萬華方， 陳松余， 冬夢(mèng)荃， 丁一娟，楊楠， 黃登文， 孫峻溟， 錢偉

西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 重慶 400715

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)屬子囊菌門(Ascomycota)、 核盤菌科(Sclerotiniaceae)、 核盤菌屬(Sclerotinia)真菌， 能夠廣泛侵染包括甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)在內(nèi)的400多種植物[1]. 甘藍(lán)型油菜是重要油料作物之一， 廣泛種植于中國(guó)、 加拿大及歐洲等溫帶地區(qū)[2-3]， 供給全世界約13%的植物油， 是全世界傳統(tǒng)食用油和能源用油的重要來源. 核盤菌侵染所致的菌核病可引起油菜減產(chǎn)10%～20%， 嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%[4]. 目前， 油菜菌核病的防控方法各有局限， 如化學(xué)防治不僅導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、 病菌的抗藥性增強(qiáng)、 生態(tài)環(huán)境惡化， 還可引起農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本增加[5-6]. 菌核在土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)， 且其寄主植物范圍廣， 作物輪作也很難對(duì)其實(shí)現(xiàn)有效控制[7]. 栽培油菜中缺乏抗病資源， 也制約其抗性育種進(jìn)程[8]. 近年來， 生物防治逐漸成為菌核病防控的新策略， 核盤菌的生防制劑研究也取得了一些進(jìn)展， 比如盾殼霉(Coniothyriumminitans)能抑制核盤菌子囊孢子對(duì)油菜葉片的侵染， 并減少其子實(shí)體的產(chǎn)生數(shù)量， 有效降低油菜菌核病的發(fā)病率[9-11]. 印度梨形孢(Piriformosporaindica)由Kost等[12]發(fā)現(xiàn)于印度沙漠地區(qū)灌木叢根部， 因其孢子類似梨形而得名. 印度梨形孢的共生不僅有利于植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[13-15]， 促進(jìn)植物生長(zhǎng)[16-18]， 還對(duì)部分病原真菌有抑制作用. 印度梨形孢能夠抑制大麥布氏白粉病菌(Blumeriagraminisf. sp. tritici)[19]、 小麥基腐病菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)[20]、 黃萎病菌(Verticilliumdahliae)[21]、 串珠鐮孢菌(Fusariumverticillioides)[22]以及灰霉病菌(Botrytiscinerea)[23]等， 可能是一種重要的植物病害生物防控資源. 灰霉病菌與核盤菌屬真菌近緣， 尤其與核盤菌親緣關(guān)系較近[24]. 基于印度梨形孢可以有效抑制灰霉菌， 我們推測(cè)其可能也是核盤菌生物防治的潛在資源. 為此， 本研究對(duì)核盤菌與印度梨形孢進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)， 探究印度梨形孢對(duì)核盤菌的體外抑制作用， 并分析對(duì)峙培養(yǎng)過程中核盤菌生長(zhǎng)發(fā)育、 逆境脅迫響應(yīng)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平， 解析其抑制作用機(jī)理， 為利用印度梨形孢對(duì)菌核病進(jìn)行生物防治提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019-2020年在重慶市油菜工程技術(shù)研究中心進(jìn)行.

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

核盤菌“1980”由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心保存， 參考Mei等[25]的方法進(jìn)行活化與繼代培養(yǎng). 印度梨形孢“DSM 11872”由長(zhǎng)江大學(xué)張文英教授惠贈(zèng)， 其培養(yǎng)參照J(rèn)ohnson等[26]的方法進(jìn)行. 大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)為DH5α菌株.

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

聚乙二醇(PEG-4000)， 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar， PDA)， 馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(Potato Dextrose Broth， PDB)等均購(gòu)自北京酷來搏科技有限公司(Coolaber). 參照J(rèn)ohnson等[26]的方法配制改良PNM(modified PNM)培養(yǎng)基.

1.2 方法

1.2.1pEF-OGFP載體構(gòu)建與核盤菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

本研究用特異引物(表1)擴(kuò)增密碼子優(yōu)化的GFP(OGFP)基因序列[27]， 并將擴(kuò)增產(chǎn)物OGFP片段融合于核盤菌EF-1a基因(SS1G_07595)啟動(dòng)子下游， 獲得pEF-OGFP過表達(dá)載體(圖1a). 參考Rollins[28]的方法進(jìn)行原生質(zhì)體制備及PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化， 將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至核盤菌“1980”基因組. 利用潮霉素篩選轉(zhuǎn)化子， 并在波長(zhǎng)488 nm下觀察轉(zhuǎn)基因核盤菌的原生質(zhì)體和菌絲， 篩選“1980-GFP”菌株， 用于后續(xù)試驗(yàn).

