鄧小軍，李桂芳，魏　穎，龐茜丹，朱宏建*，高必達(dá)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128；3.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

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油菜菌核病菌致病性分化及弱毒現(xiàn)象

鄧小軍1，2，3，李桂芳1，2，魏穎1，2，龐茜丹1，2，朱宏建1，2，3*，高必達(dá)1， 2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128；3.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

摘 要：對(duì)湖南省常德、益陽(yáng)兩地的196個(gè)油菜菌核病菌株進(jìn)行分離純化，采用離體葉片法測(cè)定它們的致病力，發(fā)現(xiàn)兩地區(qū)油菜菌核病菌的致病力明顯分化。運(yùn)用纖維素吸附法提取19個(gè)弱致病力菌的dsRNA，其中3個(gè)菌株含有dsRNA，菌株CY019菌絲稀疏，菌核量少。進(jìn)一步利用尖端脫毒獲得不含dsRNA的菌株CY019VF，通過(guò)活體莖稈接種，發(fā)現(xiàn)其致病力得到恢復(fù)，表明CY019致病力下降可能與其所攜帶的dsRNA病毒有關(guān)。

關(guān) 鍵 詞：油菜菌核病菌；致病力；弱毒株系

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核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）可寄生 400多種植物，引起植物菌核?。?］。油菜菌核病是油菜生產(chǎn)中的首要病害。由于核盤(pán)菌寄主范圍廣，抗逆性強(qiáng)，傳播方式多、抗病資源匱乏［2］，油菜菌核病的化學(xué)防治效果不理想。

對(duì)不同地區(qū)不同寄主的核盤(pán)菌進(jìn)行的生物學(xué)特性研究表明，核盤(pán)菌存在明顯的致病性分化［3］。劉萬(wàn)仁等［4］分離了60多個(gè)核盤(pán)菌菌株，對(duì)致病力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各菌株間存在致病力差異。聶峰杰等［5］在油菜上分離得到致病力減退的油菜菌核病菌，其中菌株SMX6–1–4和SCG1–1–1沒(méi)有致病性，表明油菜菌核病菌中存在致病力的分化。Boland等［6］報(bào)道核盤(pán)菌菌株91致病力下降，與其含有的dsRNA有關(guān)。油菜菌核病菌中dsRNA、DNA、+ssRNA以及–ssRNA病毒均已被鑒定并證明與油菜菌核病菌致病力減退有關(guān)［7–8］。油菜菌核病菌中含有大量病毒資源，這為真菌病毒用于油菜菌核病生物防治提供了可能［9］。于曉等［10］發(fā)現(xiàn)，DNA病毒SsHADV–1粗提液能抑制油菜菌核病的發(fā)生，對(duì)油菜菌核病有一定的治愈作用，具有較好的生物防治潛力。

筆者分離純化了湖南省常德、益陽(yáng)兩地的196個(gè)油菜菌核病菌株，通過(guò)離體葉片法接種，發(fā)現(xiàn)菌株致病力分化明顯，19個(gè)菌株致病力減退，編號(hào)為CY019的菌株菌絲稀疏，菌核量少，存在dsRNA，脫毒后菌株CY019VF致病力得到恢復(fù)，表明CY019致病力下降可能與其所攜帶的 dsRNA病毒有關(guān)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

于湖南省常德、益陽(yáng)地區(qū)采集油菜菌核病菌菌株196株（常德104株，益陽(yáng)92株）。供試油菜為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的湘雜油9號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化和致病力測(cè)定

采用組織分離法［11］分離油菜菌核病菌核，剪取5 mm×5 mm菌核，70％乙醇消毒30 s，無(wú)菌水清洗3遍，晾干，置于PDA平板中央，20 ℃培養(yǎng)，純化菌株。

采用離體葉片接種法［12］測(cè)定油菜菌核病菌株的致病力。選取大小一致、生長(zhǎng)健康的油菜葉片，用無(wú)菌水洗凈葉面，自然晾干。在每塊葉片葉脈的對(duì)稱(chēng)位置放置培養(yǎng)3 d的5 mm菌餅，以不含菌絲的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，重復(fù)3次，20 ℃保濕培養(yǎng)。72 h后觀(guān)察發(fā)病情況，采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑。

利用牙簽菌絲體接種法［13］對(duì)弱毒菌株和弱毒脫毒菌株進(jìn)行活體莖稈接種，以無(wú)菌牙簽作為對(duì)照，重復(fù)3次，觀(guān)察發(fā)病情況。

1.2.2 弱致病力菌株的鑒定及弱毒現(xiàn)象分析

運(yùn)用簡(jiǎn)易提取方法提取弱致病力菌株基因組DNA，采用通用引物ITS–4和ITS–5（ITS4：5′?TCCT CCGCTTATTGATATGC?3′；ITS5：5′–GGAAGTAA AAGTCGTAACAAGG?3′） PCR擴(kuò)增真菌rDNA–ITS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠瓊脂糖電泳檢測(cè)，送鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)得的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn比對(duì)，并通過(guò)MEGA6軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析采用自展法（bootstrap）進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)效驗(yàn)1 000次。

運(yùn)用纖維素吸附法［14］提取真菌的dsRNA病毒，dsRNA病毒粗提液經(jīng)DNaseI和S1 Nuclease在37℃水浴處理40 min，消除混有DNA和單鏈RNA的污染。處理后的提取物進(jìn)行 1.0％瓊脂糖凝膠電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察，剩余提取物于–20 ℃短暫保存。

利用尖端脫毒法，挑取生長(zhǎng)2 d的弱致病力菌株菌絲尖端于新的PDA培養(yǎng)皿中央，培養(yǎng)2 d后，再挑取尖端菌絲于新的 PDA培養(yǎng)基。反復(fù)挑取 5次后，通過(guò)dsRNA提取檢測(cè)病毒消除情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜菌核病菌株致病力的分化

對(duì)分離純化的196個(gè)油菜菌核病菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，常德最強(qiáng)致病力菌株的病斑直徑達(dá) 68.8 mm，有9個(gè)菌株病斑直徑大于60.0 mm（表1）；益陽(yáng)最強(qiáng)致病力菌株的病斑直徑達(dá)64.3 mm，有7個(gè)菌株病斑直徑大于60.0 mm（表2）。共有19個(gè)菌株表現(xiàn)出致病力減退（常德13個(gè)，益陽(yáng)6個(gè)），表明菌株間存在致病力的分化。強(qiáng)致病菌株在離體油菜葉片上產(chǎn)生較大的病斑，接種2 d初現(xiàn)病斑，4 d發(fā)病明顯，出現(xiàn)褐色水漬狀圓形病斑，8 d時(shí)強(qiáng)致病力菌株菌絲聚集成團(tuán)，形成菌核原基，弱致病力菌株接種離體油菜葉片幾乎不發(fā)?。▓D1），分離自常德的弱毒菌株CY019菌絲稀疏，菌核量少。

表1　常德油菜菌核病菌株的致病力Table 1 Virulence of Sclerotinia sclerotiorum strains from Changde

表1?。ɡm(xù)）

表2　益陽(yáng)油菜菌核病菌株的致病力Table 2 Virulence of Sclerotinia sclerotiorum strains from Yiyang

圖1　油菜菌核病菌株接種離體葉片的發(fā)病情況Fig.1 Detached leaves inoculated with Sclerotinia scleotiorum strain

2.2 弱致病力菌株dsRNA篩選結(jié)果

運(yùn)用纖維素吸附法對(duì) 19個(gè)弱致病力菌株進(jìn)行dsRNA提取，用DNAse I和S1 Nuclease處理去除提取液中的DNA和ssRNA后，1％凝膠電泳檢測(cè)到菌株CY019、CY080和YY077中含有2.5 kb到10 kb的dsRNA條帶（圖2）。

圖2　致病力減退菌株dsRNA篩選電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of dsRNAs extracted from the attenuated strains

運(yùn)用菌絲尖端脫毒法獲得的 CY019的衍生菌株CY019VF，經(jīng)dsRNA提取檢測(cè)，不含dsRNA條帶（圖3）。將CY019和CY019VF通過(guò)擴(kuò)增ITS序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定 CY019和CY019VF為同一種真菌，即油菜菌核病菌（圖4）。

圖3　菌株CY019與CY019VF的dsRNA檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of dsRNAs from strain CY019 and strain CY019VF

圖4　菌株CY019 和 CY019VF的ITS序列進(jìn)化Fig.4 The phylogenetic analysis of ITS sequence of strain CY019 and strain CY019VF

菌株CY019與CY019VF在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)如圖5所示。兩者菌落形態(tài)正常，CY019菌絲稀疏，CY019VF菌絲緊密，7 d后CY019VF菌株開(kāi)始產(chǎn)生菌核，9 d后CY019菌株開(kāi)始產(chǎn)生菌核，CY019產(chǎn)生菌核數(shù)量比CY019VF少。

圖5　CY019與CY019VF的菌落形態(tài)Fig.5 Colony morphology of strain CY019 and strain CY019VF

