汪建文，鄧春英，洪 江

(貴州科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

0 引言

羊肚菌(Morehellaspp.)是一類(lèi)稀有的腐生和菌根菌兼性真菌，屬于盤(pán)菌綱(Discomycetes)羊肚菌科(Morohellaceae)羊肚菌屬，具有較高的食用和藥用價(jià)值。在羊肚菌人工栽培技術(shù)中有幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：菌種、外援營(yíng)養(yǎng)袋、出菇管理。1982年，羅納德·奧維爾(Ronald D.Ower)開(kāi)展了羊肚菌人工控制下的栽培實(shí)驗(yàn)，采用不同營(yíng)養(yǎng)的層級(jí)基質(zhì)培養(yǎng)出菌核，并以菌核為種進(jìn)行栽培，培育出羊肚菌子實(shí)體[1-4]，從此，菌核的形態(tài)及其功能作用引起了廣泛關(guān)注。菌核被認(rèn)為是羊肚菌子實(shí)體形成過(guò)程中的關(guān)鍵要素[5]，但其中的外援營(yíng)養(yǎng)袋技術(shù)被忽視，文獻(xiàn)報(bào)道大部分重復(fù)Ower的實(shí)驗(yàn)很難成功[6-8]。隨著我國(guó)羊肚菌大田栽培的成功，突現(xiàn)出外援營(yíng)養(yǎng)袋的重要作用，但對(duì)菌核的作用仍然不明，存在諸多分歧，據(jù)報(bào)道除了極少數(shù)種類(lèi)的羊肚菌沒(méi)有菌核外，羊肚菌屬的大多數(shù)種類(lèi)都會(huì)產(chǎn)生菌核[9-10]，但是在野生條件下又很少能發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌核的存在[11]，因此，對(duì)于羊肚菌菌核作用如何，很有必要開(kāi)展進(jìn)一步的研究。本文通過(guò)采用Ower等人廣口瓶相近的方法對(duì)兩種羊肚菌進(jìn)行菌核人工培養(yǎng)，并以其中產(chǎn)生較大菌核的七妹羊肚菌核為種進(jìn)行栽培試驗(yàn)研究，探討羊肚菌菌核功能作用，以及和外援營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系，為羊肚菌的菌種繁育和生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料及方法

1.1 材料

分別采用六妹羊肚菌原種MS12和七妹羊肚菌原種C7(貴州綠鑫源農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司)，用不同培養(yǎng)基對(duì)兩種羊肚菌進(jìn)行菌核生成實(shí)驗(yàn)，并以產(chǎn)生的菌核為種，進(jìn)行羊肚菌栽培實(shí)驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

用原種菌絲或培養(yǎng)后的菌核為種進(jìn)行接種；接種廣口瓶放置在陰暗室內(nèi)培養(yǎng)菌核，濕度60%～80%，溫度在12～15 ℃。

(1)以麥粒和玉米粒為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)，用廣口瓶法產(chǎn)生菌核，廣口瓶容積為480 mL，以觀(guān)察不同培養(yǎng)料對(duì)菌核形成的影響。

(2)以麥粒為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)，廣口瓶容積為480 mL，培養(yǎng)基質(zhì)分別占到40%、60%、80%，其余土壤分別占到60%、40%、20%，用廣口瓶法形成菌核，對(duì)比不同富營(yíng)養(yǎng)物占比對(duì)菌核形成的影響。

(3)以麥粒為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)和土壤50%∶50%均勻混合，用容積240 mL和480 mL的廣口瓶形成菌核，以觀(guān)察菌核產(chǎn)量及容器大小對(duì)菌核形成的影響。

(4)以方法(3)中產(chǎn)生的菌核為菌種，于第1年12月初，種植于30 cm×40.5 cm×7 cm的框中，菌核覆土深2 cm左右，pH7～8，土壤含水量在40%左右，氣溫12～16 ℃，置于室外，空氣濕度保持在80%～90%。分別進(jìn)行了以麥粒為主要原料的營(yíng)養(yǎng)袋栽培方式和只用菌核而無(wú)營(yíng)養(yǎng)袋的栽培方式的出菇對(duì)比試驗(yàn)。