1.2.2 核盤菌與印度梨形孢對(duì)峙培養(yǎng)

參照張斌等[29]的方法， 進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng). 具體步驟： 用無菌打孔器(直徑6 mm)取印度梨形孢菌落邊緣菌絲塊， 置于直徑90 mm的PDA平板上， 距平板邊緣的1/8直徑處. 待印度梨形孢菌落生長(zhǎng)至平板2/3直徑時(shí)， 使用相同的方法取“1980-GFP”核盤菌的菌絲塊置于平板的另一側(cè)， 以未放置印度梨形孢的平板為對(duì)照. 放置核盤菌后， 每隔12 h拍照并測(cè)量菌絲塊中心至菌落邊緣的距離(cm)， 以評(píng)價(jià)菌絲的生長(zhǎng)速度. 利用熒光體視顯微鏡觀察兩菌菌落的接觸部分， 并評(píng)價(jià)菌絲的形態(tài)特征. 分別于對(duì)峙培養(yǎng)后24 h， 48 h， 72 h及96 h取菌絲， 立即置于液氮中保存， 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析， 3次重復(fù). 對(duì)峙培養(yǎng)7 d 后收集菌核， 統(tǒng)計(jì)菌核數(shù)量及其干質(zhì)量(g).

印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)核盤菌試驗(yàn)參考王慧俐[30]的方法進(jìn)行， 略有改動(dòng). 在無菌條件下， 用無菌打孔器(6 mm)取5塊印度梨形孢菌絲塊置于PDB培養(yǎng)液中， 于28 ℃， 200 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng). 培養(yǎng)4 d 后， 過濾并收集發(fā)酵培養(yǎng)液用于核盤菌培養(yǎng)， 以PDB， 1/2 PDB培養(yǎng)液培養(yǎng)核盤菌為對(duì)照. 22 ℃， 200 r/min培養(yǎng)4 d后， 比較各處理中核盤菌菌絲球的干質(zhì)量(g)， 3次重復(fù).

1.2.3 總RNA提取及總cDNA第一鏈合成

用試劑盒Ultrapure RNA Kit(DNase I)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行總RNA提取與純化； 用試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄.

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)基因的編碼序列， 用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物(表1). 反應(yīng)體系： 1 μL cDNA(100 ng/μL)， SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL， 正向及反向引物各0.5 μL， RNase-free H2O 8 μL. 用CFX96TM real-time PCR 儀(Bio-Rad)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè). 反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性30 s， 95 ℃變性5 s， 60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸20 s， 40個(gè)循環(huán). 每個(gè)樣本重復(fù)3次. 以核盤菌SsTubulin基因作為內(nèi)參， 按照2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[31].

表1 載體構(gòu)建及實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2016和SAS 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 應(yīng)用t測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因核盤菌菌株“1980-GFP”的獲得

為更清晰地觀察對(duì)峙培養(yǎng)下核盤菌的生長(zhǎng)情況， 本研究構(gòu)建了綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因核盤菌菌株. 利用PEG轉(zhuǎn)化法， 將密碼子優(yōu)化后的pEF-OGFP載體(圖1a)轉(zhuǎn)入核盤菌菌株“1980”的原生質(zhì)體中， 經(jīng)復(fù)壁培養(yǎng)和潮霉素抗性篩選， 共獲得26個(gè)轉(zhuǎn)化子. 用激光掃描共聚焦顯微鏡和熒光體視顯微鏡觀察原生質(zhì)體和菌絲(圖1b， 1c)， 篩選出綠色熒光信號(hào)最強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子， 其菌落生長(zhǎng)、 菌絲形態(tài)以及菌核形成均與野生型一致， 用于進(jìn)行后續(xù)研究.

