和0.067。

2.3系統(tǒng)進化分析將5個病毒株的S基因全序列與從GenBank上獲得的20個參考病毒所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可知(圖1)，DX1507，DX1408，LJ1112與漢城型(SEOV)病毒株Rn-Dp7，ShenyangRn139，HuBJ22，GaomiRn9，Cherwell，Humber位于同一組，其中LJ1112與漢城型(SEOV)病毒株 Humbers位于同一分支。DX0903，BL1402與大別山型(DABV)病毒株Yongjia-Nc-95，Yongjia-Nc-38，Wencheng-Nc-470，Yongjia-Nc-15位于同一組。

表25個不同來源病毒與參考病毒株S基因基因距離Tab.2Genetic distance and standard error of L gene of DX1101 with different Hantavirus strains

VirusstrainDX1507DX0903LJ1112BL1402DX1408SEOVGM04-382.4242.4652.4152.4662.399SEOVHB552.4642.5062.4552.5092.439SEOVIR4612.4252.4972.4312.5012.410SEOVL992.4572.4982.4482.5012.432SEOVZT712.4502.4782.4422.4812.426SEOVRn-DH270.0240.4890.0300.4890.015SEOVHuBJ220.0260.4800.0340.4830.018SEOVGaomiRn90.0260.4950.0340.4950.020SEOVCherwell0.0430.4860.0270.4860.035SEOVHumber0.0450.4780.0280.4740.037SEOVShenyangRn1390.0270.4920.0340.4920.021HTNV76-1182.4452.6582.4182.6462.428HTNVC1-12.4372.6522.4102.6402.420HTNVNC1672.7412.8112.6922.7982.703HTNV84Fli2.4732.6672.4242.6552.439HTNVLR12.4372.6582.4102.6462.420DABVYongjia-Nc-950.4600.0620.4720.0670.452DABVYongjia-Nc-380.4600.0620.4720.0670.452DABVWencheng-Nc-4700.4660.0660.4800.0700.459DABVYongjia-Nc-150.4690.0710.4870.0770.465

圖1　不同基因型HV巢式RT-PCR SEO特異性引物S基因擴增產(chǎn)物構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.1　Phylogenic tree of S gene of Hantavirus PCR product

3討論

漢坦病毒是一種單股負(fù)鏈 RNA 病毒, 核酸基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個節(jié)段組成，其中 S片段編碼病毒核衣殼蛋白(NP)，在病毒感染及復(fù)制過程中具有重要的作用[7,8]，而且S基因具有相對的保守性，可通過對S基因的測定和分析來獲取漢坦病毒的進化和變異信息，從而為漢坦病毒的進化研究和流行病學(xué)的調(diào)查發(fā)揮重要作用。

本研究共分析了5個漢坦病毒株的S基因全序列，在毒株選擇上考慮了宿主種類和地域等因素，是本實驗室近年來從鼠類樣品中檢測分離的代表株。從分析結(jié)果來看，寧波口岸5株漢坦病毒株，其中DX1507，DX1408，LJ1112基因型別為漢城型(SEOV)，并且屬于(SEO)和大別山(DOB)兩個基因型，其中大別山型已證實在國內(nèi)浙江地區(qū)流行傳播，該基因型別的漢坦病毒可能來源于宿主溢出，即漢坦病毒在水平傳播過程中，除在原宿主內(nèi)流行外，隨機感染了另一種動物，并發(fā)生病毒基因組變異，以適應(yīng)新宿主的遺傳環(huán)境，隨宿主加以進化[9,10]。

病毒株LJ1112是從英國入境的集裝箱中檢獲的鼠體中分離，從遺傳距離和系統(tǒng)進化分析，可以知道與英國流行株的親源關(guān)系，這也進一步證實了傳染病病原體可能過鼠類等醫(yī)學(xué)媒介在國際間傳播，這對于加強口岸媒介病原體監(jiān)測具有重要的意義。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.017

中圖分類號：R373

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-502-04

收稿日期：2015-10-14修回日期：2016-01-26

Sequence comparison and analysis of S Gene of five Hantavirus strains separated from rodents

HU Qun, ZHOU Chun-ying，MA Si-jie, TONG Shu-mei, MEI Yong

(DaxieExit-EntryInspectionandQuarantineBureau,Ningbo315812,ZhejiangProvinca,China)

Abstract:To know the genetic differences of five hantavirus strains separated from rodents captured in Ningbo port area. The S genes of five hantavirus strains were amplified, cloned and sequenced. Then the S gene sequences of these strains were compared with that of 20 hantavirus strains in GenBank. The results showed that the DX1507 and DX1408 strains S segment are 1766 bp in length and with closest homology to the SEOV virus strain Rn-Dp7, the LJ1112 strains S segment are 1772 bp in length and with closest homology to the SEOV virus strain Cherwell, the DX0903 and BL1402 strains S segment are 1725 bp in length and with closest homology to the DOBV virus strain Yongjia-Nc-95and Yongjia-Nc-38. This study indicated the five hantavirus strains separated from rodents captured in Ningbo port area are belong to SEO or DOBV type, which has an important significant to control hantavirus spreading in Ningbo port.

Key words:Hantanvirus; Ningbo; sequence analysis; S gene