趙嘉詠,郝寶林, 謝志強,黃學(xué)勇,穆玉嬌,夏勝利

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河南省一起斯坦利沙門菌聚集性病例的病原學(xué)研究及溯源分析

趙嘉詠,郝寶林, 謝志強,黃學(xué)勇,穆玉嬌,夏勝利

河南省疾病預(yù)防控制中心，鄭州450016

“十二五”國家科技重大專項(No.2012ZX10004201和No.2013ZX10004203)聯(lián)合資助

摘要：目的分析2013年1-7月份河南省2地市3家醫(yī)院分離自嬰幼兒患者糞便中的斯坦利(S.stanley)沙門菌的病原學(xué)特征及分子流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，為食源性疾病聚集性及暴發(fā)病例的調(diào)查及院感防控提供新的思路和模式。方法采集河南省3家醫(yī)院嬰幼兒住院病例的腹瀉糞便，SBG增菌，沙門菌科瑪嘉選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，API20E腸桿菌科系統(tǒng)生化板條鑒定后使用丹麥SSI分型血清進行沙門菌O抗原及H1/2相鞭毛誘導(dǎo)血清凝集試驗。根據(jù)PulseNet China病原體分子分型網(wǎng)絡(luò)公布的沙門菌脈沖場凝膠電泳(PFGE)操作指南與美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)沙門菌K-B法藥敏測試方案，對其進行PFGE分子分型與聚類分析及17種抗生素藥敏測試。結(jié)果分離自15位嬰幼兒住院病例糞便中的沙門菌經(jīng)鑒定均為斯坦利沙門菌(S.stanley)，藥敏測試顯示其對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、亞胺培南等8種抗生素敏感，對氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林等9種抗生素耐藥，其中12株菌耐藥表型完全一致。15株斯坦利沙門菌經(jīng)XbaI與BlnI限制性雙酶切和PFGE電泳后分為STN1和STN2兩種帶型，其中STN1帶型包含14株菌，與另1株(STN2)具有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)度的菌株帶型差異度較大。STN1經(jīng)“PulseNet China”數(shù)據(jù)庫比對證實為斯坦利沙門菌河南省獨有帶型。結(jié)論病原學(xué)診斷及PFGE分子分型結(jié)果證實了15例斯坦利沙門菌感染病例間可能存在高度的分子流行病學(xué)關(guān)聯(lián)和聚集性，為進一步的追蹤溯源和調(diào)查取證提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：斯坦利沙門菌； 聚集性病例；藥敏測試；PFGE

沙門菌屬是一種廣泛存在于自然界的重要人獸共患病原菌，也是近幾年來全球范圍內(nèi)食源性疾病病原學(xué)監(jiān)測和暴發(fā)疫情常見的主要病原，準(zhǔn)確快速的病原學(xué)診斷能為臨床治療和疫情處置提供必需的參考依據(jù)。2012年1月起，河南省2地市斯坦利沙門菌(S.stanley)感染病例異常增多，懷疑為散發(fā)性暴發(fā)事件，隨即河南省CDC傳染病實驗室開展了病原學(xué)診斷與脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型與聚類分析，為臨床治療和及時啟動流行病學(xué)調(diào)查及防控措施的制定提供病原學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1腹瀉樣本2012年1～7月間采集自河南省平頂山市與鄭州市3家醫(yī)院嬰幼兒住院患者的腹瀉糞便。病例年齡主要集中于0～1.5歲： 出生4天-30天9例，1個月～2個月 4例，3個月～18個月2例；男性7例，女性8例，男女性別比0.88:1。病例分別來自于平頂山市A、B兩家醫(yī)院和鄭州市C醫(yī)院，8例出生后即入住ICU病房?；颊咂毡榇嬖诟篂a、發(fā)熱、嘔吐等癥狀，其糞便性狀以黃綠色水樣便為主，一共11例，占腹瀉總數(shù)的73.3%。流行病學(xué)調(diào)查顯示，B到C醫(yī)院、A到C醫(yī)院，AB醫(yī)院間發(fā)生過病例轉(zhuǎn)院事件，其中A、B兩個醫(yī)院各向C醫(yī)院轉(zhuǎn)院4例病人，A、B醫(yī)院間相互轉(zhuǎn)院2例病人，見表1，圖1。

圖1　斯坦利沙門菌感染病例轉(zhuǎn)院示意圖Fig.1　The transfer map of S. stanley infected patient

表115例嬰幼兒病例臨床表征統(tǒng)計

Tab.1Clinical characterization of 15 infant cases

臨床表現(xiàn)Clinicalsymptoms例數(shù)Case比例%Ratio腹瀉diarrhea15100.0發(fā)熱fever1386.7乏力weak1173.3嘔吐vomit853.3腹脹abdominaldistention640.0腸鳴音亢進hyperactivebowelsounds853.3敗血癥hematosepsis746.7壞死性小腸結(jié)腸炎necrotizingen-terocolitis213.3

