崔玉花，田莉莉，王曉亮，姜海蓉，范偉興，彭方毅

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基于樣品檢測的布魯氏菌熒光定量PCR方法的建立

崔玉花1,2，田莉莉2，王曉亮3，姜海蓉1，范偉興2，彭方毅4

1.重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶400054；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，青島266110；3.寧夏回族自治區(qū)動物疾病預防控制中心，寧夏750000；4.重慶市墊江縣中醫(yī)院，重慶408300

摘要：目的本文建立一種基于樣品檢測的特異性好、靈敏性高的布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法。方法以哺乳動物beta-actin基因和外源重組質粒為內參，針對布魯氏菌屬特異性基因IS711，建立用于樣品檢測的布魯氏菌熒光定量PCR方法，并驗證其敏感性、特異性及穩(wěn)定性，繪制標準曲線。將該方法用于哺乳動物樣品檢測，并與細菌分離培養(yǎng)檢測結果比較。結果熒光定量PCR方法對布魯氏菌檢測有良好的特異性，3對引物對陰性對照菌均無非特異性擴增；該方法用于樣品檢測的最低檢測限為17拷貝；內外源內參同時存在條件下，布魯氏菌熒光定量PCR的標準曲線相關系數為R2=0.997(Y=-3.12X+40.9)。將該方法直接用于181份動物樣本的檢測，并與分離培養(yǎng)結果相比，熒光定量PCR檢測陽性率為11.4%，細菌分離培養(yǎng)檢測陽性率為9.9%，且細菌分離培養(yǎng)陽性樣品與熒光定量PCR陽性樣品中編號基本一致。結論本文建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏性高、特異性及穩(wěn)定性好，可直接應用于樣品的檢測，檢測結果受內參基因質控。

關鍵詞：布魯氏菌；熒光定量PCR；外源內參；內源內參

布魯氏菌病是由革蘭陰性菌布魯氏菌引起的一種全球性人獸共患病[1]。已有多篇文章報告用于布魯氏菌檢測的普通PCR方法的靈敏性比熒光定量PCR低，而且易造成產物污染[2-4]。

熒光定量PCR檢測方法靈敏性高、用時短且避免PCR產物污染，適用于直接檢測樣本中的布魯氏菌，Vladimira等人就研究了將熒光定量PCR方法用于組織、全血的布魯氏菌檢測方法[5]，也有多篇文獻報道將本方法用于人布魯氏菌病的診斷及愈后跟蹤[6-7]。但這些方法都沒有加入內參來質控檢測結果，因而無法判定是否出現假陰性現象。所以我們建立了一種含有內參基因的直接應用于樣品檢測的布魯氏菌熒光定量PCR方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株布魯氏菌：羊種16M、牛種544、豬1型、犬種；陰性參考菌：大腸桿菌O∶86、大腸桿菌O∶157、小腸結腸炎耶爾森菌O∶9、人蒼白桿菌、白色念球菌、傷寒沙門氏菌、發(fā)根土壤桿菌、綠膿桿菌。上述菌株菌由本實驗室保存。

1.1.2試劑基因組DNA提取試劑盒、膠回收純化試劑盒購自天根公司；質粒提取試劑盒、pMD19-T載體、qPCR Premix購自大連寶生物科技有限公司；DNeasy Blood & Tissue、QIAamp cador Pathogen Mini Kit購自QIAGEN公司。

1.1.3樣本來源動物子宮7份、脾9份；全血120份；奶樣45份。這些樣本均為中國動物衛(wèi)生與流行病學中心保存，并已在生物三級實驗室中進行粉碎、滅活等預處理。

1.1.4引物及探針針對布魯氏菌屬特異性基因IS711設計引物及探針[8]。外源重組質粒目的基因源于大西洋鮭魚β-球蛋白基因[9]。在熒光定量 PCR中，外源內參重組基因與布菌屬目的基因的擴增共用一對引物，其特異性探針：5′-NED-TGGCCACATACAAGTCACTGAGGA-BHQ1-3′。哺乳動物β-actin基因為內源內參基因，引物及探針分別為r:5′-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3′; f:5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATG-3′; 探針:5′-VIC-G AGTCCGGCCCCTCCATCGTCCA -BHQ1-3′。上述引物及探針均由Life生物公司合成。

