曾婷婷，謝芝勛，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，羅思思，黃　莉，黃嬌玲

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，南寧 530001)

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應(yīng)用多重GeXP-PCR同時(shí)檢測(cè)6種雞免疫抑制病病毒的研究

曾婷婷，謝芝勛*，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，羅思思，黃莉，黃嬌玲

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，南寧 530001)

擬建立一種基于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)的多重PCR方法，同時(shí)檢測(cè)6種雞免疫抑制病病毒——雞馬立克病毒、禽白血病病毒(包括A、B和J亞群)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、禽呼腸孤病毒、雞傳染性貧血病毒和傳染性法氏囊炎病毒。多重PCR反應(yīng)使用嵌合引物和通用引物組合的反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，鑒別PCR產(chǎn)物片段；通過(guò)調(diào)整嵌合引物濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度優(yōu)化反應(yīng)體系及調(diào)整退火溫度和時(shí)間優(yōu)化反應(yīng)條件。應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR，分別單獨(dú)和同時(shí)檢測(cè)6種雞免疫抑制病病毒的8個(gè)目的基因，同時(shí)以其他常見(jiàn)禽類病毒和雞組織器官核酸為對(duì)照，驗(yàn)證其特異性；檢測(cè)8個(gè)目的基因不同濃度的克隆質(zhì)粒，驗(yàn)證其敏感性；應(yīng)用建立的多重PCR檢測(cè)300份臨床樣品，并同時(shí)用熒光定量PCR和測(cè)序驗(yàn)證其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明建立的多重GeXP-PCR方法能夠分別擴(kuò)增出6種病毒，8個(gè)特異性目的片段，不能擴(kuò)增其他常見(jiàn)禽類病毒和雞組織器官的基因；在低至100 copies·20 μL-1的水平能同時(shí)特異性地檢測(cè)出6種雞免疫抑制病病毒核酸；檢測(cè)300份臨床病死雞樣品，190份樣品顯示為陽(yáng)性，PCR和測(cè)序結(jié)果與多重GeXP-PCR結(jié)果相符。本研究建立的多重GeXP-PCR方法可特異、敏感、高通量地檢測(cè)6種雞免疫抑制性病毒，可用于臨床鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)；多重PCR；高通量；雞免疫抑制病病毒

GuangxiVeterinaryResearchInstitute，Nanning530001，China)

雞免疫抑制病病毒主要包括雞馬立克病毒(Marek’s disease virus，MDV)[1]、禽白血病病毒(avian leucosis virus，ALV，以A、B和J亞群ALV為主)[2]、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)[3]、禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)[4]、雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anaemia virus，CIAV)[5]和傳染性法氏囊炎病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)[6-7]，這些病毒都能破壞雞的免疫功能造成免疫抑制。雞群感染免疫抑制病病毒后，對(duì)致病菌和其他病毒更加易感，發(fā)生繼發(fā)感染，接種疫苗后達(dá)不到預(yù)期免疫效果[8-9]，飼料報(bào)酬降低和生長(zhǎng)緩慢。雞感染這些病毒后的臨床癥狀各有不同，但有些不是馬上表現(xiàn)出來(lái)。雞感染MDV、ALV和REV后，免疫抑制比腫瘤出現(xiàn)早得多[1，3]。小于3周齡的雛雞感染IBDV有時(shí)不會(huì)出現(xiàn)典型癥狀，但仍出現(xiàn)免疫抑制[9]。超過(guò)3周齡的雛雞感染CIAV后，能產(chǎn)生一定的免疫力，不會(huì)引起貧血，但仍然會(huì)發(fā)生免疫抑制[10]。臨床上常見(jiàn)幾種免疫抑制病毒混合感染，使診斷更加困難[11-12]。

