李幸樂(lè), 李鳳麗, 李　懿, 孫建偉, 黃學(xué)勇,許汴利

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一例暴露因素不明的狂犬病病例的分子流行病學(xué)溯源

李幸樂(lè), 李鳳麗, 李懿, 孫建偉, 黃學(xué)勇,許汴利

河南省疾病預(yù)防控制中心，河南省醫(yī)學(xué)病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450016

摘要：目的對(duì)一例暴露因素不明的人狂犬病病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診，通過(guò)分子流行病學(xué)分析探索其可能的感染來(lái)源。方法通過(guò)對(duì)存活疑似人狂犬病病例的唾液、腦脊液、血清標(biāo)本采用直接免疫熒光試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和快速熒光灶抑制試驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室確診；通過(guò)時(shí)空進(jìn)化分析探索該病例可能的感染來(lái)源。結(jié)果病例唾液標(biāo)本直接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，病例血清標(biāo)本經(jīng)快速熒光灶抑制試驗(yàn)檢測(cè)抗狂犬病病毒中和抗體呈陽(yáng)性。病例唾液標(biāo)本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得狂犬病病毒核蛋白基因預(yù)期擴(kuò)增片段，序列測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)為狂犬病病毒。該狂犬病病毒株與2011年安徽省一株犬源狂犬病病毒株核苷酸序列同源性最高，為98.4%。結(jié)論該疑似狂犬病病例可確診為狂犬病病例。其發(fā)病源于至少2011年以來(lái)的某次不自覺(jué)的狂犬病病毒感染。

關(guān)鍵詞：狂犬?。环崔D(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；分子流行病學(xué)

狂犬病是由狂犬病病毒感染導(dǎo)致的急性致死性疾病，是一種人獸共患病?？袢《嘁娪谌⒗?、貓等食肉動(dòng)物和蝙蝠，人類狂犬病絕大多數(shù)由病犬咬傷所致，潛伏期長(zhǎng)短不一，與傷者年齡、傷口部位、傷口深淺、入侵病毒的數(shù)量和毒力等因素有關(guān)，多數(shù)潛伏期在3個(gè)月以內(nèi)。本研究經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷確診了1例臨床典型、暴露因素不明的狂犬病病例，并對(duì)該狂犬病病例可能的感染途徑進(jìn)行了探索性分析。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1個(gè)案信息及標(biāo)本采集患者ZXQ, 男，漢族，48歲，農(nóng)民，河南省新鄉(xiāng)市輝縣北云門鄉(xiāng)南桃固村人。2013年10月2日發(fā)病，表現(xiàn)為煩躁、怕風(fēng)、吞咽困難、不能進(jìn)水。病癥呈反復(fù)進(jìn)行性加重。2013年10月12日因呼吸衰竭死亡。患者入院時(shí)神志清醒，自述近期無(wú)狂犬病暴露史。查體未發(fā)現(xiàn)肉眼可見外傷。河南省疾病預(yù)防控制中心于2013年10月7日收集病人唾液混合液標(biāo)本1份(每間隔3小時(shí)采集一次，采集3次)；腦脊液標(biāo)本1份。于2013年10月8日收集血清標(biāo)本1份。所有標(biāo)本冷凍保存，備檢。

1.2病例標(biāo)本的直接免疫熒光法檢測(cè)患者的唾液標(biāo)本4 ℃ 2 000 r/min 離心20 min，取出上清，唾液沉渣采用PBS制成30%懸液，制片備用。取10 μL唾液沉渣制成的懸液推片，干燥后丙酮固定30 min，棄丙酮，室溫干燥5 min；加50 μL以PBS 1∶100稀釋的異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin, 含0.1%的1% EVAN's Blue)覆蓋玻片上的唾液沉渣，37 ℃濕盒孵育30 min；緩流沖洗棄熒光標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體，PBS振洗2次，水洗1次；干燥后加10 μL 80% 甘油覆蓋唾液沉渣；熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。同時(shí)以健康人唾液標(biāo)本設(shè)立陰性對(duì)照。