1.2方法

1.2.1DNA提取用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取布魯氏菌及其陰性參考菌DNA；用DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) 提取組織和全血的DNA，全血DNA提取之前，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心棄上清。如一次裂解不完全，可洗多次至紅色完全褪去[5,10]。奶樣DNA的提取用QIAamp cador Pathogen Mini Kit。

1.2.2布魯氏菌屬標準品制備常規(guī)PCR方法擴增目的基因，并將PCR產物回收純化后導入克隆載體pMD19-T中。用質粒提取試劑盒提取重組質粒后，紫外儀測其濃度及純度。得標準質粒濃度為2.2×1010拷貝·μL-1。

1.2.3熒光定量PCR檢測體系的建立

經條件優(yōu)化后的最優(yōu)反應體系：反應總體積25 μL，包括2×PCR Primer mix 12.5 μL，布魯氏菌屬特異性基因引物1.25 μL，探針1.5 μL，外源及內源性內參探針0.5 μL，內源內參引物0.5 μL(各引物及探針的工作濃度均為10 μmol·L-1)，外源重組質粒1 μL(0.1 pg)，布菌DNA 3 μL，ddH2O 2.5 μL。反應程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。

1.2.4特異性實驗以組織、全血、布魯氏菌、外源內參重組質粒及陰性參考菌(大腸桿菌O∶86、大腸桿菌O∶157、小腸結腸炎耶爾森菌O∶9、人蒼白桿菌、白色念球菌、傷寒沙門氏菌、發(fā)根土壤桿菌、綠膿桿菌)DNA為模板，進行熒光定量PCR實驗，分別驗證布魯氏菌、外源內參、內源內參引物及探針特異性。

1.2.5穩(wěn)定性實驗將布魯氏菌標準品進行10倍梯度稀釋，稀釋成2.2×1010～2.2×100拷貝·μL-1。批內檢測：選擇上述10倍梯度稀釋后濃度區(qū)間為2.2×107～2.2×104拷貝·μL-1的布菌標準品為模板，每個濃度重復5個孔。批間檢測：選擇相同DNA濃度區(qū)間，在不同時段做5次重復試驗，比較組內及組間的變異系數，檢測檢測方法的穩(wěn)定性。1.2.6標準曲線的制備以上述10倍梯度稀釋好的布魯氏菌DNA為模板(2.2×107～2.2×100拷貝·μL-1)。標準曲線做三組：布魯氏菌標準品為DNA模板；布魯氏菌標準品和外源重組質粒DNA為模板；布魯氏菌標準品和外源重組質粒及內源內參DNA為模板。每反應孔重復3次,進行熒光定量PCR反應。

1.2.7熒光定量PCR檢測模擬樣本的靈敏性實驗

將羊種16M布魯氏菌DNA進行熒光定量PCR擴增，得到的Ct值通過布魯氏菌標準品的標準曲線得出其初始拷貝數為5.6×105拷貝·μL-1，用陰性組織DNA將其進行10倍梯度稀釋，稀釋成5.6×105～5.6×100拷貝·μL-1，作為模擬樣本。每個反應孔加入3 μL樣品，每組重復三次，陰性組織DNA為陰性對照，進行熒光定量PCR反應。1.2.8熒光定量PCR用于樣本的檢測為了評價所建立的熒光定量PCR方法用于樣本檢測的實用性，本實驗分別以提取的組織、全血及奶樣DNA為模板進行熒光定量PCR的檢測，并與細菌分離培養(yǎng)鑒定結果進行對比。

