成　婧，付善良，丁　利，徐瑞麗，朱紹華，龔　強，王利兵

（湖南出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心/食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004）

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磁性固相萃取–液質(zhì)聯(lián)用測定環(huán)境水體中喹諾酮類抗生素

成婧，付善良，丁利，徐瑞麗，朱紹華，龔強，王利兵*

（湖南出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心/食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004）

摘 要：建立了一種聯(lián)合高效液相色譜–三重四級桿質(zhì)譜法檢測環(huán)境水體中15種喹諾酮類抗生素的方法。該方法以Fe3O4磁性石墨烯為固相萃取吸附劑，以喹諾酮類抗生素的回收率為檢測指標。對該方法中洗脫劑、萃取劑用量、萃取時間等主要參數(shù)進行優(yōu)化后得到的較優(yōu)試驗條件為：以10％氨水甲醇為洗脫劑，磁性石墨烯用量為30 mg，萃取吸附時間為30 min。在優(yōu)化條件下，15種喹諾酮類抗生素的檢出限為6.5 ～12.8 ng/L，在10～500 ng/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R為0.999 1～0.999 8）。利用該方法分別對自來水樣、養(yǎng)殖水樣以及醫(yī)療廢水樣進行分析測定，3種實際樣品的加標回收率為70.0％～90.7％，相對標準偏差均小于10％。

關(guān) 鍵 詞：喹諾酮類抗生素；環(huán)境水體；Fe3O4；磁性石墨烯；液相色譜–三重四級桿質(zhì)譜法；固相萃取

投稿網(wǎng)址：http://xb.ijournal.cn

養(yǎng)殖用水、飲用水源以及其他環(huán)境水體中抗生素的污染已備受關(guān)注［1–2］。以喹諾酮類藥物為代表的抗生素在臨床醫(yī)療中被濫用，可能使人體產(chǎn)生耐藥性，在動物養(yǎng)殖過程中不規(guī)范使用也會帶來動物源食品的質(zhì)量安全問題。這些藥物以原藥、糞便、尿液等各種形式進入環(huán)境水體后還會增加環(huán)境安全和生態(tài)健康的風(fēng)險［3–5］。

喹諾酮類藥物的檢測分析方法很多［6］，高效液相色譜法因其分離效率高，穩(wěn)定性好，在藥物質(zhì)量控制、血樣分析、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測等方面得到了廣泛應(yīng)用［7–9］。該方法與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用對于檢測復(fù)雜基質(zhì)中多種喹諾酮類抗生素具有明顯優(yōu)勢［10–13］。由于環(huán)境水體中喹諾酮類抗生素的含量一般較低，常需要用固相萃取柱對其進行富集和分離［8，14］。這些方法存在成本高、有機試劑污染大等缺陷。

作為一種新型碳納米材料，磁性石墨烯具有比表面大、吸附性能好、分離便利、環(huán)境友好等特點［15–19］。本研究中以Fe3O4磁性石墨烯作為固相萃取劑對喹諾酮類抗生素進行富集和分離，結(jié)合 HPLC–MS/MS技術(shù)對環(huán)境水體中15種喹諾酮類抗生素進行檢測分析，旨在為環(huán)境水體中喹諾酮類抗生素的分析提供簡便、靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Fe3O4磁性石墨烯（XF018，黑色粉末狀固體）購自南京先豐納米材料科技有限公司。

主要儀器：Agilent 1260–6490高效液相色譜–三重四級桿質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；ZHWY–200D多振幅高速軌道搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；PB203–N電子天平（上海梅特勒–托利多儀器有限公司）。

主要試劑：依諾沙星、麻保沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、丹諾沙星、洛美沙星、恩諾沙星、奧比沙星、沙拉沙星、司帕沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹等 15種標準品均購自Dr. S. Enernstorfer公司，純度均大于99.0％；丙酮、乙腈、甲醇為HPLC級，美國Tedia公司產(chǎn)品；乙酸、鹽酸、氨水為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；試驗用水為 Mili–Q 超級水系統(tǒng)（Milipore，美國）純化的純凈水。