箭頭所指為原生質(zhì)體； 原生質(zhì)體由激光掃描共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 900)拍攝， 菌絲由熒光體視顯微鏡(OLYMPUS MVX 10)拍攝.圖1 綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因核盤菌菌株“1980-GFP”

2.2 印度梨形孢(P.i)對(duì)核盤菌(S.s)的抑制作用

印度梨形孢與核盤菌菌落接觸后， 后者的生長(zhǎng)受到顯著抑制(圖2a). 在36 h時(shí)， 其生長(zhǎng)半徑顯著降低(p<0.05). 此后， 處理組的菌落延伸半徑降低了36.43%～53.56%， 生長(zhǎng)速度降低了84.76%(圖2b)， 并產(chǎn)生了抑菌帶(圖2a紅色方框). 抑菌帶處核盤菌菌絲發(fā)育異常， 其前端出現(xiàn)短而多的分叉， 且呈彎曲生長(zhǎng)， GFP信號(hào)也減弱(圖2c). 培養(yǎng)7 d后， 對(duì)峙培養(yǎng)中的核盤菌菌核數(shù)量比對(duì)照降低了73.38%(圖3a)， 干質(zhì)量降低了64.16%(圖3b). 印度梨形孢在PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)致密， 其菌絲可能會(huì)占據(jù)核盤菌的生長(zhǎng)空間， 進(jìn)而抑制核盤菌生長(zhǎng). 印度梨形孢在改良PNM培養(yǎng)基上形成的菌落稀疏， 并不會(huì)造成核盤菌生長(zhǎng)空間受阻(圖4). 為此， 本研究又在改良PNM培養(yǎng)基上進(jìn)行印度梨形孢與核盤菌的對(duì)峙培養(yǎng)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)核盤菌菌落生長(zhǎng)仍然受到抑制(圖4)， 進(jìn)一步表明印度梨形孢對(duì)核盤菌的抑制作用不僅僅源于生長(zhǎng)空間競(jìng)爭(zhēng).

a圖中對(duì)照組(S.s)僅在平板左側(cè)接種核盤菌“1980-GFP”； 處理組(S.s/P.i)平板左側(cè)接種核盤菌“1980-GFP”， 右側(cè)接種印度梨形孢. c圖中對(duì)照組(S.s)為正常生長(zhǎng)的核盤菌“1980-GFP”菌絲形態(tài)及熒光信號(hào)； 處理組(S.s/P.i)為對(duì)峙培養(yǎng)48 h時(shí)抑菌帶部位核盤菌“1980-GFP”菌絲形態(tài)及熒光信號(hào).圖2 PDA平板上印度梨形孢對(duì)核盤菌的抑制

核盤菌菌絲塊在液體培養(yǎng)基中會(huì)形成菌絲球. 利用不同的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)核盤菌時(shí)， 我們發(fā)現(xiàn)其菌絲球在PDB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最旺盛， 在1/2 PDB培養(yǎng)液中次之， 但均比在印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液中的旺盛(圖5a). 將各處理的菌絲球烘干稱量， 發(fā)現(xiàn)在印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液中的核盤菌菌體干質(zhì)量較PDB和1/2PDB培養(yǎng)液中均顯著降低(p<0.05)， 降低量分別為52.01%和25.52%(圖5b).

2.3 印度梨形孢對(duì)核盤菌生長(zhǎng)發(fā)育與逆境響應(yīng)關(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響

為研究對(duì)峙培養(yǎng)下印度梨形孢對(duì)核盤菌抑制的機(jī)理， 我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了與核盤菌菌落生長(zhǎng)、 菌核形成及逆境響應(yīng)相關(guān)基因Sssod1，Sssmk1，Ssshk1及SsITL的相對(duì)表達(dá)水平.

小寫字母不同表示p<0.05， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.圖3 PDA平板上印度梨形孢對(duì)核盤菌菌核發(fā)育的抑制

圖4 改良PNM平板上印度梨形孢對(duì)核盤菌的抑制

Sssod1與核盤菌菌核萌發(fā)以及抗逆反應(yīng)密切相關(guān)[32]. 在對(duì)峙培養(yǎng)早期，Sssod1顯著上調(diào)(p<0.05)， 并于72 h達(dá)最高表達(dá)量， 上調(diào)量為對(duì)照的2.78倍， 隨后表達(dá)量迅速降低， 96 h時(shí)下調(diào)了94.53%(圖6a). 結(jié)果表明， 印度梨形孢會(huì)誘導(dǎo)核盤菌的早期防御反應(yīng)， 在后期則會(huì)影響核盤菌菌核發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)， 印證了對(duì)峙培養(yǎng)對(duì)核盤菌菌核數(shù)量和質(zhì)量的抑制作用.