2結果

2.1特異性檢測布魯氏菌屬特異性引物及探針特異擴增了羊種、牛種、豬種1型及犬種布魯氏菌(圖A)，擴增結果產生典型的S型熒光曲線(Ct值分別為16.87、19.06、22.12、27.34)，蒼白桿菌、大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌等陰性參考菌無非特異性擴增；以脾2份、子宮2份、全血3份、奶樣2份為DNA模板時(圖B)，內源內參基因的擴增有特異性熒光曲線產生(Ct值分別為18.28、19.37、18.63、20.97、17.26、19.10、19.45、18.30、18.46)，而布魯氏菌、外源重組質粒及陰性參考菌的DNA模板沒有非特異性熒光曲線產生。

圖1　布魯氏菌熒光定量PCR特異性Fig.1　Specificity results of real-time PCR for Brucella

2.2重復性熒光定量PCR方法檢測組內重復性及組間重復性，組內變異系數在0.24%～0.76%之間，組間變異系數在0.57%～2.2%之間，組內及組間變異系數均在合理的范圍內，說明本檢測方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.3標準曲線的制備根據Ct值及對應標準品濃度做標準曲線：只擴布魯氏菌DNA時，標準曲線相關系數R2為0.999(Y=-3.34X+42.85)；擴增布魯氏菌DNA和外源重組質粒時，標準曲線相關系數R2為0.997(Y=-3.13X+40.50)；同時擴增布魯氏菌及內外源性內參基因時，標準曲線相關系數R2為0.997(Y=-3.12X+40.9)。說明在布魯氏菌屬特異性片段擴增的過程中，加入的外源及內源性基因對檢測結果沒有影響。

圖2　布魯氏菌熒光定量PCR標準曲線Fig.2　Standard curve of real-time PCR for Brucella

2.4模擬樣品的靈敏性檢測結果顯示，熒光定量PCR方法用于模擬樣本檢測的檢測限為17拷貝，且能夠產生良好的特異性擴增曲線。

1～6. 5.6×105 DNA拷貝·μL-1～ 5.6×100 DNA拷貝·μL-11～6. 5.6×105 DNA copeis·μL-1～5.6×100 DNA copeis·μL-1圖3　布魯氏菌熒光定量PCR靈敏性Fig.3　Sensitivity results of real-time PCR for Brucella

2.5樣品檢測結果本實驗共檢測181份樣品，在外源性內參和內源內參基因擴增參照下，成功檢測179份樣本。其中16份組織樣本中檢測出8份陽性樣本，分別是5份陽性子宮(Ct值分別為27.05、26.08、16.76、29.28、23.05)和3份陽性脾(Ct值分別為26.14、25.30、27.24)，1份脾組織內源內參DNA無擴增，檢測結果無效，其余為組織陰性；45份乳樣中有8份陽性(Ct值分別為27.20、26.72、28.36、23.84、26.97、26.25、27.79、28.67)，內外源性內參基因擴增顯示45份樣品檢測結果有效；120份全血樣本中有4份陽性樣品(Ct值分別為30.84、29.63、31.23、17.54)，1份全血樣本擴增無效。熒光定量PCR檢測的陽性率為11.4%。檢測結果成立的條件是：空白及陽性對照成立；外源重組質粒和內源內參基因的特異性擴增成立； Ct值<34。細菌分離培養(yǎng)檢測出的陽性樣本有：7份組織樣本，8份奶樣和3份全血樣本，檢測的陽性率為9.9%。細菌分離培養(yǎng)與熒光定量PCR檢出的陽性樣本編號基本相符，細菌分離培養(yǎng)檢測的奶樣與全血的陽性樣本都與熒光定量PCR檢測陽性樣品相符；在組織樣品檢測中，有1份細菌分離培養(yǎng)檢測為陽性的組織樣本，熒光定量PCR檢測結果無效。熒光定量PCR與細菌分離培養(yǎng)的檢測結果對比可知，熒光定量PCR檢測方法更靈敏一些，而且本方法簡單、高效、可靠。

