魏艷玲，郭愛疆,2，劉光學(xué)，楊　銳，張少華，侯俊玲，駱學(xué)農(nóng),2

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豬帶絳蟲胰島素受體TsIR-4810的鑒定及LBD區(qū)表達(dá)

魏艷玲1，郭愛疆1,2，劉光學(xué)1，楊銳1，張少華1，侯俊玲1，駱學(xué)農(nóng)1,2

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅省動物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730046；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009

摘要：目的克隆鑒定豬帶絳蟲胰島素受體TsIR-4810基因，并表達(dá)其LBD 區(qū)。方法設(shè)計豬帶絳蟲胰島素受體TsIR-4810特異性引物，并分段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。TsIR-4810的完整ORF序列經(jīng)BLAST同源比對，SMART預(yù)測其結(jié)構(gòu)域，SWISS-MODEL同源建模，并用PhyML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將TsIR-4810的LBD區(qū)克隆至pET-30a中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定。結(jié)果獲得的目的基因完整的ORF為4 920 bp，其編碼蛋白的氨基酸序列與其他生物的胰島素受體一樣，具有相對保守的分泌信號肽、受體L1和L2結(jié)構(gòu)域、FnⅢ結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和受體酪氨酸激酶域。構(gòu)建的LBD重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)了63 ku的目的蛋白，與預(yù)期大小相符，且主要以包涵體形式存在。結(jié)論TsIR-4810為豬帶絳蟲胰島素受體基因，其LBD區(qū)的成功表達(dá)，將為開展基于胰島素受體LBD區(qū)的新型疫苗和藥物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬帶絳蟲；胰島素受體；鑒定；LBD；表達(dá)

豬帶絳蟲(Taeniasolium)是重要的人獸共患寄生蟲病[1-2]。胰島素信號通路作為非常古老的信號傳導(dǎo)途徑[3-4]，在控制細(xì)胞生長及代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用，并且可以影響細(xì)胞與外界環(huán)境的相互作用。最新研究表明，寄生蠕蟲不僅存在胰島素(樣)多肽(ILPs)，而且還存在與哺乳動物同源性很高的胰島素受體(IR)及下游分子，并可利用宿主胰島素調(diào)節(jié)自身代謝和生長發(fā)育。日本血吸蟲[5]、曼氏血吸蟲[6]及棘球絳蟲[7-8]等寄生蠕蟲均存在IR。酵母雙雜交試驗(yàn)也證實(shí)，血吸蟲和棘球絳蟲的IRs可與人胰島素發(fā)生相互作用，從而調(diào)節(jié)蟲體的葡萄糖代謝和生長發(fā)育。血吸蟲胰島素受體疫苗的相關(guān)研究表明[9]，利用受體的胰島素結(jié)合區(qū)免疫宿主可以達(dá)到抑制蟲體生長發(fā)育的目的。You[10]用日本血吸蟲胰島素受體的配體結(jié)合區(qū)(SjLD2)免疫的小鼠攻擊感染血吸蟲尾蚴后，糞便中的蟲卵數(shù)明顯減少，成蟲發(fā)育遲緩，小鼠肝臟的肉芽腫強(qiáng)度明顯降低。

本文克隆鑒定了豬帶絳蟲胰島素受體基因TsIR-4810，對其配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (ligand binding domain，LBD)進(jìn)行了表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)蟲株、菌株及主要試劑豬帶絳蟲成蟲節(jié)片由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T克隆載體、rTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA marker、RACE試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司；原核表達(dá)載體pET-30a (+)由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Dpα、BL21購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于羅氏公司。

1.2豬帶絳蟲TsIR-4810的克隆根據(jù)我們完成的豬帶絳蟲全基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計如下兩對特異性引物(F1：5′-ATGTCGACGCATCATAATCAT-3′，R1：5′-CGATTCATCCGTAGCGTGACGCTAT-3′；F2：5′-CGAGGAATTGCAGAATAGCGTCA-3′，R2：5′-TCAACGCGAGAGTGGAGGTTCTAC-3′)，以對TsIR-4810的完整ORF進(jìn)行分段擴(kuò)增。

