魏如雪，趙學(xué)明，郝海生，杜衛(wèi)華，朱化彬

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

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兔胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

魏如雪，趙學(xué)明，郝海生，杜衛(wèi)華，朱化彬*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

本研究旨在建立穩(wěn)定傳代的兔胎兒成纖維細(xì)胞系及其鑒定方法。取配種后14～15 d的兔胎兒，0.25%胰酶消化胎兒皮膚獲得兔胎兒成纖維細(xì)胞，體外傳代培養(yǎng)；通過觀察細(xì)胞形態(tài)、測定生長曲線、免疫熒光染色、核型分析等鑒定兔胎兒成纖維細(xì)胞，PCR擴(kuò)增SRY基因鑒定2株細(xì)胞系性別。研究結(jié)果表明，兔胎兒成纖維細(xì)胞呈梭形，可在體外快速生長，符合“潛伏期-對數(shù)期-平臺(tái)期”的生長規(guī)律；免疫熒光染色結(jié)果顯示，波形蛋白與纖維連接蛋白染色為陽性，細(xì)胞角蛋白染色為陰性，表明兔胎兒成纖維細(xì)胞純度高，活性好；染色體檢測結(jié)果顯示，在傳至第5代時(shí)，80%的成纖維細(xì)胞核型正常，為2n=44，屬正常范疇；PCR法檢測的2株細(xì)胞系均來源于兔雄性胎兒。綜上表明，本研究建立了兔胎兒成纖維細(xì)胞系體外培養(yǎng)、傳代、鑒定及其性別鑒定方法，可為轉(zhuǎn)基因兔、克隆兔、兔誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞等研究提供充足、可靠的成纖維細(xì)胞來源。

兔胎兒成纖維細(xì)胞；細(xì)胞分離；培養(yǎng)；鑒定

體細(xì)胞培養(yǎng)為生產(chǎn)克隆家畜、轉(zhuǎn)基因家畜以及基因定點(diǎn)修飾和誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞等研究提供細(xì)胞來源。與成年家畜成纖維細(xì)胞相比，妊娠不同階段的早期胎兒皮膚成纖維細(xì)胞具有容易體外分離培養(yǎng)、生長速度快、純度高、易進(jìn)行基因修飾等優(yōu)點(diǎn)，成為最為常用的細(xì)胞之一[1]。有研究表明，白介素-10、透明質(zhì)酸[2]、FK506結(jié)合蛋白38[3]等物質(zhì)與胎兒成纖維細(xì)胞關(guān)系密切，使該類細(xì)胞的研究更為深入。

家兔是具有重要毛用和肉用價(jià)值的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[4]，在中國畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。兔也是傳統(tǒng)的試驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物，與小鼠、猴、豬等試驗(yàn)動(dòng)物相比，體型適中，易操作，且生理結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制與人類接近，尤其適用于人類心腦血管疾病等研究[5]。轉(zhuǎn)基因兔、克隆兔[6]以及兔胚胎干細(xì)胞[7]與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[5，8]的研究取得巨大進(jìn)展。兔胎兒成纖維細(xì)胞(Rabbit embryonic fibroblast，REF)不僅可作為克隆兔和轉(zhuǎn)基因兔研究的供體細(xì)胞，也是重要的飼養(yǎng)層細(xì)胞。兔胎兒成纖維細(xì)胞系的分離培養(yǎng)與鑒定方法尚不完善，目前沒有這方面的詳細(xì)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在優(yōu)化REF細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法，建立穩(wěn)定的REF細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定體系。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物自然交配后14～15 d(交配當(dāng)天記為0 d)的日本大耳白兔，購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。

1.1.2試劑0.25%胰酶、DMEM/F12、谷氨酰胺、青鏈霉素、PBS緩沖液均購自Gibco公司，DMSO和秋水仙素購自Sigma公司。波形蛋白、纖維連接蛋白、細(xì)胞角蛋白一抗均購自武漢博士德公司，二抗購自Invitrogen公司。 姬姆薩染料購自北京賽馳生物科技有限公司。DNA提取試劑盒、2×PCR mastermix購自天根生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1胎兒成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)和純化棒擊法處死配種后14～15 d的孕兔，將其仰臥于手術(shù)臺(tái)上。腹部噴灑75%酒精消毒后，沿腹中線用手術(shù)刀打開腹腔，找到子宮。子宮如一串葡萄狀，每個(gè)胎胞有1/2乒乓球大小，每只母兔有8～10個(gè)胎兒。用含200 IU·L-1青鏈霉素的PBS將子宮洗凈，移入超靜臺(tái)，置于含少量PBS的10 cm培養(yǎng)皿中，剪開子宮壁，取出胎兒。PBS清洗2遍后，去除胎兒頭、四肢、尾和內(nèi)臟，獲得胎兔皮膚。將每只胎兔的皮膚分別置于1.5 mL離心管中，用眼科剪剪碎至組織呈流動(dòng)狀。每管加500 μL 0.25%胰酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化10 min。取一滴消化液于顯微鏡下觀察，看到大量懸浮單細(xì)胞時(shí)加入含10%胎牛血清的500 μL細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。用100 μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，濾除未消化的組織塊。用15 mL離心管收集濾液，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀，鋪于10 cm培養(yǎng)皿上，補(bǔ)加7 mL培養(yǎng)液，搖勻，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。REF細(xì)胞培養(yǎng)液成分：DMEM/F12、10%胎牛血清、2 mmol·L-1Glutamax和100 IU·mL-1青鏈霉素。