本研究建立了一種基于布魯氏菌屬特異性基因IS711的直接檢測樣品的布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，本方法用于樣品檢測的檢測線為17個拷貝，且具有良好的穩(wěn)定性。布魯氏菌屬及內參基因的特異性引物及探針對陰性對照菌均無非特異性擴增。此方法的建立為不具備布魯氏菌分離鑒定條件的實驗室提供了一種針對病原核酸的簡便檢測方法。

3討論

快速可靠的檢測方法是控制疾病蔓延的有效手段。對于布魯氏菌病的診斷，傳統血清學方法容易產生交叉反應，且易受主觀意識影響，判定結果多出現假陰性或假陽性。細菌分離培養(yǎng)技術是細菌檢測的金標準，但其對實驗人員及設備的要求較高。而PCR方法作為一種更靈敏、高效且省時省力的檢測方法，更適用于布魯氏菌病的檢測。而且PCR檢測方法不需要直接接觸病原，沒有被感染的風險。

相較于普通PCR方法，探針法熒光定量PCR的靈敏性更高[11-13]，特異性更好，而且不需要進行凝膠電泳，防止了PCR產物交叉污染的可能。本文建立的熒光定量PCR檢測方法中加入的兩種內參基因，其中以哺乳動物β-actin基因為內源內參質控DNA提取物，以外源重組質粒作為外源性內參質控布魯氏菌DNA的PCR擴增。當外源重組質粒有擴增而內源內參基因無擴增時，說明病料中提取DNA的過程不成功；當內源內參基因有擴增而外源重組質粒無擴增時，說明布魯氏菌目的基因IS711的PCR擴增反應有抑制。在可以直接檢測動物病料的同時也保障了該檢測結果的有效可靠性，減少假陽性、假陰性。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.010

通訊作者：姜海蓉，Email: 704751214@qq.com；

中圖分類號：R378

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-469-04

收稿日期：2015-07-18修回日期：2015-12-16

Development of real-time PCR method based on sample detection forBrucella

CUI Yu-hua1,2, TIAN Li-li2, WANG Xiao-liang4,JIANG Hai-rong1, FAN Wei-xing2, PENG Fang-yi4

(1.ChongqingUniversityofTechnology,Chongqing400054,China;2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao266110,China;3.NingxiaHuiAutonomousRegionAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Ningxia, 750000,China;4.DianjiangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing408300,China)

Abstract：A reliable and efficient real-time PCR method directly used for sample detection targeting the Brucella genus-specific IS711 gen was developped. The method also includes a target to a conserved region of the beta-actin gene to assess suitable of extracted DNA and a plasmid-based internal control to detect failure of PCR due to inhibition. We verified the sensitivity, specificity and stability of this method, and made the standard curve. The method was directly used for the detection of 181 ani-mal samples, and compared with the bacteria separating culture. The limit of simulated sample detection was 17 copies, The specificity of this real-time PCR method was no cross-reactivity with Escherichia coil O:086, Escherichia coil O:157, Yersinia enterocolitica O:9, Ochrobactrum anthro, Candida albicans stra, Salmonella typhimuri, Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas aeruginosa. Standard curve of the three groups were made: only to Brucella standard products as template DNA; to Brucella standard products and exogenous recombinant plasmid reference DNA, Brucella standard products, exogenous recombinant plasmid and endogenous host gene. The correlation coefficient were 0.999% (Y=-3.34X+42.85), 0.997% (Y=-3.13X+40.50) and 0.997%(Y=-3.12X+40.9), respectively. The positive detection rate of 181 animal samples was 11.4% for real-time PCR and 9.9% for bacteria separating culture, and bacteria isolated culture positive samples were basically

consistent with the number of real-time PCR positive samples. Result showed that with the advantages of higher sensitivity and reliable, the multiple real-time PCR method could be used to rapid detecting theBrucellaqualitily.

Key words:Brucella; real time PCR; exogenous reference; endogenous reference Ningxia main zoonosis prevention and control key technology research and demonstration(no.2013ZZN30)

寧夏地區(qū)主要人獸共患病防控關鍵技術研究與示范(No.2013ZZN30)資助