2 結(jié)果

在菌核培養(yǎng)過(guò)程中，玻璃罐接種后菌絲生長(zhǎng)迅速，在15 ℃左右的溫度下7～8 d長(zhǎng)滿(mǎn)接種罐，在11～12 d時(shí)從罐子上部開(kāi)始生成菌核。發(fā)現(xiàn)以麥粒和玉米粒為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)相比，麥粒營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)能產(chǎn)生更多的菌核(圖1)。

在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)與土壤分層培養(yǎng)的情況下，菌核主要是在土壤層中形成，菌核密度相近，培養(yǎng)基質(zhì)與土壤占到40%∶60%的方式中能得到更多的菌核(圖2)；而用麥粒為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)和土壤以50%∶50%均勻混合的不分層方式，整個(gè)接種罐中都產(chǎn)生菌核、菌核與土壤相結(jié)合，總量最多(圖3)；以不同容積的罐子產(chǎn)生菌核的時(shí)間有差別，容積為240 mL的產(chǎn)生菌核的時(shí)間更早(圖4)。

圖2 不同比例營(yíng)養(yǎng)物產(chǎn)生的菌核Fig.2 Sclerotia produced by different proportions of nutrients

圖3 50%土壤與50%營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合比例所產(chǎn)生的菌核Fig.3 Sclerotia produced by the mixture of 50%soil and 50% nutrients

圖4 不同容積的培養(yǎng)瓶產(chǎn)生的菌核Fig.4 Sclerotia produced by culture bottles with different volumes

兩種菌株都極易產(chǎn)生菌核，C7(七妹羊肚菌)形成較大的菌核，塊狀，形狀不規(guī)則，與土壤結(jié)合，直徑可達(dá)2～4 cm；C12/MS(六妹羊肚菌)形成較小的菌核，直徑在0.5 cm左右，數(shù)量多，分布均勻(圖5)。

圖5 兩種羊肚菌產(chǎn)生的菌核Fig.5 Sclerotia produced by two Morchella species

在土壤中栽培菌核前，在水中浸泡12～24 h，菌核吸水性不強(qiáng)，重量幾乎不變，浸泡后或沒(méi)有浸泡的菌核在濕潤(rùn)的空氣中或埋于土壤中都很容易萌發(fā)，1～2 d就可長(zhǎng)出菌絲。1 ℃下放置于冰箱中，1個(gè)月后取出，同樣在濕潤(rùn)的空氣中或埋于土壤中都很容易萌發(fā)。

選擇產(chǎn)生較大菌核的C7(七妹羊肚菌)的菌核作為菌種加上外援營(yíng)養(yǎng)袋進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，成功培養(yǎng)了子實(shí)體(圖6)，生長(zhǎng)過(guò)程與麥粒種生長(zhǎng)過(guò)程相似。第1年12月上旬，菌核種植于30 cm×40.5 cm×7 cm的框中，菌核用量在300 mL左右，菌核覆土2 cm，菌核易萌發(fā)，5～7 d菌絲長(zhǎng)出地面，在土壤表層放置以麥粒為主要原料的營(yíng)養(yǎng)袋，外援營(yíng)養(yǎng)袋的土壤層中以及與罐體接觸的種植土壤中易形成菌核，隨后土壤表面產(chǎn)生分生孢子，在土壤表層菌絲變黃后，去除營(yíng)養(yǎng)袋，澆出菇水，第2年的2月初出現(xiàn)原基，之后溫度保持在10～16 ℃，濕度在80%～90%，3月中旬出菇。

圖6 七妹羊肚菌菌核盆栽后產(chǎn)生子實(shí)體Fig.6 Fruiting bodies of Morchella septimelata by pot culture

同時(shí)進(jìn)行了只用菌核而不使用營(yíng)養(yǎng)袋栽培方式的對(duì)比試驗(yàn)，菌核用量在600 mL左右。在菌核定植于土壤1周后(Ower專(zhuān)利的方法)，以及在土壤表層出現(xiàn)分生孢子及菌絲變黃后，澆出菇水，均未出現(xiàn)原基。