1.2 標準溶液的配制及樣品前處理

將 15種喹諾酮類標準品用乙腈配制成 1.0 mg/mL的單標儲備液，4 ℃下避光保存。將單標儲備液用乙腈配制成試驗所需濃度的混標中間液。根據(jù)需要，用基質(zhì)空白溶液將混標中間液稀釋，配制成試驗所需濃度的混標工作液。

自來水樣直接取自筆者所在的實驗室；養(yǎng)殖水樣取自湘北某蟹類養(yǎng)殖基地的養(yǎng)殖水域；醫(yī)療廢水樣取自長沙市某三甲醫(yī)院附近的污水管道。水樣用棕色瓶放置于4 ℃冰箱中，過0.45 μm水相膜后直接使用。

取50 mL水樣于離心管中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，加入30 mg磁性石墨烯后蓋上蓋子，于搖床中振蕩吸附30 min，用磁鐵將磁性石墨烯吸至離心管底部側(cè)壁，取出水液。往離心管中再次加入1 mL 10％氨水甲醇溶液，蓋上蓋子漩渦提取1 min，用磁鐵重復(fù)以上操作，取出洗脫液于玻璃小管中。重復(fù)以上洗脫過程2次。合并洗脫液，用40 ℃氮氣吹干，準確加入1 mL 0.1％乙酸乙腈重新溶解，過0.45 μm濾膜后進樣分析。

1.3 液相色譜條件和質(zhì)譜條件

液相色譜柱為 Agilent Eclipse AAA柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流動相為0.1％乙酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫程序如下：0～3.5 min 85％A～45％A；3.5～6.5 min 45％A；6.5～7.5 min 45％A ～85％A；7.5～11.5 min 85％A。流速0.5 mL/min。柱溫40 ℃。進樣量10 μL。

離子源為電噴霧離子源（ESI）。正離子掃描模式。檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。霧化氣壓力（氮氣）20 Psi。干燥氣溫度320 ℃，流速14 L/min。鞘氣溫度300 ℃，流速11 L/min。毛細管電壓3 000 V。噴嘴電壓1 500 V。15種喹諾酮類抗生素的駐留時間均為10 ms，脆裂電壓均為380 V，加速電壓均為4 V，其定性/定量離子對、碰撞能量見表1。

表1　15種喹諾酮類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 LC–MS/MS parameters of 15 quinolone antibiotics

1.4 測定方法優(yōu)化

1.4.1 萃取條件的優(yōu)化

為了達到較佳的萃取富集效果，采用空白加標方法依次對洗脫劑種類及其用量、萃取劑用量、萃取時間等條件進行考察，重復(fù)3次，結(jié)果取3次的平均值。在優(yōu)化萃取條件的過程中，以喹諾酮類抗生素回收率來衡量磁性石墨烯顆粒的萃取效率。R=V0C0/VC，其中，R為哇諾酮類抗生素回收率（％）；V0為重新定容體積（mL）；C0為進樣濃度；V為待測水樣體積；C為待測濃度。

首先考察甲醇、乙腈、丙酮、氨水甲醇4種常用洗脫劑對磁性石墨烯上喹諾酮類抗生素的洗脫效果，然后在最佳洗脫條件下考察磁性石墨烯用量對喹諾酮類抗生素萃取效率的影響，最后確定磁性石墨烯對喹諾酮類抗生素吸附的較佳平衡時間。

1.4.2 方法確證

在已優(yōu)化的試驗條件下分別對質(zhì)量濃度 10、50、100、200、500 ng/L的諾酮類抗生素標準工作液進行測定，將目標分析物的峰面積和相應(yīng)的濃度進行線性回歸，考察其線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、最低檢出限、相對標準偏差等參數(shù)。

1.4.3 方法應(yīng)用

按照已建立的檢測方法分別測定自來水樣、養(yǎng)殖水樣和醫(yī)療廢水樣中的喹諾酮類抗生素的含量，同時對以上3種樣品以15、100 ng/L 的加標水平進行喹諾酮類抗生素質(zhì)量濃度測定。每個水平分別進行5次平行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性石墨烯顆粒的SEM表征

試驗中所用Fe3O4磁性石墨烯的電鏡掃描結(jié)果見圖1。由圖1–A可見，石墨烯的多層薄片結(jié)構(gòu)清晰，F(xiàn)e3O4在石墨烯表層附著均勻，即便是經(jīng)過較長時間的超聲或振蕩操作，F(xiàn)e3O4仍能在石墨烯薄片上緊密吸附。該顆粒在水中具有良好的分散性（圖1–B）；在外加磁場的作用下能很好地吸附在離心管或玻璃小瓶內(nèi)壁（圖1–C）。

圖1　Fe3O4磁性石墨烯的電鏡掃描結(jié)果（A）、在水中的分散性狀態(tài)（B）及其在磁場作用下的效果（C）Fig.1 SEM image of the Fe3O4MNP@G （A）， dispersible behavior photographs of Fe3O4MNP@G in water （B） and separation phenomenon in magnetic field （C）

2.2 洗脫條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 適宜洗脫劑的選取

由圖2可見，4種洗脫劑中，氨水甲醇的洗脫效果明顯比其他3種的好?？紤]到操作的可行性，選取10％的氨水甲醇為適宜洗脫劑。

圖2　不同洗脫劑下15種喹諾酮類抗生素的洗脫回收率Fig.2 Recovery of 15 quinolone antibiotics at different elution solution

2.2.2 適宜磁性石墨烯用量的確定

由圖3可見，在磁性石墨烯用量為10～30 mg時，所有喹諾酮類抗生素的回收率隨著萃取劑用量的增加而增加，當萃取劑用量多于30 mg后，目標分析物的回收率并無明顯增加，因此，選取30 mg作為磁性石墨烯的適宜用量。

圖3　不同萃取劑用量下15種喹諾酮類抗生素的回收率Fig.3 Recovery of 15 quinolone antibiotics at different dosage of Fe3O4MNP@G

2.2.3 適宜萃取時間的選取

如圖4所示，當平衡時間由5 min逐漸增加到30 min時，喹諾酮類抗生素的回收率達到最大，此時水樣中喹諾酮類抗生素的殘留量極少，目標待測物已經(jīng)基本被磁性石墨烯吸附完全，所以，認為適宜萃取時間為30 min。

圖4　不同萃取時間下15種喹諾酮類抗生素的回收率Fig.4 Recovery of 15 quinolone antibiotics at different extraction time

2.2.4 適宜水樣pH值的選取

用氫氧化鈉和鹽酸將水樣的pH值調(diào)為4.0，此時目標喹諾酮類抗生素的回收率均較高，所以，認為水樣pH值以4.0較為適宜。

2.3 方法確證

表2結(jié)果表明，除二氟沙星、依諾沙星的線性范圍為15～500 ng/L之外，其他喹諾酮類抗生素的線性范圍均為10～500 ng/L，15種喹諾酮類抗生素的檢出限為6.5～12.8 ng/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 8，相對標準偏差為1.9％～7.3％。15種喹諾酮類目標分析物的總離子流圖見圖5。

表2　15種喹諾酮類抗生素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法的檢出限和相對標準偏差（n=5）Table 2 Linear range， correlation coefficients， LOD and RSD for the 15 quinolone antibiotics（n=5）

圖5　15種喹諾酮類抗生素的離子對色譜圖Fig.5 Chromatogram of extracted ions from15 quinolone standards

2.4 方法應(yīng)用

自來水樣、養(yǎng)殖水樣及醫(yī)療廢水樣中喹諾酮類抗生素含量的測定結(jié)果及其15、100 ng/L共2個水平的加標檢測結(jié)果的平均回收率及精密度見表3。

表3　實際水樣中15種喹諾酮類抗生素的含量和添加回收率及精密度（n=5）Table 3 Detection results on concentration， fortified recovery and RSD of the 15 quinolone antibiotics in three type water samples（n=5）

由表3可知，在自來水樣中未檢出喹諾酮類藥物，在養(yǎng)殖水樣中檢出了環(huán)丙沙星（45.2 ng/L），在醫(yī)療廢水樣中檢出了氧氟沙星（115.4 ng/L）、環(huán)丙沙星（53.3 ng/L）、諾氟沙星（48.4 ng/L）。從加標回收結(jié)果來看，15種喹諾酮類抗生素的平均回收率為70.0％～90.7％，精密度為 1.9％～7.1％，說明該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。

3 結(jié)論與討論

采用聯(lián)合高效液相色譜–三重四級桿質(zhì)譜法同時測定環(huán)境水體中 15種喹諾酮類抗生素，水樣用磁性 Fe3O4石墨烯顆粒為固相萃取吸附劑直接萃取，再以10％氨水甲醇為洗脫劑洗脫。在優(yōu)化條件下15種喹諾酮類抗生素的檢出限為6.5 ～12.8 ng/L，在10 ～500 ng/L線性關(guān)系良好。該方法能夠用于對自來水樣、養(yǎng)殖水樣以及醫(yī)療廢水樣等實際樣品中多種喹諾酮類抗生素的含量進行測定，且操作簡便，環(huán)境友好，靈敏度高，可以為環(huán)境監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支撐。

環(huán)丙沙星是水產(chǎn)品養(yǎng)殖中已被批準使用的常用抗生素之一，已在蟹類養(yǎng)殖中得到應(yīng)用。由本試驗結(jié)果可知，在此類抗生素的應(yīng)用中，除了需要密切關(guān)注其原藥及其所養(yǎng)殖水產(chǎn)品的代謝物造成的水環(huán)境污染之外，還需密切關(guān)注水產(chǎn)品中此類抗生素代謝不全帶來的動物源食品的獸藥殘留隱患。本研究中在醫(yī)療廢水中檢出了氧氟沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星，表明這3種常用的喹諾酮類抗菌藥在使用后可能通過醫(yī)療廢棄物以及人體代謝等渠道進入水環(huán)境中，因此，需要特別留意以此為代表的抗生素等高濃度藥物帶來的水環(huán)境污染問題。

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責任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫

Determination of quinolone antibiotics in water by magnetic solid phase extraction and HPLC–MS

Cheng Jing，F(xiàn)u Shanliang，Ding Li，Xu Ruili，Zhu Shaohua，Gong Qiang，Wang Libing*
（Hunan Academy of Inspection and Quarantine， Technology Center of Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau/ Hunan Key Laboratory of Food Safety Science &Technology， Changsha 410004， China）

Abstract:Based on solid phase extraction （SPE） with Fe3O4magnetic nanocomposite @ graphene （MNP@G） as adsorbent， an approach was developed for determination 15 quinolone antibiotics in water by high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry （HPLC–MS）. The main factors affecting the extraction efficiency were investigated. The optimized extraction conditions were: 10％ ammonia in methanol （V/V） as elution solution， 30 mg MNP@G as adsorbent， 30 min adsorption time. Under the conditions， the detection limit of 15 quinolone antibiotics were from 6.5 to 12.8 ng/L， the calibration curves showed good linearity （r =0.999 1～0.999 8） with the concentration range from 10 to 500 ng/L. The developed approach was perfectly applied in the analysis of tap water， agricultural and medical wastewater. The recoveries ranged from 70.0％ to 90.7％ for the 3 real spiked samples， and the relative standard deviations were all less than 10％.

Keywords:quinolone antibiotics； environmental water body； Fe3O4； magnetic nanocomposite@graphene； high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry （HPLC–MS）； solid phase extraction

中圖分類號：X131.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007?1032（2016）03?0328?04

收稿日期：2015–10–27 修回日期：2016–03–07

基金項目：國家“863”計劃項目（2012AA06A303）

作者簡介：成婧（1983—），女，湖南永州人，工程師，主要從事食品安全和環(huán)境安全檢測技術(shù)研究，chengjing4323@163.com；*通信作者，王利兵，研究員，主要從事食品安全與檢驗檢疫安全研究，wanglb0419@126.com