Sssmk1是核盤菌中信號(hào)傳遞的關(guān)鍵基因， 同時(shí)與核盤菌菌落延伸、 菌核發(fā)育相關(guān)[33]. 在對(duì)峙培養(yǎng)前期，Ssmk1表達(dá)量顯著上調(diào)(p<0.05)， 48 h時(shí)上調(diào)3.89倍， 后期恢復(fù)正常表達(dá)水平(圖6b). 結(jié)果表明， 印度梨形孢影響了核盤菌的早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑， 激活了核盤菌逆境脅迫反應(yīng)， 并有可能加速了菌核的形成.

SsITL基因編碼核盤菌的一個(gè)毒性分泌蛋白， 對(duì)菌株的致病力、 菌絲生長(zhǎng)、 菌核形成具有多效性[34]. 本試驗(yàn)中SsITL的表達(dá)與Sssod1極為類似， 在對(duì)峙培養(yǎng)24～72 h內(nèi)相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(p<0.05). 上調(diào)量達(dá)2.94～4.71倍(圖6c). 印度梨形孢與核盤菌對(duì)峙培養(yǎng)過程中核盤菌菌落延伸受阻可能是該基因前期上調(diào)表達(dá)的原因之一， 而后期該基因表達(dá)受到抑制則可能影響了核盤菌菌核的形成.

Ssshk1是一種組氨酸激酶， 與核盤菌菌絲形態(tài)、 菌落延伸以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)力有關(guān)[35]. 在對(duì)峙培養(yǎng)初期，Ssshk1的表達(dá)水平與對(duì)照持平， 中后期顯著下調(diào)(p<0.05)， 下調(diào)量為20.81%～28.55%(圖6d). 結(jié)果表明， 對(duì)峙培養(yǎng)過程中， 印度梨形孢抑制了核盤菌Ssshk1基因的表達(dá)， 可能導(dǎo)致了核盤菌菌絲形態(tài)異常， 并在一定程度上影響了核盤菌對(duì)外界刺激的反應(yīng).

小寫字母不同表示p<0.05， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.圖6 對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)印度梨形孢對(duì)核盤菌生長(zhǎng)發(fā)育及逆境響應(yīng)關(guān)鍵基因表達(dá)模式的影響

3 討論

對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)， 核盤菌與印度梨形孢接觸部分產(chǎn)生了抑菌帶， 此后菌落延伸速度大幅下降， 并在兩菌接觸邊界形成氣生菌絲， 這與盾殼霉與核盤菌對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)的現(xiàn)象類似[36]. 印度梨形孢與部分其他病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果也與本研究類似. 印度梨形孢能夠抑制灰霉病菌的生長(zhǎng)[23]； 當(dāng)在平板上優(yōu)先培養(yǎng)印度梨形孢時(shí)能夠抑制鏈格孢菌的生長(zhǎng)[30]； Ghahfarokihi等[37]用印度梨形孢與小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar. tritici)對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)， 發(fā)現(xiàn)印度梨形孢與小麥全蝕病菌之間也會(huì)形成抑菌帶， 并且印度梨形孢會(huì)抑制小麥全蝕病菌菌絲的生長(zhǎng)； 印度梨形孢與黃萎病菌對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)， 發(fā)現(xiàn)其對(duì)黃萎病菌有直接的拮抗作用[21]. Moharam等[38]發(fā)現(xiàn)， 平板對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)， 印度梨形孢并未對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)產(chǎn)生明顯的拮抗作用， 但其發(fā)酵培養(yǎng)液卻能夠顯著抑制尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng). 印度梨形孢在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生種類繁多的次生代謝物， 包括分泌蛋白、 激素以及異羥肟酸(Hydroxamicacids)等[39-40]. 由異羥肟酸合成的衍生物N-甲酰羥胺BB-3497(N-formyl hydroxylamine BB-3497)是重要的抗菌劑， 能夠抑制部分病原真菌的生長(zhǎng)[41]； 環(huán)異羥肟酸(Cyclic hydroxamic acid)能夠增強(qiáng)植物對(duì)病原微生物的抗性[42]. 本研究收集了印度梨形孢的PDB培養(yǎng)液用以培養(yǎng)核盤菌， 發(fā)現(xiàn)在印度梨形孢培養(yǎng)液中的菌絲球大小和干質(zhì)量均顯著小于以PDB和1/2PDB培養(yǎng)液培養(yǎng)的核盤菌菌絲球， 表明印度梨形孢發(fā)酵培養(yǎng)液能抑制核盤菌的生長(zhǎng)， 但其具體抑制因子還有待進(jìn)一步分析鑒定.