3 討論

3.1 菌核的形成

真菌菌核有“真菌核”和“菌核樣結(jié)構(gòu)”之分，“真菌核”通常由外向內(nèi)依次是外皮層、皮質(zhì)層和髓質(zhì)層，而“菌核樣結(jié)構(gòu)”的假菌核，是由密集未分化的菌絲組成，包括一些菌絲結(jié)構(gòu)將土壤或樹(shù)枝結(jié)合在一起，與根莖和落葉之間形成粘連，有許多真菌還將部分基質(zhì)封閉在著色的厚壁細(xì)胞層內(nèi)[12]。菌核通常在菌絲被切斷、撕裂、緊貼著培養(yǎng)容器的邊緣生長(zhǎng)或與各種化學(xué)屏障(包括變質(zhì)產(chǎn)物或特定形態(tài)發(fā)生物質(zhì))接觸時(shí)引起，或在與其他微生物，揮發(fā)性或可擴(kuò)散的化學(xué)物質(zhì)的相互作用也可能引起菌核的發(fā)生[13]。

羊肚菌菌核被認(rèn)為是未分化的假菌核。在人工設(shè)定的玻璃罐環(huán)境中培養(yǎng)菌核，形成了屏障作用，通常在延罐的邊緣上生長(zhǎng)更多的菌核，在小石子的周?chē)渤０l(fā)現(xiàn)菌核的生成，這些物理屏障的地方促使了菌核的生成。

在采用玻璃罐方式培養(yǎng)菌核，形成屏障作用的同時(shí)，也營(yíng)造缺氧的環(huán)境，可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)了菌核的形成。何培新等研究[14]，氧化應(yīng)激反應(yīng)也可能是誘導(dǎo)羊肚菌菌核發(fā)生的重要原因，氧化應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)多種真菌菌核分化，通過(guò)形成菌核規(guī)避氧氣，阻止超氧化狀態(tài)的發(fā)展，避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生更大的損傷，代謝中的多酚氧化酶也起著作用，使碳水化合物或菌絲表面的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，通過(guò)單個(gè)菌絲的交聯(lián)將它們結(jié)合在一起，從而使小的菌絲聚集發(fā)展而成為菌核。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，由于種的不同，C7(七妹羊肚菌)形成較大的菌核，形狀不規(guī)則，塊狀，與土壤結(jié)合，直徑可達(dá)2～4 cm；MS12(六妹羊肚菌)形成較小的菌核，直徑在0.5 cm左右。兩個(gè)種的菌核均很容易形成，并與土壤結(jié)合在一起，土壤中的無(wú)機(jī)鹽可能促進(jìn)了菌核的形成，任愛(ài)梅等在研究不同培養(yǎng)基對(duì)菌核形成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)[15]，培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高會(huì)使細(xì)胞外壓升高，對(duì)細(xì)胞造成一定的影響，這可能是刺激菌核形成的條件之一。在保證菌絲正常生長(zhǎng)的情況下，培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)機(jī)鹽濃度越高越利于菌核的形成。

以麥粒為主的基質(zhì)比玉米粒為主的基質(zhì)有更好的生長(zhǎng)，并有更多的菌核生成，這可能是以玉米為主要原料的基質(zhì)的玉米是玉米粗粒，在蒸過(guò)后，由于糖分的作用，很容易粘聯(lián)在一起，影響透氣性，從而影響了菌絲生長(zhǎng)和菌核的形成。

層級(jí)的方式形成了營(yíng)養(yǎng)梯度，營(yíng)養(yǎng)菌絲體和構(gòu)成營(yíng)養(yǎng)庫(kù)的菌核原基之間膨脹梯度的變化，導(dǎo)致有機(jī)碳水化合物的流動(dòng)，也可能是引發(fā)菌核發(fā)生的原因之一[16]，在層級(jí)培養(yǎng)方式中，土壤層相當(dāng)于是貧側(cè)營(yíng)養(yǎng)層，與富營(yíng)養(yǎng)層形成營(yíng)養(yǎng)梯度。Amir等人在1994年確定了羊肚菌菌核形成的兩個(gè)基本條件，即菌絲頂端生長(zhǎng)所需的高膨脹勢(shì)和能量代謝產(chǎn)生的膨脹勢(shì)；在對(duì)分離平板中羊肚菌菌核形成的研究中，接種于貧側(cè)營(yíng)養(yǎng)基的接種物向富側(cè)營(yíng)養(yǎng)基生長(zhǎng)，最終主要在貧側(cè)產(chǎn)生菌核，在此過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物傳輸方向發(fā)生了變化，即在菌落延伸過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)傳輸朝著菌絲體的菌絲尖端，當(dāng)菌絲體到達(dá)平板邊緣時(shí)，由于菌核的形成，轉(zhuǎn)運(yùn)速度遠(yuǎn)大于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，菌核形成了庫(kù)的作用。