接種CY019VF菌株的油菜莖稈3 d后出現(xiàn)淺褐色水漬狀梭形病斑，而CY019菌株接種及對(duì)照無(wú)明顯癥狀。接種CY019VF菌株的油菜莖稈7 d時(shí)形成較大梭形病斑，病斑邊緣水漬狀暗褐色，中間凹陷，表生絮狀菌絲，表皮裂開(kāi)，而接種CY019的病斑擴(kuò)展緩慢，直至12 d后才形成較小的、褐色且中間凹陷梭形病斑（圖6），說(shuō)明CY019為弱致病力菌株。消除dsRNA后，CY019VF菌株致病力得到恢復(fù)，由此推斷CY019致病力下降與其所含dsRNA有關(guān)。

圖6　油菜菌核病菌株接種油菜莖稈的發(fā)病情況Fig.6 The morbidity in rape inoculated with Sclerotinia scleotiorum strain stem

3 討論

對(duì)常德、益陽(yáng)地區(qū)196個(gè)油菜菌核病菌株進(jìn)行分離純化和致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌株間致病力明顯分化，但油菜菌核病致病力分化與地域無(wú)關(guān)。部分菌株表現(xiàn)出致病力減退的現(xiàn)象。有研究表明， 油菜菌核病菌Ep–lPN的致病力下降與RNA病毒的侵染有關(guān)［15］。本研究試圖從dsRNA病毒入手，尋找引起油菜菌核病菌弱毒現(xiàn)象的原因，通過(guò)纖維素吸附法篩選菌株CY019、CY080、YY077含有dsRNA病毒，對(duì)菌株CY019進(jìn)行病毒消除獲得無(wú)dsRNA衍生菌株CY019VF，通過(guò)菌落形態(tài)、產(chǎn)菌核能力、活體油菜莖稈接種比較，發(fā)現(xiàn)菌株CY019致病力下降可能與其所攜帶的dsRNA病毒有關(guān)。

以往研究表明，植物病原真菌致病力的衰退與多種因素有關(guān)，包括DNA病毒、dsRNA因子、真菌質(zhì)?；蚓€(xiàn)粒體DNA突變等［5］，但某些菌株致病力減退的原因不排除是由某些含量很低且不能通過(guò) dsRNA提取檢測(cè)到的其他真菌病毒造成的，所以對(duì)于其他菌株致病力衰退的原因還有待進(jìn)一步研究，這些菌株可能為研究油菜菌核病菌致病機(jī)理提供材料。

已報(bào)道油菜菌核病菌中 dsRNA病毒的種類(lèi)多樣［16］，相同的dsRNA帶型不一定是相同的病毒，同一菌株中不同的 dsRNA條帶可能是不同的病毒混合侵染，而 ssRNA病毒在復(fù)制過(guò)程也能產(chǎn)生dsRNA中間體，可以通過(guò)提取dsRNA的方法提取出來(lái)，雖然筆者篩選的 dsRNA較單一，但目前還不能確定該菌株所含 dsRNA病毒的種類(lèi)和屬性，以及引起寄主低毒力的具體原因。對(duì)于該菌株內(nèi)病毒的基因組序列的獲得和研究具體病毒對(duì)寄主核盤(pán)菌的作用是下一步研究方向， 油菜菌核病菌弱毒現(xiàn)象機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Pathogenicity differentiation and hypovirulence of Sclerotinia sclerotiorum

Deng Xiaojun1，2，3，Li Guifang1，2，Wei Ying1，2，Pang Xidan1，2，Zhu Hongjian1，2，3*，Gao Bida1，2
（1.College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests， Changsha 410128， China； 3.Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract:One hundred and ninty-six Sclerotinia sclerotiorumstrains from Changde and Yiyang of Hunan province were isolated and purified. Virulence of these strains was measured by inoculating detached leaves. The results showed pathogenicity differentiation of these S. sclerotiorum strains from the two areas was apparent. Using CF cellulose， dsRNA extraction were conducted on 19 hypovirulent strains， dsRNA screening showed that dsRNA were extracted from 3 strains （CY019， CY080 and YY077）. CY019 has an abnormal phenotype with sparse hyphae and low production of sclerotia. A dsRNA-free strain CY019VF was obtained from CY019 using hypha tip isolation and showed the restored pathogenicity by in vivo inoculation in rape stem. These results indicate the attenuated virulence of strain CY019 could relate to its dsRNA.

Keywords:Sclerotinia sclerotiorum； pathogenicity； attenuated strains

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.654

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007?1032（2016）03?0317?05

收稿日期：2016–01–17 修回日期：2016–03–05

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201103016）；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2013M542114）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD15B04–1）

作者簡(jiǎn)介：鄧小軍（1989—），男，湖南衡陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事真菌病毒研究，704474718@qq.com；*通信作者，朱宏建，博士，副教授，主要從事分子植物病理學(xué)研究，hongjian62@163.com