Sssod1是核盤菌超氧化物歧化酶(SOD)家族的重要成員[31]， 而Sssmk1通過核盤菌中信號(hào)傳導(dǎo)， 影響核盤菌菌落延伸、 菌絲形態(tài)和菌核形成[32]， 二者均與核盤菌的防御反應(yīng)與菌核形成密切相關(guān). 本研究中Sssod1，Sssmk1在對(duì)峙培養(yǎng)前期表達(dá)均顯著上調(diào)， 表明對(duì)峙培養(yǎng)過程中， 印度梨形孢激活了核盤菌的防御反應(yīng).SsITL編碼核盤菌的一個(gè)毒性分泌蛋白， 并與核盤菌菌核發(fā)育密切相關(guān)， 在核盤菌侵染前期或生長(zhǎng)受阻后迅速上調(diào)[33]. 本研究對(duì)峙試驗(yàn)表明， 印度梨形孢阻礙了核盤菌的菌落延伸，SsITL在前期表達(dá)上調(diào)可能是與印度梨形孢接觸后菌落延伸受阻所致. 然而，Sssod1與SsITL在對(duì)峙培養(yǎng)96 h時(shí)表達(dá)卻受到抑制， 印度梨形孢可能在對(duì)峙培養(yǎng)后期抑制了部分與核盤菌菌核發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)， 對(duì)峙培養(yǎng)中核盤菌菌核數(shù)量和質(zhì)量均較少也印證了該結(jié)果. 核盤菌菌核是由菌絲緊密交織而成的休眠體， 能夠幫助核盤菌抵御外界不良環(huán)境， 利于核盤菌繁殖與繼代[43]， 因此， 印度梨形孢可能對(duì)核盤菌的繁殖以及抵御逆境的能力有抑制效果.Ssshk1調(diào)控核盤菌的應(yīng)激反應(yīng)， 沉默表達(dá)Ssshk1的核盤菌菌絲形態(tài)異常， 菌落延伸緩慢， 并失去了對(duì)殺菌劑以及對(duì)外界脅迫的敏感性[34]. 本研究中， 兩菌接觸后， 核盤菌基因Ssshk1的表達(dá)有所降低， 可能與對(duì)峙培養(yǎng)過程中核盤菌菌落延伸緩慢、 菌絲形態(tài)異常密切相關(guān). 對(duì)峙培養(yǎng)過程中， 核盤菌基因Sssod1，Sssmk1，Ssshk1及SsITL的表達(dá)模式分析表明， 印度梨形孢與核盤菌之間有著較為復(fù)雜的互作機(jī)制， 有待進(jìn)一步研究.

定殖了印度梨形孢的小麥對(duì)莖腐病的抗性顯著提高， 但對(duì)布氏白粉病菌的抗性并未提高[20]； 然而Molitor等[44]發(fā)現(xiàn)大麥在定殖印度梨形孢后， 引起與大麥系統(tǒng)抗性相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)， 調(diào)控大麥的抗氧化能力進(jìn)而提高其對(duì)白粉病的抗性. 定殖印度梨形孢后， 番茄植株的黃萎病嚴(yán)重程度降低了30%以上[45]. 本研究在體外證實(shí)了印度梨形孢對(duì)核盤菌有抑制作用， 后續(xù)將驗(yàn)證印度梨形孢定殖于油菜后是否能夠引起油菜菌核病抗性的改變， 并深入探討其相關(guān)機(jī)制.

4 結(jié)論

印度梨形孢對(duì)核盤菌有直接抑制作用， 能夠抑制核盤菌菌落延伸， 減少菌核數(shù)量與質(zhì)量， 并改變菌絲形態(tài)， 且能夠影響核盤菌防御反應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá).