董永強，李元慧，田果廷，郝加敏，王艷瓊，王 鵬，劉慶洪**

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜系，北京 100094；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650221）

羊肚菌（Morchella esculenta）隸屬于子囊菌門（Ascomycota），是一種世界公認(rèn)的名貴野生食（藥）用菌，常發(fā)生于春末夏初[1]。由于其生活史過程與營養(yǎng)特征復(fù)雜[1-5]，羊肚菌菌絲需在適宜的水分和溫度條件下，菌核才能萌發(fā)形成子實體[6]。

早在1904年Molliard首次報道了羊肚菌的生活史中有菌核的存在，但是當(dāng)時并未意識到菌核在羊肚菌生活史中的重要性[7]。直到Ower在特殊培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌核，并用菌核誘導(dǎo)出子實體，才首次正確認(rèn)識到菌核在羊肚菌生活史中的重要意義[8]。Buscot認(rèn)為，羊肚菌在人工培養(yǎng)條件下能產(chǎn)生2種菌核：一種形成時間較早并分布在培養(yǎng)基邊緣，稱為簇集菌核；另一種形成時間較晚并分散分布在培養(yǎng)基中，稱為分散菌核[4]。本次試驗中，除了出現(xiàn)此二種菌核以外，還存在一種簇集在培養(yǎng)皿中心、即接種點周圍的菌核分布形式。

鑒于羊肚菌菌絲發(fā)育及菌核形成條件在生產(chǎn)中的重要性，本試驗對此進(jìn)行了初步的探討，以期對羊肚菌的生產(chǎn)提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

羊肚菌菌株來自于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用及食用真菌研究室。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺（YT-CJ-1D），北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HT-400B），上海赫田科學(xué)儀器有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蔗糖、（NH4）2SO4、 NH4Cl、 KNO3、 NH4HCO3、 KH2PO4、 甘氨酸、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖和乳糖等均為分析純，購自國藥集團(tuán)；蛋白胨、淀粉和酵母提取物購自國藥集團(tuán)。

1.3 培養(yǎng)基處理

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其中添加不同的添加物，添加物不考慮PDA培養(yǎng)基原有成分。各種碳源添加物的濃度為10 g·L-1，分別是葡萄糖、α-乳糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、淀粉。各種氮源添加物的濃度為 250 mg·L-1，分別是甘氨酸、NH4Cl、NH4HCO3、（NH4）2SO4、KNO3。添加物酵母提取物、蛋白胨的濃度為10 g·L-1。添加物KH2PO4，其濃度分別為 250 mg·L-1、500 mg·L-1、750 mg·L-1、1 g·L-1、2 g·L-1、5 g·L-1。以不添加任何其他物質(zhì)的 PDA 培養(yǎng)基作為對照。

1.4 接種培養(yǎng)

在火焰旁使用打孔器在培養(yǎng)基上均勻戳孔，扎孔要完全穿透培養(yǎng)基。再使用火焰灼燒并冷卻的鑷子夾取圓柱形培養(yǎng)基塊置于新配制的培養(yǎng)基中央，讓其菌絲生長面接觸培養(yǎng)基。最后培養(yǎng)皿使用封口膜封口，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)，以防止接種的培養(yǎng)基塊掉落。

放置1 d～2 d后即可明顯看到菌絲生長至新的培養(yǎng)基上，即可將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)，直至菌核出現(xiàn)，且沒有再生長的趨勢，即可觀察記錄對比每組的生長情況，比較菌核長勢。

2 結(jié)果分析

2.1 KH2PO4不同添加量對菌核形成的影響

KH2PO4不同添加量對菌核形成的影響見圖1。

圖1 KH2PO4不同添加濃度培養(yǎng)基上的羊肚菌菌核特征Fig.1 Chracteristics of Morchella esculenta sclerotia on medium of different concentrations of KH2PO4

由圖1可見，KH2PO4添加量為1 g·L-1的培養(yǎng)條件，菌核為簇集菌核，但不分布在培養(yǎng)基邊緣，集中于培養(yǎng)基中央，產(chǎn)生量相對要高，與其他培養(yǎng)條件比較，菌核生長量和密度明顯增加。KH2PO4濃度為 250 mg·L-1、500 mg·L-1和為 750 mg·L-1時的菌核數(shù)量較少，屬分散菌核形態(tài)，且菌核在培養(yǎng)基表面分散存在。KH2PO4濃度為2 g·L-1時，菌核數(shù)量下降，且相對不集中于培養(yǎng)基的中心位置。

2.2 不同碳源對菌核形成的影響

不同碳源對菌核形成的影響見圖2。

圖2 不同碳源對于羊肚菌菌核形成的影響Fig.2 Effects of different carbohydrates on Morchella esculenta sclerotia

由圖2可見，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖作為添加碳源，菌核均呈現(xiàn)為中央簇集菌核，菌核個體較大，但數(shù)量未見明顯增加。乳糖和淀粉作為碳源，菌核成分散菌核，產(chǎn)生量最大。結(jié)果顯示，羊肚菌菌核形成與碳素營養(yǎng)的關(guān)系密切，碳水化合物的結(jié)構(gòu)對菌核形成有一定的促進(jìn)作用。

2.3 不同氮源對羊肚菌菌核形成的影響

添加不同氮源對羊肚菌菌核形成的影響情況見圖3。

圖3 不同氮源對羊肚菌菌核形成的影響Fig.3 Effects of different nitrigen on Morchella esculenta sclerotia

由圖3可見，不同的氮素營養(yǎng)對羊肚菌菌核發(fā)生量有一定的限定關(guān)系。NH4HCO3、KNO3和甘氨酸對羊肚菌菌核形成均呈促進(jìn)作用。添加NH4HCO3為氮源可促進(jìn)羊肚菌中央簇集性菌核形成，KNO3和甘氨酸為氮源可促進(jìn)羊肚菌形成分散性菌核。有機大分子氮素營養(yǎng)蛋白胨和酵母提取物對羊肚菌菌核形成有一定的抑制作用，無機氮源NH4Cl和（NH4）2SO4對菌核形成具有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

碳素營養(yǎng)、氮素營養(yǎng)及無機化合物的添加種類，及相應(yīng)的添加量對羊肚菌菌核的形成有不同的影響，直接關(guān)系到羊肚菌生產(chǎn)的營養(yǎng)要求合理配比，以及相關(guān)營養(yǎng)袋的配方安排[9]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，碳素營養(yǎng)中的淀粉可有效促進(jìn)菌核形成，這可能與高分子碳素營養(yǎng)物質(zhì)釋放緩慢有關(guān)，羊肚菌菌核形成需要在適宜的碳素營養(yǎng)水平上進(jìn)行。乳糖作為碳素營養(yǎng)可促進(jìn)菌核的形成，而葡萄糖、麥芽糖和蔗糖對菌核生長的促進(jìn)效應(yīng)不明顯，可能與乳糖中存在結(jié)合型半乳糖有直接關(guān)系。

NH4HCO3、KNO3和甘氨酸等小分子氮素營養(yǎng)對菌核形成均有一定的促進(jìn)作用，但NH4Cl和（NH4）2SO4等小分子氮素營養(yǎng)對菌核形成有抑制作用，這可能與小分子氮素營養(yǎng)的解離與吸收方式差異有關(guān)，尤其表現(xiàn)在與弱酸（碳酸，H2CO3）結(jié)合的銨態(tài)氮釋放效率不同的現(xiàn)象有某種程度的相關(guān)性[10]。有機大分子氮素營養(yǎng)蛋白胨和酵母提取物對羊肚菌菌核形成有一定的抑制作用，可能與菌核形成需要氮素營養(yǎng)的快速供給有一定的聯(lián)系，而大分子氮素營養(yǎng)未能保證速效利用氮素營養(yǎng)的快速供應(yīng)。

不同濃度KH2PO4在羊肚菌菌核形成過程中，表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。低濃度時有一定的促進(jìn)菌核形成的作用，但只有到1 g·L-1時才呈現(xiàn)出最大的促進(jìn)效果。這在一定程度上反映出了KH2PO4對羊肚菌菌核形成有特定的濃度閾值。至于5 g·L-1KH2PO4不利于菌核的生長，可能緣于其濃度過高導(dǎo)致細(xì)胞外滲透壓過高，不利于羊肚菌生長。

綜上所述，不同營養(yǎng)因素對羊肚菌菌核形成有不同的影響，需要在栽培時特別注意相關(guān)營養(yǎng)因素的搭配與調(diào)節(jié)，才能更好地促進(jìn)羊肚菌的生長發(fā)育。