在以層級(jí)方式的罐中產(chǎn)生的菌核，并非營(yíng)養(yǎng)物越多就產(chǎn)生越多的菌核，我們觀(guān)察到在40%的營(yíng)養(yǎng)物時(shí)能產(chǎn)生更多的菌核，營(yíng)養(yǎng)物太多，促進(jìn)了菌絲生長(zhǎng)，也許在40%的營(yíng)養(yǎng)物中已足夠產(chǎn)生菌核的營(yíng)養(yǎng)供給。而在運(yùn)用營(yíng)養(yǎng)物與土壤50%比例混合時(shí)更易產(chǎn)生菌核，這也許是創(chuàng)造了更多的微小的層級(jí)方式。

3.2 菌核的功能和作用

在菌核科成員菌核發(fā)育過(guò)程中，菌核中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞質(zhì)儲(chǔ)備是糖原、蛋白質(zhì)、多聚磷酸鹽和脂類(lèi)，大量的內(nèi)源儲(chǔ)備積累起來(lái)，這些儲(chǔ)備連同壁和菌絲間的物質(zhì)一起，被用來(lái)維持菌核在存活期間的生長(zhǎng)消耗，并最終在萌發(fā)過(guò)程中被利用。劉偉等對(duì)梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)開(kāi)展了從營(yíng)養(yǎng)菌絲體階段(VM)、初始菌核階段(IS)和成熟菌核階段(MS)的完整和全面的轉(zhuǎn)錄組研究，檢測(cè)到通過(guò)基因表達(dá)聚類(lèi)鑒定的差異表達(dá)基因(DEGs)主要涉及能量代謝，而碳水化合物的分解代謝主要發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)菌絲階段，富含能量的物質(zhì)的合成代謝是梯棱羊肚菌菌絲生長(zhǎng)和菌核形態(tài)發(fā)生的主要事件[17]。2018年，何培新等通過(guò)透射電鏡觀(guān)察到菌絲和菌核細(xì)胞中有大量的脂滴，其數(shù)量在菌核細(xì)胞中多于營(yíng)養(yǎng)菌絲并證明羊肚菌菌絲和菌核中富含能量的物質(zhì)是脂類(lèi)物質(zhì)，脂的積累從菌核形成的第3個(gè)階段逐漸升高[18]。

我們運(yùn)用Ower的近似方法產(chǎn)生菌核，利用菌核作菌種，采用外援營(yíng)養(yǎng)袋的方法，成功培育出子實(shí)體，說(shuō)明菌核作為菌種，經(jīng)覆土，作為一種改良的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，以菌核自身的營(yíng)養(yǎng)作養(yǎng)分萌發(fā)營(yíng)養(yǎng)菌絲，通常1個(gè)星期會(huì)長(zhǎng)出土壤層，這時(shí)土壤中的養(yǎng)分不足(若沒(méi)有外援營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)緩慢，菌絲稀疏)，需添加外援營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供菌絲生長(zhǎng)，菌絲長(zhǎng)入外援營(yíng)養(yǎng)袋中，通過(guò)菌絲的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，把營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸?shù)酵寥缹拥木z中，在羊肚菌本身的遺傳性和外界條件下達(dá)到生殖生長(zhǎng)，出現(xiàn)子實(shí)體原基，在適宜的生長(zhǎng)條件下長(zhǎng)成子實(shí)體。

但只運(yùn)用菌核作菌種按Ower專(zhuān)利的方法卻沒(méi)有成功，菌核萌發(fā)了菌絲，通過(guò)催菇方法如澆水沒(méi)有觸發(fā)生殖生長(zhǎng)，這也從反面體現(xiàn)出了外援營(yíng)養(yǎng)的作用，或許是外部條件沒(méi)有掌握，或是菌核量不夠，特別是還沒(méi)有認(rèn)識(shí)到羊肚菌菌核脂類(lèi)積累物的利用機(jī)制，因此還有待進(jìn)一步對(duì)菌核萌發(fā)后營(yíng)養(yǎng)利用問(wèn)題以及在菌絲轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)中的作用和環(huán)境條件進(jìn)行深入研究。