依據(jù)成纖維細(xì)胞貼壁較快的特點(diǎn)，本研究采用差速貼壁法純化細(xì)胞。培養(yǎng)3～4 h后觀察細(xì)胞貼壁生長狀況，貼壁成纖維樣細(xì)胞達(dá)到60%左右匯合度時(shí)即可換液，除去未貼壁的雜細(xì)胞。細(xì)胞生長至80%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代或凍存。每10 cm培養(yǎng)皿加2 mL 0.25%胰酶，培養(yǎng)箱中消化2～3 min，待細(xì)胞變圓時(shí)加入等體積培養(yǎng)液終止消化。收集細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心3 min，收集沉淀。收集的細(xì)胞1∶3傳代培養(yǎng)或者凍存。細(xì)胞凍存液成分為DMSO∶FBS∶DMEM=1∶2∶7，每10 cm皿細(xì)胞沉淀(約3×106個(gè)細(xì)胞)加1 mL凍存液，重懸后放入1個(gè)細(xì)胞凍存管中，在4 ℃平衡20 min后，-20 ℃凍存2 h，-80 ℃凍存過夜，最后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察普通光學(xué)顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)代數(shù)的兔胎兒成纖維細(xì)胞生長形態(tài)。

1.2.3生長曲線測定取第2代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104·mL-1，接種于96孔板中。接種后12 h開始計(jì)數(shù)，每隔12 h計(jì)一次，每次計(jì)3孔取平均值，共計(jì)7 d。以細(xì)胞生長時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸繪制生長曲線。

1.2.4細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算及曲線繪制按照細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，依據(jù)公式DT=T×lg2/lg(Nt/N0)計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。T為培養(yǎng)時(shí)間，N0為首次記下的細(xì)胞數(shù)，Nt為t時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)。以細(xì)胞生長時(shí)間為橫軸，細(xì)胞倍增時(shí)間為縱軸繪制曲線。

1.2.5免疫熒光染色取處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的P2代REF細(xì)胞，鋪于24孔板中。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15～20 min，Rinse buffer洗兩遍；0.1%TritonX-100/PBS室溫透化細(xì)胞10 min，Rinse buffer洗兩遍；5%BSA/TBST室封閉細(xì)胞30 min；一抗室溫培養(yǎng)1 h，Rinse buffer洗3遍；二抗室溫培養(yǎng)30～60 min，Rinse buffer洗3遍；加入Hoechst33342工作液染核10 min，吸出后加入PBS覆蓋細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6細(xì)胞核型分析取傳代后培養(yǎng)18、20、22 h的P5代細(xì)胞，加入終濃度為0.1 μg·mL-1的秋水仙素培養(yǎng)4 h。消化成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1 000 r·min-1離心7 min，棄上清。沉淀用4 mL預(yù)熱的0.075 mol·L-1KCl溶液重懸，37 ℃低滲處理15～20 min。加入等體積4 ℃預(yù)冷的固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)混勻，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入新鮮預(yù)冷的固定液，輕輕吹打成單細(xì)胞，4 ℃固定60 min以上。1 000 r·min-1離心5 min，棄掉上清液，再用100 μL固定液重懸細(xì)胞。取30 μL細(xì)胞懸液于-20 ℃載玻片垂直上方50 cm以上處滴片，并立即在酒精燈火焰上烤干。用Giemsa溶液染色10 min后，自來水沖洗掉染液，空氣中自然干燥。在放大1 000倍油鏡下，對擴(kuò)展完好的中期染色體相計(jì)數(shù)。對典型中期染色體拍照，進(jìn)行染色體組型分析。

1.3PCR擴(kuò)增SRY基因鑒定胎兒性別

1.3.1引物根據(jù)兔SRY基因和GAPDH基因序列設(shè)計(jì)的引物序列見表1。引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。

表1引物序列

Table 1Primer sequences

基因名稱Genes序列號(hào)GeneID引物序列(5'-3')Primers產(chǎn)物長度/bpProductsizeSRYNM_001171148.1F:GTGAAGCGACCCATGAACGCA,R:CGGGTATTTCTCCTGTGCAT198GAPDHNM_001082253.1F:AAGGGCGGAGCCAAAAGGGTCA,R:CAGCATCGAAGGTAGAGGAGTG556

1.3.2細(xì)胞基因組DNA的提?。禾旄蚪MDNA提取試劑盒提取2株REF細(xì)胞系DNA，一只成年公兔耳部組織DNA和一只成年母兔耳部組織DNA，操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，DNA于-20 ℃保存。

1.3.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA模板100 ng，SRY上下游引物各1 μL，2×PCR mastermix 12.5 μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至25 μL體系，混勻并離心后進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

1.3.4PCR產(chǎn)物電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，同時(shí)加5 μL 200 bp ladder作為DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1兔胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

兔胎兒的皮膚組織薄嫩，易剪碎，添加胰酶消化10 min后鏡檢，可觀察到大量懸浮單細(xì)胞。消化時(shí)間不要超過10 min，以免消化過度損傷細(xì)胞。3～4 h后即可觀察到大量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈梭形，胞體細(xì)長，邊緣清晰，部分細(xì)胞核仁明顯。細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，排列緊密，呈火焰狀或旋渦狀生長。體外培養(yǎng)的REF細(xì)胞生長迅速，2～3 d傳1代，可傳至10代以上。10代以上的細(xì)胞出現(xiàn)衰老跡象，胞體平鋪，偽足增多，生長速度慢，不適用于后續(xù)試驗(yàn)。REF細(xì)胞生長形態(tài)見圖1。

2.2REF細(xì)胞生長曲線與倍增時(shí)間曲線繪制

P2代REF細(xì)胞的生長曲線見圖2 。由曲線可以得出，REF細(xì)胞的生長規(guī)律與小鼠、人、牛等物種的成纖維細(xì)胞相似度較高，分為典型的3個(gè)生長階段。0～2 d為平臺(tái)期，長勢不明顯，細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定升高，但速度較慢；2～5 d為對數(shù)期，生長速度較快，是細(xì)胞長勢最好，活力最高的時(shí)期，此時(shí)最適用于核移植和重編程等操作；6～7 d為平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞逐漸衰老，數(shù)目穩(wěn)定，增殖不明顯，不適用于后續(xù)試驗(yàn)。圖3為P2代REF細(xì)胞的倍增時(shí)間曲線，結(jié)果表明，在細(xì)胞生長速度最快的2～4 d階段，倍增時(shí)間最短且比較穩(wěn)定，在6～7 d時(shí)顯著增加，表明此時(shí)細(xì)胞分裂速度較慢，與生長曲線趨勢一致。

2.3免疫熒光染色

參照牛等家畜胎兒成纖維細(xì)胞鑒定方法，選擇波形蛋白、纖維連接蛋白、角蛋白3種標(biāo)記蛋白對兔胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定。其中波形蛋白和纖維連接蛋白是成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，角蛋白是上皮細(xì)胞標(biāo)志。免疫熒光染色結(jié)果見圖4。試驗(yàn)結(jié)果表明，波形蛋白和纖維連接蛋白染色為陽性，角蛋白染色為陰性，與牛、人等成纖維細(xì)胞一致。說明所得兔胎兒成纖維細(xì)胞純度高，活性好。

A.原代REF細(xì)胞(100×)；B.P3代REF細(xì)胞(100×)；C.P3代REF細(xì)胞(40×)；D.P10代REF細(xì)胞(100×)A.Primary REF cell (100×)；B.The third generation of REF cell (100×)；C.The third generation of REF cell (40×)；D.The tenth generation of REF cell (100×) 圖1　兔胎兒成纖維細(xì)胞形態(tài)Fig.1　The morphology of REF cell

圖2　P2代REF細(xì)胞生長曲線Fig.2　Growth curve of the second generation REF cell

圖3　P2代 REF細(xì)胞倍增時(shí)間曲線Fig.3　Double time of the second generation REF cell

2.4細(xì)胞核型分析

取傳代后培養(yǎng)18、20、22 h的P5代細(xì)胞進(jìn)行核型鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明，各組核型正常的細(xì)胞均占到80%～87%，正常REF細(xì)胞核型為2n=44。傳代后培養(yǎng)20 h組細(xì)胞處于中期分裂相的數(shù)目最多，最適宜觀察，結(jié)果見圖5。

2.5SRY基因鑒定兔胎兒性別

根據(jù)兔SRY基因和GAPDH基因序列各設(shè)計(jì)1對引物。擴(kuò)增成年母兔耳部組織、成年公兔耳部組織、REF1和REF2細(xì)胞系的SRY基因，同時(shí)擴(kuò)增REF1細(xì)胞系的GAPDH基因作為PCR體系陽性對照，結(jié)果見圖6。PCR結(jié)果表明，可有效地?cái)U(kuò)增出成年公兔和REF1、REF2細(xì)胞系SRY基因以及REF1細(xì)胞系GAPDH基因的特異性片段。而在陰性對照成年母兔無任何擴(kuò)增條帶。故有相同擴(kuò)增條帶的REF1、REF2細(xì)胞系為雄性胎兒。

a1、b1、c1.免疫熒光染色波形蛋白、纖維連接蛋白、角蛋白Hoechst33342(100×)。a2、b2、c2.波形蛋白、纖維連接蛋白、角蛋白光鏡照片(100×)。(藍(lán)色為Hoechst33342染色；紅色為特異性抗體染色)a1，b1，c1.Nuclear staining and specific staining reactions of vimentin，fibronectin and cytokeratin(100×).a2，b2，c2.Light micrograph images of vimentin，fibronectin and cytokeratin specific staining reactions(100×).(Blue for dyeing Hoechst 33342;Red for the specificity of the antibody staining)圖4　兔胎兒成纖維細(xì)胞免疫熒光檢測Fig.4　Specific staining reactions of REF cell

圖5　傳代后20 h P5代兔胎兒成纖維細(xì)胞核型鑒定(1 000×) Fig.5　Karyotype analysis of fifth generation REF cell after 20 hours culture (1 000×)

3　討　論

M.200 bp DNA marker；1.成年母兔耳部組織DNA(陰性對照)；2.成年公兔耳部組織DNA(陽性對照)；3、4.雄性胎兒成纖維細(xì)胞系REF1、REF2；5.GAPDH(PCR體系陽性對照)M.200 bp DNA marker；1.Ear tissue DNA of adult female rabbit(negative control)；2.Ear tissue DNA of adult male rabbit(positive control)；3，4.Male fetal REF cell lines REF1 and REF2；5.GAPDH(positive control of PCR reaction system)圖6　PCR擴(kuò)增SRY基因產(chǎn)物電泳分析Fig.6　Amplification products of SRY-PCR

母兔配種后12～18 d[9-11]的胎兒均可作為兔胎兒成纖維細(xì)胞的來源。本研究開始時(shí)曾使用配種后13.5 d的孕兔，但是胎兒體積過小，難以分辨頭、四肢與內(nèi)臟，所得皮膚組織如細(xì)胞少，純度低。經(jīng)探索后發(fā)現(xiàn)，配種后14～15 d孕齡的胎兒體積適中，長度約1 cm，頭、尾、四肢、內(nèi)臟清晰可辨，易剝除。每個(gè)胎兒可得3×106個(gè)原代細(xì)胞，細(xì)胞量大且純度高，因此后期均選用配種后14～15 d的胎兒分離細(xì)胞。為得到最佳狀態(tài)的REF細(xì)胞，本研究采用組織塊培養(yǎng)法和胰酶消化法，但組織塊培養(yǎng)法在培養(yǎng)兩周后并未見有細(xì)胞從組織塊周邊爬出，可能是將組織切得過于細(xì)碎所致。胰酶消化法可快速得到大量原代細(xì)胞，3～4 d可凍存，因此在本試驗(yàn)中均采用胰酶消化法分離REF細(xì)胞。

目前多種家畜如豬[12]、山羊[13]、牛[14]等動(dòng)物的胎兒成纖維細(xì)胞鑒定方法都較成熟，包括形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線測定、免疫熒光染色和核型鑒定等。REF細(xì)胞形態(tài)符合成纖維細(xì)胞特征，呈長梭形，與小鼠胎兒成纖維細(xì)胞相比胞體更長更大，表明物種間存在差異。本研究生長曲線測定結(jié)果表明，當(dāng)REF生長進(jìn)入停滯期時(shí)，細(xì)胞量為3.3×105個(gè)·mL-1，而牛胎兒成纖維細(xì)胞為8×105個(gè)·mL-1[15]，人胎兒成纖維細(xì)胞為1.8×105個(gè)·mL-1，小鼠胎兒成纖維細(xì)胞為1.1×105個(gè)·mL-1[16]。

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，纖維連接蛋白和波形蛋白染色為陽性，與牛皮膚成纖維細(xì)胞結(jié)果一致[14]，符合成纖維細(xì)胞特征；細(xì)胞角蛋白染色陰性，表明沒有上皮細(xì)胞污染。纖維連接蛋白是由成纖維細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，負(fù)責(zé)膠原之間的連接、細(xì)胞的黏附和增殖等[17]。波形蛋白是細(xì)胞骨架的成員之一，它存在于中胚層起源的細(xì)胞中，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等[18]，并與微管、微絲共同形成了一個(gè)細(xì)胞支架網(wǎng)絡(luò)而維持細(xì)胞完整性[19]。因此在成纖維細(xì)胞鑒定中常選用這兩種蛋白作標(biāo)志蛋白。

正常的細(xì)胞核型是用于克隆、轉(zhuǎn)基因、重編程等研究的重要前提，本研究檢測所培養(yǎng)的P5代REF細(xì)胞核型正常率>80%，屬于正常范疇。隨細(xì)胞傳代數(shù)增加，細(xì)胞衰老嚴(yán)重，而衰老可導(dǎo)致染色質(zhì)損傷[20]，增大核型異常的細(xì)胞比率，不利于進(jìn)行后續(xù)研究。因此選取3代以內(nèi)REF細(xì)胞作為核移植或重編程材料，選取5代以內(nèi)REF細(xì)胞作飼養(yǎng)層。SRY是位于雄性Y染色體性別決定區(qū)(Sex-determining region)的基因，它在不同動(dòng)物中高度保守。

SRY基因的表達(dá)決定了胚胎沿雄性方向分化。特異性擴(kuò)增SRY基因的核心序列就可以對動(dòng)物細(xì)胞或胚胎進(jìn)行性別鑒定。該方法由于操作簡便，準(zhǔn)確性高，已廣泛應(yīng)用于各種家畜如豬[21]、綿羊[22]、牛[23]等的性別鑒定。本研究采用該方法對培養(yǎng)的2個(gè)REF細(xì)胞系進(jìn)行性別鑒定，均擴(kuò)增出198 bp的特異性DNA片段，這與前人研究結(jié)果一致[24]，表明2株細(xì)胞系均來自雄性胎兒，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

本研究建立了兔胎兒成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，獲得可穩(wěn)定傳代、狀態(tài)良好的REF細(xì)胞系。并采用形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線測定、免疫熒光檢測、核型分析等方法對細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，結(jié)果符合成纖維細(xì)胞的特征。最后使用SRY-PCR法檢測2株REF細(xì)胞系性別，均為雄性。這為轉(zhuǎn)基因兔、克隆兔、細(xì)胞重編程等奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編輯程金華)

Isolation，Culture and Identification of Rabbit Embryonic Fibroblasts

WEI Ru-xue，ZHAO Xue-ming，HAO Hai-sheng，DU Wei-hua，ZHU Hua-bin*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

This research was conducted to establish the stable rabbit embryonic fibroblast cell lines and identification methods. Rabbit embryonic fibroblasts were isolated from 14-15 d rabbit fetus by trypsin enzyme digesting skin tissues, and passagedinvitrosteadily. Morphology observation, growth curve measurement, immunofluorescence and karyotype analysis were applied to cell lines identification. The sex of 2 cell lines were determined by amplifying core sequence of rabbitSRYgene. The results showed that rabbit embryonic were spindle shaped and fibroblasts grew fastinvitro, conforming to the pattern of “l(fā)atent phase-logarithmic growth phase-stagnate phase”. Immunofluorescence assay showed that vimentin and fibronectin staining were positive, while cytokeratin staining was negative, indicated the high purity and activity of rabbit embryonic fibroblast cells. The result of chromosome analysis showed that 80% ploidy of one cell lines maintained normal (2n=44) when cultured up to passage 5. For cell lines sexing, SRY-PCR analysis suggested the 2 determined cell lines were male. These results indicated that our research could be used to establish rabbit embryonic fibroblast cell lines and determine sex, providing adequate and reliable fibroblast cells for transgenesis, cloning and iPS rabbit research.

rabbit embryonic fibroblasts；isolation；culture；identification

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.025

2015-12-14

家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(ASTIP-IAS06-2016)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31472100)

魏如雪(1991-)，女，山東德州人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：704446770@qq.com

朱化彬，博士，研究員，主要從事家畜胚胎工程與繁殖研究，E-mail：zhuhuabin@caas.cn

S814.8；S829.1

A

0366-6964(2016)06-1272-08