1.1.2主要試劑和儀器1)試劑：沙門菌亞硒酸鹽煌綠增菌液(SBG)、沙門菌科瑪嘉選擇性培養(yǎng)基購自法國CHROMAgar公司；克氏雙糖(KIA)、動力吲哚尿素瓊脂(MIU)購自北京陸橋技術(shù)公司；腦心浸液、M-H瓊脂及藥敏紙片購自英國OXOID公司；API20E腸桿菌科細菌鑒定板條購自法國bioMérieux公司；沙門菌診斷血清購自丹麥SSI公司； Seakem Glod瓊脂糖購自美國LONZA公司；蛋白酶K購自英國Roche公司；限制性內(nèi)切酶XbaI購自大連寶生物公司； Tris-Hcl(1 mol/L, pH8.0)，EDTA(0.5 mol/L，pH8.0)，5×TBE購自solarbio公司。2)儀器：去離子水系統(tǒng)購自美國Milipore公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；VITEK2濁度儀購自法國bioMérieux公司；脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1沙門菌分離培養(yǎng)、生化鑒定與血清學(xué)分型將0.5克(稀便)或100 μL(水樣便)腹瀉糞便接種于5 mL亞硒酸鹽煌綠增菌液，37 ℃培養(yǎng)16 h后用無菌接種環(huán)三區(qū)劃線接種于沙門菌科瑪嘉選擇性培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后挑取邊緣整齊、光滑、凸起的淡紫色菌落穿刺接種于克氏雙糖/動力吲哚尿素培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后挑取發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖、產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫、動力陽性尿酶陰性靛基質(zhì)陰性的菌株轉(zhuǎn)種腦心浸液平板，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，0.85%生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠞岫染?，API20E腸桿菌科系統(tǒng)生化板條鑒定，SSI沙門菌診斷血清進行O相玻片凝集分型，再利用0.4%營養(yǎng)軟瓊脂進行H相(1/2相)鞭毛誘導(dǎo)與血清凝集，生理鹽水做自凝對照。根據(jù)卡芙曼-懷特(Kauffmann-White)血清分型表確定對應(yīng)血清型別。

1.2.2脈沖場凝膠電泳分型按照國際Pulsenet China網(wǎng)絡(luò)實驗室公布的沙門菌脈沖場凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)分型方法，對沙門菌株進行分子分型，標(biāo)準(zhǔn)株H9812作為分子量標(biāo)記。限制性內(nèi)切酶XbaI/BlnI(50U)，37 ℃酶切2.5 h。電泳參數(shù)：電壓6 V/cm，脈沖時間2.2～63.8 s，線性轉(zhuǎn)換，電場夾角120°，電泳時間19 h，電泳液溫度14 ℃。電泳結(jié)束后膠塊用GelRed染料染色20 min后純水清洗30 min后凝膠成像儀拍照(曝光時間3.0 s，去過飽和成像)。

1.2.3藥敏試驗參照WHO推薦的Kirby-Bauer法，將沙門菌轉(zhuǎn)種腦心浸液瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后0.85%生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粦乙?。用無菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布于M-H平板表面，用分配器將藥敏紙片壓蓋其上，15 min內(nèi)送37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h以后測量各藥敏紙片抑菌圈直徑，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2009年標(biāo)準(zhǔn)進行耐藥表型判定，大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.4數(shù)據(jù)分析用BioNumerics6.0軟件對電泳圖譜進行數(shù)據(jù)分析，繪制聚類分析樹狀圖。聚類算法為非加權(quán)配對平均法(UPGMA,Dice)，電泳條帶位置優(yōu)化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%認定為同一PFGE帶型。

2結(jié)果

2.1沙門菌鑒定與血清學(xué)分型結(jié)果15株沙門菌在沙門菌科瑪嘉培養(yǎng)基上均為紫紅色、邊緣整齊、光滑凸起小菌落；KIA/MIU小生化反應(yīng)為：發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)硫化氫；尿酶陰性，動力陽性，靛基質(zhì)陰性。API20E腸桿菌科系統(tǒng)生化鑒定為沙門菌(ID%99.2%)，血清抗原式為1,4,5,12:d:1,2，參照卡芙曼-懷特沙門菌血清分型手冊判定均為斯坦利沙門菌。

2.2藥敏測試結(jié)果15株斯坦利沙門菌對環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)，復(fù)方新諾明(SXT)，四環(huán)素(TET)，亞胺培南(IPM)，美羅培南(MEM)，頭孢哌酮(SCF)，哌拉西林(TZP)敏感；對氨芐西林(AMP)，頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)，阿莫西林(AML)，頭孢吡肟(FEP)，萘啶酸(NAL)，諾氟沙星(NOR)，鏈霉素(STR)及增效磺胺類抗生素甲氧芐氨嘧啶(TMP)耐藥。15株菌中有12株耐藥表型一致，耐藥譜為AMP-CAZ-AML-FEP-NAL-NOR-STR-TMP。

2.3PFGE分子分型結(jié)果15株斯坦利沙門菌經(jīng)XbaI/BlnI雙酶切后分為2種帶型，分別命名為STN1與STN2，其中STN1包含14株菌，雙酶切帶型完全一致；STN2僅有1株菌，與STN1帶型相似度38.9%。STN1帶型圖譜遞交至“PulseNet China”中心實驗室數(shù)據(jù)庫進行比對，未發(fā)現(xiàn)與其他省份斯坦利沙門菌帶型存在同源性，證實為河南省斯坦利沙門菌獨有帶型(圖2，圖3)。

圖2　河南省斯坦利沙門菌XbaI/BlnI雙酶切PFGE與聚類分析圖譜Fig.2　XbaI/BlnI PFGE cluster analysis of S. stanley in Henan Province

圖3　河南省斯坦利沙門菌STN1帶型(紅框內(nèi))與“PulseNet China”中心實驗室數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果Fig.3　Comparison results of STN1 belt type with “PulseNet China” data base

3討論

能引起人類食源性疾病的非傷寒沙門菌血清型眾多。從河南省近4年的監(jiān)測數(shù)據(jù)和其他省份的報道看，位居前列的血清型主要是鼠傷寒(S.typhimurium)、腸炎(S.enteritidis)、阿貢那(S.agona)、德爾比(S.derby)等[1-2]。斯坦利沙門菌在我省屬于罕見血清型，2009-2011年共計分離到2株，但從2012年2月開始，菌株數(shù)突然增多，至7月份已增至15株，且病例主要集中于2個地市的3家醫(yī)院，具有初步的聚集性特征，盡管時空跨度比較大，但足以引起我們的重視。從國內(nèi)外的報道看，斯坦利沙門菌在病人，食品及外環(huán)境中均有檢出，主要引起成人或兒童散發(fā)性腹瀉，偶有小規(guī)模爆發(fā)[3-4]，臨床癥狀輕、病程短，但此次河南省2地市的感染病例主要集中于出生3個月以內(nèi)的嬰幼兒，且8例出生后即入住ICU病房，除腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀外，還出現(xiàn)了敗血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)，通過訪談沒有發(fā)現(xiàn)居住地、出生醫(yī)院、使用奶粉、發(fā)病前用藥、喂養(yǎng)、飲水等共同的商品化暴露因素，這在河南省以往的沙門菌感染病例中是非常罕見的。結(jié)合病原學(xué)診斷和流行病學(xué)資料綜合分析，我們高度懷疑這是一起由斯坦利沙門菌院內(nèi)交叉感染引起的散發(fā)性暴發(fā)事件，即由一代病例產(chǎn)生交叉?zhèn)魅?，繼而伴隨病人的轉(zhuǎn)院形成傳播和產(chǎn)生后續(xù)病例。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)不僅能夠通過日常監(jiān)測積累的病原菌分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)建立基線和設(shè)定閾值，為及時發(fā)現(xiàn)聚集性病例或暴發(fā)疫情提供早期預(yù)測預(yù)警，而且能夠?qū)︻愃票景咐@種以高度散發(fā)形式存在的、在較長時間范圍內(nèi)跨地域傳播的病例進行溯源調(diào)查分析，查找出各病例間的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，這是以往靠傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查方法無法實現(xiàn)的，是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與現(xiàn)場流行病學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物。在美國“鼠傷寒沙門菌污染花生醬事件”、英國“吉百利巧克力事件”、歐洲“O104出血性大腸桿菌”暴發(fā)疫情及國內(nèi)類似疫情的處置過程中，以PFGE技術(shù)為代表的網(wǎng)絡(luò)化監(jiān)測溯源平臺就發(fā)揮了不可替代的重要作用[5-7]。在本研究中，我們就利用該技術(shù)將分布于不同地區(qū)3家醫(yī)院的斯坦利沙門菌散發(fā)性感染病例成功建立了流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。PFGE聚類分析技術(shù)雖然是比較成熟的技術(shù)體系，但是想要充分發(fā)揮它的作用，仍需要在試劑、方法、人員操作、分析算法等各個環(huán)節(jié)做好質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化工作，否則就容易在病例間建立錯誤的關(guān)聯(lián)，將流行病學(xué)調(diào)查指向錯誤的方向[8]。本研究中，STN2帶型盡管和STN1帶型差異度較大，但流行病學(xué)調(diào)查顯示該病例與STN1帶型病例間存在密切關(guān)聯(lián)性，需要我們做進一步的研究分析。這不僅說明PFGE技術(shù)在分辨度和識別力方面仍具有一定的技術(shù)局限性，更提醒我們在實踐中要充分結(jié)合和深入分析病原學(xué)與流行病學(xué)信息，發(fā)揮各自優(yōu)勢的同時緊密合作，才能更好把握疾病傳播特點，發(fā)揮PFGE技術(shù)在疾病防控、突發(fā)公衛(wèi)事件/疫情處置中的作用。

本研究中，15株斯坦利沙門菌藥敏測試顯示其對臨床常用的三代、四代頭孢類抗生素，三代氟喹諾酮類抗生素和增效磺胺類等9種抗生素均呈耐藥性。從河南省近5年的沙門菌藥敏測試數(shù)據(jù)看，耐9種以上抗生素的多重耐藥菌一般只會出現(xiàn)在鼠傷寒、腸炎、阿貢那、德爾比等常見沙門菌血清型上，類似斯坦利沙門菌這種罕見血清型別的沙門菌株對絕大部分抗生素都是敏感的，因此我們認為這種耐藥表型與PFGE帶型聚類一致性的特點，更好的說明了基于共同暴露源的菌株往往具有相同的耐藥基因和表型特征，這種特征盡管存在變異性和不確定性，但在一定范圍內(nèi)也可以為及早發(fā)現(xiàn)聚集性病例提供重要線索。

由于客觀原因在調(diào)查過程中我們沒能從ICU病房內(nèi)采集環(huán)境樣本進行分離檢測，本聚集性病例的調(diào)查沒有形成完整的病原學(xué)證據(jù)鏈，只能推論為醫(yī)院ICU病房消毒不徹底和轉(zhuǎn)院導(dǎo)致的院內(nèi)繼發(fā)性感染。這是河南省首次利用分子分型網(wǎng)絡(luò)技術(shù)平臺開展食源性疾病病例調(diào)查和危險因素分析研究，為今后相關(guān)工作的開展奠定了基礎(chǔ)。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.016

通訊作者：夏勝利，Email：xiasl@hncdc.com.cn

中圖分類號：R378

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-497-05

Corresponding author:Xia Sheng-li, Email: xiasl@hncdc.com.cn

收稿日期：2015-10-25修回日期：2016-03-11

Pathogenic investigation and molecular tracing analysis ofSalmonellastanleyclusters cases in Henan Province

ZHAO Jia-yong1, HAO Bao-lin2, XIE Zhi-qiang3,HUANG Xue-yong4, MU Yu-jiao5, XIA Sheng-li6

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

Abstract:In order to analyze the etiological characteristics and molecular epidemiological relationship of Salmonella stanley (S. stanley) strains isolated from infant patients in three hospitals of Henan Province from January to July in 2013 and provide new ideas and models for foodborne illness's clustered and outbreak cases investigations and hospital infection prevention and control, we collected and isolated diarrhea stool of hospitalized infants cases in three hospitals of two cities. By using SBG enrichment and Salmonella CHROMagar selective media, suspicious strains were identified and been made Salmonella O antigen and H1/ 2 phase flagellum-induced serum agglutination test by API20E biochemical systems and SSI Salmonella typing sera. According to molecular typing and Salmonella K-B drug susceptibility testing method published by the international PulseNet bacterial infectious disease monitoring network and USA clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), we analyzed drug sensitivity to 17 kinds antibiotics and PFGE molecule characteristics.Fifteen strains of S. stanley were identified in this research and antibiotics susceptibility testing showed they were sensitive to ciprofloxacin, levofloxacin, cotrimoxazole, tetracycline, imipenem and other 8 kinds of antibiotics and resistant to 9 kinds of antibiotics with 12 strains having the same AST phenotypes. Fifteen strains of S. stanley were divided into 2 molecular patterns by digestion with XbaI/BlnI and pulsed field gel electrophoresis (PFGE), STN1 pattern contains 14 strains and STN2 pattern contains 1 strains. There was a bigger difference between STN1 and STN2 belts in similarity though they existed epidemiological link. STN1 was confirmed as a unique S. stanley type in Henan Province by "PulseNet China" database comparison. The PFGE technology confirmed the molecular epidemiological relevance among S. stanley infection cases, providing the technical support for further epidemiological tracing and investigation.

Key words:S. stanley; clusters cases; AST; PFGE Supported by the National Science and Technology Major Project(Nos. 2012ZX10004201& 2013ZX10004203)