1.3病例標(biāo)本的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)采用Qiagen公司(Düsseldorf, NordrheinWestfalen, German)QIAamp Viral RNA Mini Kits病毒RNA提取試劑盒依據(jù)說(shuō)明書操作提取患者唾液、腦脊液標(biāo)本的病毒RNA。病毒RNA采用Invitrogen公司(Carlsbad, California, USA)SuperScript?III 1st Strand cDNA Synthesis Kits反轉(zhuǎn)錄試劑盒依據(jù)說(shuō)明書操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Promega公司(Madison, Wisconsin, USA)GoTaqR Green Master Mix試劑進(jìn)行巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分別針對(duì)狂犬病病毒N蛋白進(jìn)行目的基因片段擴(kuò)增[1]，引物見表1。擴(kuò)增N蛋白基因時(shí)，外引物為PN1-1和PN1-2，內(nèi)引物為PN2-1和PN2-2。外引物反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。內(nèi)引物反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR終產(chǎn)物長(zhǎng)度約250 bp。

表1病例標(biāo)本RT-PCR檢測(cè)用引物

Table.1Primers used in RT-PCR for the samples of patient

TargetgenesCodesSequencesofprimers(5'→3')PositionLengthofproduct/bpNN127ATGTAACACCTCTACAATGG55-741500N8mCAGTCTCYTCNGCCATCT1570-1587N577AAGATGTGYGCYAAYTGGAG644-663250N829GCCCTGGTTCGAACATTCT881-899

Note: Rabies virus vaccine strain PV2061 (GenBank ID: NC_001542) was used as the template to design primers by the Primer 5.0 software.

1.4核酸序列測(cè)定與分析擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。采用BioEdit 5.0.6版本軟件進(jìn)行序列拼接，采用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行序列排列，采用MEGA 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，所有操作按照軟件使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.5病例標(biāo)本的快速熒光灶抑制試驗(yàn)以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為檢測(cè)板，每行對(duì)應(yīng)一份樣本。按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方案于相應(yīng)行每孔加入100 μL含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液，取病例血清、病例腦脊液、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(21.4 IU/mL)、陰性血清(0.0 IU/mL)各50 μL分別加入相應(yīng)行第一孔內(nèi)，連續(xù)進(jìn)行1∶3倍比稀釋，每行最后一孔棄去50 μL混合液，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照和CVS-11病毒對(duì)照；除細(xì)胞和病毒對(duì)照孔以外每孔加入稀釋至80%細(xì)胞感染量的CVS-11毒種50 μL，37 ℃中和作用1 h；中和作用結(jié)束后每孔加入1×106/mL的BSR細(xì)胞懸液50 μL，37 ℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h。然后進(jìn)行常規(guī)的FAT檢測(cè)，在倒置熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)結(jié)果，在記錄表中詳細(xì)記錄各樣品50%分界點(diǎn)前后孔內(nèi)熒光染色細(xì)胞百分比，代入計(jì)算公式內(nèi)求取各樣品中和抗體效價(jià)值，單位為IU/mL。

2結(jié)果

2.1直接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果病例唾液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果如圖1。病例唾液標(biāo)本和健康人唾液標(biāo)本區(qū)分明顯。健康人唾液標(biāo)本僅見伊文思藍(lán)底染紅色正常上皮細(xì)胞，無(wú)特異性蘋果綠染。病例唾液標(biāo)本除可見伊文思藍(lán)底染以外，幾乎在所有視野中都觀察到大小、形狀不一的特異性性的呈蘋果綠色的狂犬病病毒抗原抗體結(jié)合物。

1：DFA production of healthy control；2：DFA production of rabies case；3：DFA production of rabies case.圖1　狂犬病病例DFA檢測(cè)結(jié)果Fig.1　DFA production of rabies case

2.2反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)結(jié)果病例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果如圖2。病例唾液標(biāo)本經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增N蛋白，在預(yù)期位置獲得特異性條帶，唾液標(biāo)本呈陽(yáng)性反應(yīng)。

M：DL2000 Marker; 1：RT-PCR production of healthy control；2：RT-PCR production of rabies case.圖2　狂犬病病例RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2　RT-PCR production of rabies case