按照Trizol試劑的操作說明提取豬帶絳蟲總 RNA，按 Prime Script Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA第一鏈，用TsIR-4810特異性引物F1/R1和F2/R2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥盏腜CR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Dpα，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3TsIR-4810的序列分析與鑒定將獲得的兩段序列進(jìn)行拼接，Blast進(jìn)行相似性搜索；通過SMART對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用MAFFT (-auto)進(jìn)行序列比對，用ProtTest軟件選擇進(jìn)化模型，并根據(jù)模型 (WAG+I+G+F)，以最大似然法(PhyML軟件)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(自展檢驗(yàn)重復(fù)100次)。用在線軟件PredictProtein和SWISS-MODEL預(yù)測其二級及3D結(jié)構(gòu)。

1.4TsIR-4810配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)的表達(dá)

1.4.1引物的設(shè)計針對TsIR-4810的LBD區(qū)設(shè)計引物，截去其信號肽序列，引入BamH I、XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。引物由生工生物工程股份有限公司合成。F3：5′-CGCGGATCCGTCGCGACAGAGAATGGCTGTGCTT-3′，F(xiàn)4：5′-CCGCTCGAGCGATTCATCCGTAGCGTGACGCTAT-3′。

1.4.2表達(dá)載體的構(gòu)建以測序正確的質(zhì)粒為模板，用上述表達(dá)引物PCR擴(kuò)增獲得LBD序列?；厥占兓哪康钠魏驮吮磉_(dá)載體pET-30a(+)分別用BamH I和XhoI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，16 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，雙酶切和PCR鑒定為陽性的克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.3重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)取攜帶pET-TsIR-LBD陽性質(zhì)粒的BL21菌液，按1∶100接種于K+的2×YT培養(yǎng)基液中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600nm=0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L ，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，SDS-PAGE電泳，檢測目的蛋白的表達(dá)情況。

1.5表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot檢測收集菌體，經(jīng)反復(fù)凍融及超聲波處理后，按照Invitrogen公司鎳瓊脂糖凝膠FF操作說明純化目的蛋白。將純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用半干電轉(zhuǎn)儀在23 V恒壓下轉(zhuǎn)印30 min，于5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；加入1∶2 000倍稀釋的His抗體，室溫振蕩孵育1.5 h；PBST充分洗滌后，加入兔抗鼠IgG(1∶20 000倍稀釋)，室溫下振蕩孵育1 h；加入DAB顯色。

2結(jié)果

2.1豬帶絳蟲TsIR-4810的鑒定

2.1.1TsIR-4810的克隆及序列分析PCR產(chǎn)物電泳(圖1)及測序結(jié)果顯示，兩段目的序列的長度分別為1 753 bp和3 234 bp，拼接后TsIR-4810的ORF全長為4 920 bp。

1：TsIR-4810-1；2：TsIR-4810-2；M：DNA標(biāo)志物1：Amplification of TsIR-4810-1；2：Amplification of TsIR-4810 -2；M：DNA Maker圖1　豬帶絳蟲TsIR-4810的分段PCR擴(kuò)增Fig.1　Amplification of TsIR-4810 fragment

2.1.2蛋白的結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化Blast比對顯示，TsIR-4810與細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲胰

島素受體2核苷酸和氨基酸的同源性均在80%以上，而與其他物種的胰島素受體I核苷酸和氨基酸的相似性均在40%左右。與人、血吸蟲、秀麗桿線蟲、果蠅、棘球絳蟲胰島素受體的氨基酸序列比對表明，TsIR-4810與所比較的物種胰島素受體一樣，均具有相對保守的結(jié)構(gòu)域，包括分泌信號肽、受體L1(58-179aa)和L2(405-519aa)結(jié)構(gòu)域、FnⅢ結(jié)構(gòu)域(553-690aa，705-945aa，1026-1162aa)、跨膜區(qū)(1182-1204aa)、受體酪氨酸激酶(1245-1571aa)區(qū)等。胰島素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)的氨基酸序列比較表明，該區(qū)有17個半胱氨酸(Cys)和11個亮氨酸(Leu)殘基在所有物種間完全一致，說明這些位點(diǎn)非常保守。從構(gòu)建的胰島素受體家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，絳蟲和吸蟲的兩條胰島素受體可以明顯的聚為兩類(IR1和IR2)，而TsIR-4810與EmIR-1和SjIR-1聚在一起，說明他們間親緣關(guān)系較近。