2.3狂犬病病毒N基因系統(tǒng)進(jìn)化分析及同源性比較病例唾液標(biāo)本RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)核苷酸序列測(cè)定獲得狂犬病病毒N蛋白部分核苷酸序列，共250 bp。經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)顯示與2011年安徽省犬源狂犬病病毒株11AF60(GenBank序列號(hào)：JQ798953)核苷酸同源性最為接近，為98.4%。在NCBI網(wǎng)站篩選背景清晰的、具有代表性的狂犬病病毒N蛋白基因序列共同進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(如圖3)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示：狂犬病病毒株存在時(shí)間、空間和物種聚集性。來(lái)自浙江省和江蘇省的人源和犬源狂犬病病毒株形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支；浙江省和江西省的鼬獾源的狂犬病病毒形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支；河南省狂犬病病毒株形成兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支，河南省人源狂犬病病毒株和部分犬源狂犬病病毒株與安徽省犬源狂犬病病毒株親緣關(guān)系接近，河南省部分犬源狂犬病病毒株也形成一個(gè)獨(dú)立分支。

圖3　狂犬病病毒N蛋白基因時(shí)空進(jìn)化分析Fig.3　Phylogenetic analysis of N protein genes of rabies viruses

2.4病例抗狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)結(jié)果病例腦脊液標(biāo)本為發(fā)病后第6 d腦脊液標(biāo)本，抗狂犬病病毒中和抗體效價(jià)為0.0 IU/mL(<0.05 IU/mL)，為陰性。病例血清標(biāo)本為發(fā)病后第7 d的血清標(biāo)本，抗狂犬病病毒中和抗體效價(jià)為0.85 IU/mL(≥0.05 IU/mL)，為陽(yáng)性。

3討論

該狂犬病病例臨床癥狀典型。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)抗原、核酸均為陽(yáng)性；病例沒(méi)有確切的狂犬病暴露史，因此也沒(méi)有進(jìn)行狂犬病暴露后免疫，病例血清中的抗狂犬病病毒中和抗體為陽(yáng)性。所有這些證據(jù)均表明該病例為狂犬病病例。該狂犬病病例的特殊性在于沒(méi)有確切的狂犬病暴露史。病例在病程初期自述近期無(wú)狂犬病暴露史。流行病學(xué)調(diào)查顯示病例發(fā)病半年前家中開始養(yǎng)犬，拴養(yǎng)，家犬至病例發(fā)病一直存活，無(wú)異常表現(xiàn)。根據(jù)國(guó)際社會(huì)公認(rèn)的十日觀察法判斷，可以排除家犬作為感染來(lái)源的可能。病例家屬及同村村民因此堅(jiān)持認(rèn)為病例的發(fā)病源于20多年前一次未經(jīng)處理的嚴(yán)重犬傷。

狂犬病病毒是一種高度保守的病毒，尤其以狂犬病病毒基因組中的N蛋白核苷酸序列最為保守，大多數(shù)毒株N蛋白基因核苷酸序列的同源性大于98%[2]。這種情況下采用分子生物學(xué)手段對(duì)狂犬病病毒進(jìn)行溯源似乎并不樂(lè)觀。中國(guó)人狂犬病感染途徑單一，狂犬病病毒基因型穩(wěn)定[3]，這種情況則使分子流行病學(xué)溯源具有一定的可能性。研究篩選時(shí)間、空間和物種等背景清晰的、具有代表性的狂犬病病毒N蛋白基因序列進(jìn)行時(shí)空進(jìn)化分析。進(jìn)化分析顯示：中國(guó)的狂犬病病毒株存在物種聚集性、時(shí)間和空間聚集性。這種聚集性是由于同種野生物種在同一時(shí)間和空間接觸機(jī)會(huì)多，相互感染導(dǎo)致的結(jié)果。犬源狂犬病病毒株除體現(xiàn)一定的物種聚集性以外，與同一時(shí)間和空間的其他物種(尤其是人)的親緣關(guān)系存在一定交叉。這恰好證實(shí)了在中國(guó)，犬是狂犬病感染的幾乎唯一來(lái)源。經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)該病例感染的狂犬病病毒株與2011年安徽省犬源狂犬病病毒株11AF60核苷酸同源性最為接近。綜合考慮以上兩點(diǎn)，我們有理由認(rèn)為該病例的發(fā)病源于至少2011年以來(lái)的某次不自覺(jué)的狂犬病病毒感染。這也意味著該病例的最長(zhǎng)潛伏期不超過(guò)兩年，與二十多年前的犬傷并無(wú)關(guān)聯(lián)?？紤]到病例來(lái)自犬只管理相對(duì)混亂的農(nóng)村地區(qū)[4]，因此犬作為感染來(lái)源的可能性非常大。