2.1.3TsIR 蛋白二級結(jié)構(gòu)及3D結(jié)構(gòu)預(yù)測預(yù)測顯示，TsIR-4810二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)占27.5%，β-折疊(E)占14.8%，無規(guī)則卷曲(L)占57.7%。TsIR-4810 LBD結(jié)構(gòu)域的3D模型與人的IR-LBD空間結(jié)構(gòu)相似，均呈倒“V”型布局。V型的一條臂由L1結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和L2結(jié)構(gòu)域組成，另一個臂由部分FnⅢ結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

2.2TsIR-4810 LBD重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定重組質(zhì)粒pET-TsIR-LBD經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切，得到6 000 bp左右載體條帶和1 687 bp左右的目的條帶(圖2)。說明TsIR-4810 LBD片段成功插入表達(dá)載體中。測序結(jié)果表明，TsIR-4810 LBD片段長度為1 687 bp，編碼562個氨基酸。

C.elegans：秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans；D.melanogaster：果蠅Drosophila melanogaster；T.solium：豬帶絳蟲Taenia solium；E.granulosus：細(xì)粒棘球絳蟲Echinococcus granulosus；E.mmultilocularis：多房棘球絳蟲Echinococcus multilocularis；S.japonicum：日本血吸蟲Schistosoma japonicum；S.mansoni：曼氏血吸蟲Schistosoma mansoni；IR：胰島素受體Insulin receptor圖2　不同物種IR基因的結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2　Phylogenetic analysis of IR from different species

A：人胰島素；　B：豬帶絳蟲胰島素受體TsIR-4810A：HIR；　　　B：TsIR-4810圖3　TsIR-4810與HIR的3D結(jié)構(gòu)比較Fig.3　3D structural comparison of HIR and TsIR-4810

2.3重組蛋白的表達(dá)及鑒定SDS-PAGE結(jié)果表明，在2×YT培養(yǎng)基中于30 ℃、IPTG終濃度0.3 mmol/L 的條件下誘導(dǎo)6 h，重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大值。重組蛋白的分子質(zhì)量約為63 ku，與理論推導(dǎo)值相一致。誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)超聲波處理后的上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果目的蛋白90%以包涵體形式存在。Western-blot分析表明，目的蛋白可與抗His標(biāo)簽的抗體反應(yīng)。

M：DNA標(biāo)志物；1：pET-TsIR-LBD質(zhì)粒；2：pET-TsIR-LBD雙酶切產(chǎn)物；3：TsIR-LBD的PCR產(chǎn)物；M：DNA Maker；1：recombinant plasmid pET-TsIR-LBD；2：identification of pET-TsIR-LBD3：product of TsIR-LBD圖4　重組質(zhì)粒pET-TsIR-LBD的雙酶切鑒定Fig.4　Identification of the recombinant plasmid pET-TsIR-LBD

M ：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：沉淀；2：上清；3：pET-30a對照M：Protein molecular weight marker；1：Supernatant after ultrasonic disruption；2：Pellets after ultrasonic disruption；3：pET-30a vector control圖5　重組蛋白pET-TsIR-LBD的表達(dá)(A)和Western-blot分析(B)Fig.5　Expression(A)and Western-blot analysis of the recombinant protein pET-TsIR-LBD

3討論

TsIR-4810的全長為4 920 bp，以β亞基跨膜區(qū)為界，分為胞內(nèi)和胞外兩部分。胞外結(jié)構(gòu)域包括: 富含亮氨酸的L1和L2 結(jié)構(gòu)域、一個位于L1和L2之間富含Cys的結(jié)構(gòu)域和3個類纖連蛋白(FnⅢ)結(jié)構(gòu)域。TsIR-4810的LBD區(qū)與其他胰島素受體2(IR2)相比，多一個受體L2結(jié)構(gòu)域和一個FnⅢ結(jié)構(gòu)域，而這正好與血吸蟲和棘球絳蟲的胰島素受體1(IR1)的結(jié)構(gòu)特征相似。說明TsIR-4810可能是豬帶絳蟲胰島素受體1(TsIR1)，這也許正與我們發(fā)現(xiàn)的豬帶絳蟲存在兩個胰島素樣基因(ILP7748和ILP7750)相吻合，即每種胰島素可能對應(yīng)一種胰島素受體，不同的受體可能承擔(dān)不同的功能。TsIR-4810與豬帶絳蟲另一個受體TsIR-1316相比，雖然多出一個L2結(jié)構(gòu)域和一個FnⅢ結(jié)構(gòu)域，但TsIR4810在1221-1224aa缺失胰島素受體底物(IRS)結(jié)合的NPXY序列。而棘球絳蟲的EmIR1和EgIR1在1134位均有NPXY的保守序列。結(jié)構(gòu)決定其功能，根據(jù)這一特征推測TsIR-4810在功能上可能與EmIR2、EgIR2更為相似。絳蟲胰島素受體2都缺失NPXY序列，暗示這兩個受體在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了功能分化。線性動物門和節(jié)肢動物門僅有一條胰島素受體，而絳蟲和吸蟲都存在兩條胰島素樣受體，絳蟲和吸蟲祖先這種獨(dú)特的IR進(jìn)化模式推測與其寄生生活相關(guān)。通過對TsIR-4810磷酸化位點(diǎn)的分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其可能的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)有Tyr16個、Thr23個、Ser71個，具有典型的胰島素受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域 (TKD)。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，盡管TsIR-4810與人的胰島素間氨基酸序列差異較大，但TsIR-4810還是具有胰島素受體保守的倒“V”型空間結(jié)構(gòu)。氨基酸序列比對、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測和系統(tǒng)進(jìn)化分析均證明，TsIR4810為豬帶絳蟲的胰島素受體基因。

You[10]等的研究表明，胰島素受體或配體結(jié)合區(qū)可作為疫苗或藥物靶標(biāo)預(yù)防寄生蠕蟲病。既然胰島素能夠通過與其受體結(jié)合調(diào)節(jié)蟲體的生長、發(fā)育，那么是否可以用藥物或抗體阻斷或封閉宿主胰島素的作用，從而達(dá)到抑制蟲體生長發(fā)育的目的。鑒于血吸蟲胰島素受體重組LBD疫苗的成功嘗試，本研究針對豬帶絳蟲TsIR-4810的LBD區(qū)設(shè)計引物，在大腸桿菌中進(jìn)行了成功表達(dá)。通過表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了目的蛋白的高效表達(dá)。為進(jìn)一步研究LBD抗體體外抑制豬囊尾蚴的葡萄糖吸收和胰島素受體的磷酸化，探索以TsIR-4810 LBD為重組抗原疫苗的免疫效果奠定了基礎(chǔ)。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.005

通訊作者：駱學(xué)農(nóng)，Email:luoxuenong@caas.cn

中圖分類號：R383

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-442-05

Corresponding author:Luo Xue-nong，Email: luoxuenong@caas.cn

收稿日期：2015-11-21修回日期：2016-03-18

Identification and characterisation ofTaeniasoliuminsulin receptor TsIR-4810 and expression of the ligand binding domain

WEI Yan-ling, GUO Ai-jiang, LIU Guang-xue,YANG Rui,ZHANG Shao-hua, HOU Jun-ling, LUO Xue-nong

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/KeyLaboratoryofVeterinaryPublicHealth,MinistryofAgriculture/KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046；2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China)

Abstract:Taenia solium insulin receptor 4810 (TsIR-4810) was identified, and its ligand binding domain (LBD) was cloned and expressed in the present study. Two pairs of specific primers were designed and used to amplify overlapping segments of the complete TsIR-4810 receptor gene. The complete ORF was confirmed by sequencing. Homology analysis of TsIR-4810 gene was conducted using BLAST and the domain of its encoding protein was predicted by SMART software. Tertiary structure for TsIR-4810 was predicted by SWISS-MODEL. Phylogenetic analysis was performed using PhyML. LBD fragment of TsIR-4810 gene was cloned into the PET-30a vector and expressed after induction with IPTG. The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western-blot analysis.The full length cDNA of TsIR-4810 was 4 920 bp. The comprehensive analyses of its amino acid sequence revealed the peptide showed the common features shared by other members of the insulin family, including an insulin-like motif, signal sequence and conserved domain of tyrosine kinase family. The recombinant protein was successfully expressed in E. coli BL21 (DE3) and the molecular mass of the protein was estimated to be 63 kDa. Western

blotting with anti-His antibody revealed a specific reactivity with recombinant protein and showed the successful expression in the prokaryotic system. The results showed that TsIR-4810 identified was insulin receptor from T. solium, providing the foundation for further studies on its physiological function and development of new vaccines and biological drugs.

Key words:Taenia solium; insulin receptor;identification; ligand binding domain; expression Supported by the National Natural Science Foundation for China (No.31372433)

國家自然科學(xué)基金項目(No.31372433)資助