研究在一定程度上解釋了病例可能的感染來(lái)源和感染時(shí)間，但是并沒(méi)有直接證據(jù)。在目前階段，即使是暴露史明確的狂犬病病例，未必能獲得完整的證據(jù)鏈。這在一定程度上是由于狂犬病監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的缺失導(dǎo)致的。這種缺失與狂犬病的特殊性以及現(xiàn)階段公眾對(duì)狂犬病的認(rèn)識(shí)相關(guān)：多數(shù)狂犬病病例臨床癥狀典型，無(wú)須實(shí)驗(yàn)室確診。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室診斷只有在病程中晚期才能介入，此時(shí)已經(jīng)失去了狂犬病暴露后預(yù)防的最后機(jī)會(huì)，而且?guī)缀鯖](méi)有治愈的希望。實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)狂犬病病例似乎沒(méi)有意義可言。事實(shí)上，狂犬病病例的實(shí)驗(yàn)室診斷有助于指導(dǎo)犬的免疫和人的免疫[5-6]。狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷更為長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義在于，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷不斷提高狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷的能力和水平，完善狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷數(shù)據(jù)。尤其是分子水平的數(shù)據(jù)。使實(shí)驗(yàn)室診斷在狂犬病的預(yù)防和治療中發(fā)揮更加重要的作用。由中國(guó)科學(xué)家研發(fā)的重組狂犬病病毒可以阻止狂犬病病毒野毒株感染小鼠的病情進(jìn)一步發(fā)展惡化[7-8]?？袢〉闹委熣谄D難而積極的推進(jìn)。中國(guó)政府已經(jīng)認(rèn)識(shí)到狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷的重要性，將在新的全國(guó)狂犬病監(jiān)測(cè)方案中對(duì)狂犬病病例的實(shí)驗(yàn)室診斷提出要求。力求從各個(gè)方面包括實(shí)驗(yàn)室診斷方面提高狂犬病的防治水平。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.011

通訊作者：許汴利，Email：bianlixu@163.com

中圖分類號(hào)：R373.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)05-473-04

Corresponding author:XU Bian-li, Email：bianlixu@163.com

收稿日期：2015-11-26修回日期：2016-02-17

Molecular epidemiology analysis of a unknown exposure human rabies

LI Xing-le，LI Feng-li, LI Yi, SUN Jian-wei, HUANG Xue-yong，XU Bian-li

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanCentersforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

Abstract:Direct immunofluorescence assay (DFA), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) were used to detect the samples of saliva, cerebrospinal fluid (CSF), serum of a living patient for rabies laboratory diagnosis. The infection source of the unknown exposure of human was analyzed with molecular epidemiology method rabies. Results showed that the rabies virus antigen of the saliva samples of patient was positive. The predicted segments of the nucleoprotein (N) genes of rabies virus was amplified from the saliva samples of patient. Rabies virus neutralizing antibody (RVNP) was proved positive in the serum sample of patient. The rabies virus had the highest nucleotide homology with 11AF60(98.4%).In clusion the suspected human rabies case was diagnosed in laboratory as defined rabies case,and have been infected by rabies virus since 2011.

Key words:rabies; reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR); molecular epidemiology analysis This study was supported by the Science and Technology Research Programs in Henan Province-Provincial Program(No. 42102310389)

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.42102310389)資助