故對(duì)以上所述病毒感染進(jìn)行鑒別診斷和檢測(cè)尤為重要。常規(guī)的檢測(cè)方法是病毒分離，需要花費(fèi)較長(zhǎng)的周期。普通PCR、熒光PCR和LAMP等分子生物學(xué)方法檢測(cè)病毒比較快速，但一個(gè)反應(yīng)體系只能檢測(cè)2～4種病毒。

GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)是一種新的、高通量的基因檢測(cè)平臺(tái)[13]。通過(guò)毛細(xì)管電泳鑒定經(jīng)過(guò)熒光基團(tuán)標(biāo)記的多重PCR產(chǎn)物。PCR體系使用嵌合引物和通用引物組合，嵌合引物由特異性引物的5′端添加通用引物組成。上游嵌合引物由特異性引物和連接在其5′端的通用引物組成，通用引物的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)，下游嵌合引物亦由特異性引物和連接在其5′端的通用引物組成，但不標(biāo)記熒光基團(tuán)。設(shè)計(jì)引物時(shí)，使每對(duì)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物之間至少相差7～10 bp，然后通過(guò)毛細(xì)管電泳辨認(rèn)擴(kuò)增片段大小。這項(xiàng)技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于診斷多種疾病，如同時(shí)檢測(cè)11種人乳頭瘤病毒[14]，9種血清型的手足口病[15]，癌癥基因[16]，7種腸炎病毒[17]和人的H1N1病毒[18]。這項(xiàng)技術(shù)第一次應(yīng)用于獸醫(yī)領(lǐng)域是2014年本實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)9種雞呼吸道病原[19]。

本研究旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)MDV、ALV-A/B/J、REV、CIAV、IBDV和ARV的多重GeXP-PCR方法。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物福利聲明

本研究經(jīng)過(guò)廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所的動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)，所使用的雞胚和SPF雞均符合動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物宰殺和樣品采集過(guò)程按照章程將動(dòng)物的痛苦降至最低。

1.2病毒毒株和臨床樣品采集

本研究中所使用病毒毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存，如表1所示。MDV、ALV-A/B/J和REV使用SPF雞胚制作的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)增殖，IBDV和ARV使用9日齡SPF雞胚增殖，CIAV使用1日齡SPF雛雞增殖，雛雞腹膜注射含病毒的組織上清液，2周后收集雛雞骨髓。臨床樣品采自送檢病死雞，共300羽病死雞，包括雞胸腺、法氏囊、脾、肝、骨髓和血液，將這些組織混合勻漿保存。病死雞的日齡介于50～135 d，包括種雞、蛋雞和肉雞。

表1毒株來(lái)源

Table 1Sources of pathogens

病原Pathogen來(lái)源Source參考毒株Referenceviruses 馬立克病毒Marek’sdiseasevirusKC453972,KC453973,GX130112,GX140301,050118,070123,090201,100428GVRI 禽白血病病毒A亞群AvianleucosisvirussubgroupAisolateRSV-1CVCC 禽白血病病毒A亞群AvianleucosisvirussubgroupAisolateGX110521,GX110522,ALVA01,ALVA02,ALVA03GVRI 禽白血病病毒B亞群AvianleucosisvirussubgroupBisolateRSV-2CVCC 禽白血病病毒B亞群AvianleucosisvirussubgroupBisolateGX111230,GX130401,ALVB15,ALVB23,ALVB28GVRI 禽白血病病毒J亞群AvianleucosisvirussubgroupJisolateKC453974,KC453975,GX090201,GX090521,GX110110,GX120081,GX130018,GX140010GVRI 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒ReticuloendotheliosisvirusAV235CVCC 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒ReticuloendotheliosisvirusKC453976,KC453977,GX120825,GX131118GVRI 禽呼腸孤病毒AvianreovirusS1133,1733,526,C78,GuangxiR1,GuangxiR2,GX110058GVRI 傳染性法氏囊炎病毒InfectiousbursaldiseasevirusCA,AV162,AV144CVCC 傳染性法氏囊炎病毒InfectiousbursaldiseasevirusAV6CIVDC 傳染性法氏囊炎病毒Infectiousbursaldiseasevirus070124,080113,090053,100008,110110,130223GVRI 雞傳染性貧血病毒ChickeninfectiousanaemiavirusCAU0728,CAU0729,CAU0730,CAU0731,CAU0732CVCC 雞傳染性貧血病毒ChickeninfectiousanaemiavirusGXC060821GVRI其他病毒Otherviruses 禽流感病毒InactivatedH5N1avianinfluenzavirusRe-1HVRI 禽流感病毒AvianinfluenzavirusH9N6/Duck/HK/147/77HKU 禽流感病毒AvianinfluenzavirusH7N2/chickenPA/3979/97PU 新城疫病毒NewcastlediseasevirusF48E9GVRI 新城疫病毒NewcastlediseasevirusGX6/02GVRI 雞傳染性支氣管炎病毒InfectiousbronchitisvirusMassachusetts41GVRI 雞傳染性喉氣管炎病毒InfectiouslaryngotracheitisvirusAV1231CIVDC 雞滑液囊支原體MycoplasmasynoviaeCAU0748CVCC

HVRI.哈爾濱獸醫(yī)研究所；HKU.香港大學(xué)；GVRI.廣西獸醫(yī)研究所；CIVDC.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；PU.賓夕法尼亞大學(xué)；CVCC.中國(guó)獸醫(yī)微生物保藏中心

HVRI.Harbin Veterinary Research Institute，China；HKU.University of Hong Kong，China；GVRI.Guangxi Veterinary Research Institute，China；CIVDC.China Institute of Veterinary Drugs Control，China；PU.University of Pennsylvania，USA；CVCC.China Veterinary Culture Collection Centre，China

1.3試劑與儀器

RNA/DNA共提試劑盒(E.Z.N.A.?Total DNA/RNA Isolation Kit)購(gòu)自O(shè)MEGA(Norcross，GA，USA)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript II Reverse Transcriptase[M-MLV，RNase-](High Temperature RT)購(gòu)自全式金生物(北京，中國(guó))；多重PCR試劑盒Genome Lab GeXP Starter Kit購(gòu)自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)；樣品緩沖液，DNA Marker，上樣板，液體石蠟均購(gòu)自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)；pGEM-T載體購(gòu)自Promega(Madison，USA)，普通PCR酶，膠回收試劑盒，感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物(北京，中國(guó))；限制性內(nèi)切酶SpeⅠ購(gòu)自寶生物(大連，中國(guó))；DNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒RiboMAX Large Scale RNA Production Systems SP6/T7 Kit購(gòu)自Promega(Madison，USA)；PCR儀購(gòu)自Thermo (Milford，USA)；超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000購(gòu)自Thermo Fisher Scientific(Milford，USA)；GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)GenomeLab GeXP Genetic Analysis System購(gòu)自貝克曼(Beckman Coulter，Brea，USA)。

1.4 RNA/DNA抽提和RNA反轉(zhuǎn)錄

使用RNA/DNA共提試劑盒抽提MDV毒株細(xì)胞培養(yǎng)物；REV和 ALV-A/B/J毒株細(xì)胞培養(yǎng)物(含有REV和 ALV-A/B/J的前病毒DNA，proviral DNA)[20]，CIAV人工感染SPF雞的骨髓，IBDV和ARV的雞胚增殖的尿囊液的總RNA/DNA。用無(wú)核酸酶超純水溶解抽提好的DNA/RNA，于-80 ℃條件保存?zhèn)溆?。按照說(shuō)明書將IBDV和ARV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用(反轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)抽提產(chǎn)物中的DNA無(wú)影響)。

1.5引物設(shè)計(jì)和引物合成

將本實(shí)驗(yàn)室保存毒株的序列與GenBank公布的毒株序列經(jīng)過(guò)MEGA5.0軟件比對(duì)后，在它們的保守區(qū)域用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。通用引物為貝克曼公司專利產(chǎn)品，不與任何現(xiàn)有物種的基因互補(bǔ)配對(duì)，序列由貝克曼公司提供。特異性上游引物及其5′端加上通用引物序列，并在通用引物的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)Cy5組成上游嵌合引物，下游嵌合引物由下游特異性引物及其5′端加上通用引物序列組成，但不標(biāo)記熒光基團(tuán)。所有的嵌合引物由上海英駿生物公司合成和純化。引物序列見(jiàn)表2。

1.6建立多重PCR體系和反應(yīng)程序

應(yīng)用貝克曼Genome Lab GeXP Starter Kit建立多重PCR體系：總反應(yīng)體積為20 μL，其中5× buffer 4 μL，buffer內(nèi)含通用引物，工作濃度為0.25 μmol·L-1；MgCl2(25 μmol·L-1) 2 μL；嵌合引物混合物1 μL；Thermo-Start DNA polymerase 0.35 μL；cDNA/DNA模板 1 μL；無(wú)核酸酶超純水補(bǔ)足體積。

多重PCR反應(yīng)程序包括3步：95 ℃ 5 min預(yù)變性后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)。

1.7毛細(xì)管電泳和結(jié)果分析

取1 μL PCR產(chǎn)物和38.75 μL樣品緩沖液，0.25 μL DNA Marker混合均勻，加入上樣板中，滴加石蠟封閉液體表面。將上樣板置于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)儀器卡槽中，進(jìn)行高分辨率的毛細(xì)管電泳。不同大小片段的PCR產(chǎn)物在電泳過(guò)程中分離，通過(guò)PCR產(chǎn)物攜帶的熒光基團(tuán)辨認(rèn)其片段大小和信號(hào)強(qiáng)度。電泳完成后，使用儀器自帶軟件eXpress Profiler software分析結(jié)果，橫坐標(biāo)表示片段大小，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度，即PCR產(chǎn)物的含量。

1.8基于GeXP的多重PCR方法的特異性和敏感性試驗(yàn)

根據(jù)電泳分析結(jié)果，調(diào)整嵌合引物濃度、Mg2+濃度、Taq酶濃度優(yōu)化反應(yīng)體系及調(diào)整退火溫度和時(shí)間優(yōu)化反應(yīng)條件。使用建立的多重GeXP-PCR方法，分別以各毒株核酸、其他常見(jiàn)雞病毒毒株(包括H5/H7/H9 三個(gè)血清型的禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒的核酸，以及健康SPF雞的胸腺、脾和法氏囊的核酸為模板)，檢測(cè)該方法的特異性。

構(gòu)建多重GeXP-PCR的各目的片段的重組質(zhì)粒，以此為模板測(cè)試建立的多重GeXP-PCR方法的敏感性。用特異性引物擴(kuò)增各毒株的目的片段，與pGEM-T載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞增殖，并抽提質(zhì)粒。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)純化和測(cè)序驗(yàn)證其序列的準(zhǔn)確性。IBDV和ARV的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)SpeⅠ酶切線性化之后體外轉(zhuǎn)錄為ssRNA。所有DNA質(zhì)粒和ssRNA均用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。以構(gòu)建好的DNA質(zhì)粒和ssRNA為模板，按照建立的多重GeXP-PCR的流程，單一模板的終濃度分別調(diào)整為105copies·20 μL-1至1 copy·20 μL-1，測(cè)定多重GeXP-PCR對(duì)單一模板的敏感性；將單一模板等濃度混合為多重模板，將每種模板的終濃度均調(diào)整為105copies·20 μL-1至1 copy·20 μL-1，測(cè)定多重GeXP-PCR對(duì)多重模板的敏感性。

表2引物序列信息

Table 2Primer sequences

病毒Virus引物序列(5'-3')Primersequence擴(kuò)增片段/bpAmpliconsize目的基因Targetregion引物濃度/(μmol·L-1)PrimerconcentrationMDVF:AGGTGACACTATAGAATAAGGGAGCAGACGTACTATGTAGACAAR:GTACGACTCACTATAGGGATGGTAAGCAGTCCAAGGGTCA227meq0.16ALV-AF:AGGTGACACTATAGAATACAAGGGGTTCCTTGGTATCTR:GTACGACTCACTATAGGGATGTGCCTATCCGCTGTCA155gp850.2ALV-BF:AGGTGACACTATAGAATATCAATCACGATTCTCCCACCR:GTACGACTCACTATAGGGATGTGACGCTTCGTTTACGTCTT285gp850.2ALV-JF:AGGTGACACTATAGAATACTGATGCAACAACCAGGAAAR:GTACGACTCACTATAGGGAGCAGTGACATTAGTGACATACCC204gp850.2REVF:AGGTGACACTATAGAATAGACCAGGCGAGCAAAATCR:GTACGACTCACTATAGGGAGGTGTAATAGGTAGGTATGGAGGA182gp900.2IBDVF:AGGTGACACTATAGAATAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTR:GTACGACTCACTATAGGGATCTGTCAGTTCACTCAGGCTTC294VP20.2CIAVF:AGGTGACACTATAGAATAAAAGGCGAACAACCGATGAR:GTACGACTCACTATAGGGATGCCCTGGAGGAAAAGACC269VP10.2ARVF:AGGTGACACTATAGAATAGGACCCCTACTTCTGTTCTCAR:GTACGACTCACTATAGGGAATTTCCCGTGGACGACAT215S10.16

F.上游引物；R.下游引物；帶下劃線的為通用引物，嵌合引物由通用引物和特異性引物一起合成組成

F.Forward primer；R.Reverse primer；Universal tag sequences are underlined.Chimeric primers were synthesised using universal tags and specific primers

1.9模擬混合感染和干擾試驗(yàn)

為了測(cè)試建立的多重GeXP-PCR方法應(yīng)用于臨床時(shí)的準(zhǔn)確性和敏感性，將經(jīng)過(guò)病毒分離和測(cè)序鑒定確診為免疫抑制病病毒感染的病雞組織器官樣品：胸腺、法氏囊、骨髓、肝和血液隨機(jī)組合并以任意比例混合，抽提總DNA/RNA，按照建立的多重GeXP-PCR方法流程進(jìn)行檢測(cè)。

為了測(cè)試不同模板之間的濃度差異較大時(shí)，不同濃度的模板對(duì)建立的多重GeXP-PCR方法引物擴(kuò)增效率的影響和是否仍能敏感的檢測(cè)到低濃度的模板，使用不同濃度的陽(yáng)性毒株核酸(最高模板濃度至少是最低模板濃度的104倍)隨機(jī)組合為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR，并以單一模板為對(duì)照進(jìn)行多重GeXP-PCR。如隨機(jī)挑選了ALV-J、MDV和CIAV作為組合。先以探針?lè)晒舛縋CR測(cè)定模板濃度，調(diào)整模板終濃度依次為107、102和103copies·20 μL-1進(jìn)行多重GeXP-PCR，同時(shí)分別以相同濃度的ALV-J和MDV為單一模板進(jìn)行多重GeXP-PCR。

1.10應(yīng)用建立的多重PCR方法檢測(cè)臨床樣品

采集病死雞的胸腺、法氏囊、骨髓、脾、肝和血液，混合勻漿后抽提總DNA/RNA，按照建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)以本研究設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行SYBR GreenⅠ定量PCR，并將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，驗(yàn)證陽(yáng)性結(jié)果。

2　結(jié)　果

2.1特異性試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)體系優(yōu)化，最終嵌合引物的比例和濃度見(jiàn)表2。應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法，以表1中所列毒株為模板進(jìn)行單一模板特異性試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)GeXP電泳，均得到特異性單峰，圖1A～H所示為單一模板電泳圖，片段大小與引物設(shè)計(jì)預(yù)期相符；進(jìn)行多模板特異性試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)GeXP電泳，同時(shí)得到8個(gè)特異性單峰；以表1中其他禽病原體和SPF健康雞組織核酸為模板，無(wú)擴(kuò)增片段。單重模板、多重模板均無(wú)非特異擴(kuò)增峰，見(jiàn)圖1。

多重GeXP-PCR的單一模板特異性試驗(yàn)：A.ALV-A，155.38 bp；B.ALV-B，284.65 bp；C.ALV-J，204.55 bp；D.MDV，227.35 bp；E.REV，182.64 bp；F.CIAV，268.61 bp；G.ARV，215.83 bp；H.IBDV，294.27 bp；多重GeXP-PCR的多重模板特異性試驗(yàn)：I.6種病毒，8個(gè)特異性片段依次為ALV-A，155.80 bp；REV，182.67 bp；ALV-J，204.50 bp；ARV，215.75 bp；MDV，227.16 bp；CIAV，268.59 bp；ALV-B，285.09 bp；IBDV，294.02 bp；J.陰性對(duì)照以其他禽病原體和SPF雞組織核酸為模板，單峰為markerThe GeXP-multiplex PCR assay was performed using a single template and mixed primers for the following：A.ALV-A，155.38 bp；B.ALV-B，284.65 bp；C.ALV-J，204.55 bp；D.MDV，227.35 bp；E.REV，182.64 bp；F.CIAV，268.61 bp；G.ARV，215.83 bp；H.IBDV，294.27 bp；I.The GeXP-multiplex PCR assay was performed using mixed templates and mixed primers for the following：8 single products：ALV-A，155.80 bp；REV，182.67 bp；ALV-J，204.50 bp；ARV，215.75 bp；MDV，227.16 bp；CIAV，268.59 bp；ALV-B，285.09 bp；IBDV，294.02 bp；J.Negative control was performed using nucleic acid of others avian viruses and SPF chicken，signal was marker圖1　多重GeXP-PCR特異性試驗(yàn)經(jīng)GeXP電泳結(jié)果Fig.1　Specificity of GeXP-multiplex PCR assay

2.2敏感性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，使用構(gòu)建的DNA質(zhì)?；騭sRNA為單一模板時(shí)，ALV-A、ALV-J、REV、CIAV和ARV的最低檢測(cè)值為10 copies·20 μL-1；MDV、 ALV-B和IBDV為102copies·20 μL-1。6種病毒8個(gè)目的基因的質(zhì)粒和ssRNA等比例混合時(shí)，每個(gè)目的基因的最低檢測(cè)值均為102copies·20 μL-1。圖2所示為多重GeXP-PCR多重模板，每種模板分別為105copies·20 μL-1(A)，104copies·20 μL-1(B)，103copies·20 μL-1(C)和102copies·20 μL-1(D)的電泳結(jié)果。

使用構(gòu)建的DNA質(zhì)粒和ssRNA為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR方法，每個(gè)反應(yīng)每種模板分別為A.105 copies·20 μL-1；B.104 copies·20 μL-1；C.103 copies·20 μL-1；D.102 copies·20 μL-1The GeXP-multiplex PCR assay was performed using equal amounts of specific DNA-containing plasmid template and in vitro transcribed ssRNA corresponding to 6 immunosuppressive viruses，8 templates at concentrations：A.105 copies·20 μL-1，B.104 copies·20 μL-1，C.103 copies·20 μL-1，D.102 copies·20 μL-1圖2　多重PCR敏感性試驗(yàn)GeXP電泳結(jié)果Fig.2　Sensitivity of GeXP-multiplex PCR assay

2.3模擬混合感染和干擾試驗(yàn)

將確診為免疫抑制病病毒陽(yáng)性的病料隨機(jī)混合，應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，得到與預(yù)期相符合特異性單峰，圖3所示為隨機(jī)混合ARV 和IBDV，ALV-J和ALV-B以及6種病毒病料混合的電泳結(jié)果。將構(gòu)建的DNA質(zhì)粒和ssRNA按照ALV-J 107copies·20 μL-1，MDV 102copies·20 μL-1和CIAV 103copies·20 μL-1為反應(yīng)體系終濃度的比例混合，應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)分別以同一濃度的單一模板為對(duì)照，結(jié)果顯示，當(dāng)不同模板的濃度懸殊時(shí)，仍能準(zhǔn)確敏感地檢測(cè)出低濃度的模板，并且多重模板和單一模板的產(chǎn)物濃度相差不大，如圖4所示。

2.4臨床樣品檢測(cè)

300份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。同時(shí)使用本研究中設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行單重SYBR GreenⅠ定量PCR檢測(cè)臨床樣品，將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，并與建立的多重GeXP-PCR對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR結(jié)果與定量PCR結(jié)果相符，并且測(cè)序結(jié)果顯示陽(yáng)性結(jié)果均為對(duì)應(yīng)的病毒。300份臨床樣品中，190份樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其中單重感染119份，ALV-A 6份，ALV-B 2份，ALV-J 21份，MDV 26份，REV 15份，IBDV 17份，CIAV 9份和ARV 23份；混合感染71份：MDV+ALV-A 4份，MDV+ALV-J 25份，ALV-B+ALV-J 1份，MDV+ALV-J+REV 6份，MDV+CIAV 5份，MDV+REV 6份，ALV-J+REV 3份，IBDV+ALV-J 5份，MDV+CIAV+ALV-J 4份，REV+ARV 3份，ALV-J+ARV 6份，ALV-J+IBDV 3份。

將ARV和 IBDV，ALV-J 和ALV-B，以及6種免疫抑制病病毒的病料為模板，模擬混合感染情況：A.ARV和 IBDV；B.ALV-J 和ALV-B；C.6種免疫抑制病病毒The GeXP-multiplex PCR assay was performed using artificially mixed templates and mixed primers for ARV and IBDV，ALV-J and ALV-B，or 6 immunosuppressive viruses：A.ARV and IBDV；B.ALV-J and ALV-B；C.6 immunosuppressive viruses圖3　多重PCR模擬混合感染的GeXP電泳結(jié)果Fig.3　Artificially mixed templates for the GeXP-multiplex PCR assay

A.ALV-J 107 copies·20 μL-1，MDV 102 copies·20 μL-1 和CIAV 103 copies·20 μL-1的反應(yīng)體系終濃度的比例混合為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR檢測(cè)；B.以MDV 102 copies·20 μL-1的濃度為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR檢測(cè)；C.以ALV-J 107 copies·20 μL-1的濃度為模板進(jìn)行多重GeXP-PCR檢測(cè)A.The GeXP-multiplex PCR assay was performed using templates for ALV-J 107 copies·20 μL-1，MDV 102 copies·20 μL-1 and CIAV 103 copies·20 μL-1；B.MDV 102 copies·20 μL-1；C.ALV-J 107 copies·20 μL-1圖4　干擾試驗(yàn)多重PCR反應(yīng)經(jīng)GeXP電泳結(jié)果Fig.4　GeXP-multiplex PCR interference assays

表3臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

Table 3Detection results for clinical specimens

單重感染SingleinfectionMDVALV-AALV-BALV-JREVIBDVCIAVARVMDV+ALV-AMDV+ALV-JALV-B+ALV-J數(shù)量Number2.6622115179234251比例/%Rate8.72.00.77.05.05.73.07.71.38.30.4定量PCR結(jié)果Real-timePCRresults26622115179234251測(cè)序結(jié)果Sequencingresults26622115179234251混合感染Co-infectionMDV+ALV-J+REVMDV+CIAVMDV+REVALV-J+REVIBDV+ALV-JMDV+CIAV+ALV-JREV+ARVALV-J+ARVALV-J+IBDV數(shù)量Number656354363比例/%Rate2.01.62.01.51.61.31.02.01.0定量PCR結(jié)果Real-timePCRresults656354363測(cè)序結(jié)果Sequencingresults656354363

3　討　論

MDV、ALV (以ALV-A/B/J為主)、REV、IBDV、CIAV 和ARV是引起雞免疫抑制的主要幾種病原，并且常常發(fā)生混合感染，給診斷帶來(lái)極大的難度[11-12，21]。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法存在比較耗時(shí)和每個(gè)反應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目少的限制，常規(guī)的PCR或定量PCR往往每個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)2～4種病原。

基于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)的多重PCR方法，以其優(yōu)越的特異性，敏感性和高通量為同時(shí)鑒別診斷以上幾種病原提供了解決方案[22-23]。首先，利用嵌合引物和通用引物組合的3步法的PCR擴(kuò)增程序?yàn)槎嘀豍CR提高了特異性和大大降低引物間互相干擾擴(kuò)增效率的影響。第一步10個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增是由嵌合引物中的特異性引物部分引發(fā)，特異性引物結(jié)合在目的基因上引發(fā)原始擴(kuò)增，同時(shí)通用引物經(jīng)過(guò)特別設(shè)計(jì)不會(huì)與常見(jiàn)的生物序列結(jié)合，故不會(huì)出現(xiàn)通用引物引發(fā)的非特異性擴(kuò)增；第二步10個(gè)循環(huán)是由嵌合引物引發(fā)，嵌合引物結(jié)合在之前10個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物的兩端，繼續(xù)進(jìn)行指數(shù)型擴(kuò)增，由于這一步的退火溫度比第一步高13 ℃，特異性引物部分不會(huì)再結(jié)合到原始模板上，保證了嵌合引物整體結(jié)合在前10個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物上；第三步10個(gè)循環(huán)主要是通用引物介導(dǎo)的所有PCR產(chǎn)物的同步擴(kuò)增，通用引物結(jié)合在含有通用引物序列的PCR產(chǎn)物上，最大化降低由于不同特異性引物混合對(duì)擴(kuò)增效率的影響，使所有的PCR產(chǎn)物都得到幾乎相同的擴(kuò)增效率，避免在檢測(cè)臨床樣品時(shí)，某種病毒載量較低時(shí)導(dǎo)致假陰性。

其次，建立的多重GeXP-PCR方法具優(yōu)良的敏感性。多重PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳辨認(rèn)產(chǎn)物片段大小，結(jié)果與預(yù)期片段大小相差1 bp內(nèi)可判斷為陽(yáng)性結(jié)果，如ALV-A的預(yù)期PCR產(chǎn)物片段大小為155 bp，若得到的PCR產(chǎn)物含有154～156 bp的片段，即可認(rèn)為ALV-A檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。GeXP毛細(xì)管電泳后，經(jīng)過(guò)軟件分析，PCR產(chǎn)物以單峰形式呈現(xiàn)，單峰峰值2 000熒光單位(absorbance units，A.U.)以上為陽(yáng)性擴(kuò)增。本研究的敏感性試驗(yàn)中，多重模板的最低檢測(cè)水平為每種模板100 copies·20 μL-1反應(yīng)體系，最小的峰值為9 000 A.U.，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽(yáng)性閾值，說(shuō)明建立的多重GeXP -PCR方法具有優(yōu)良的敏感性。

再次，建立的多重GeXP-PCR方法具高通量的優(yōu)點(diǎn)[16]。GeXP能辨認(rèn)110～400 bp范圍內(nèi)的PCR片段，只要兩個(gè)目的片段之間相差7～10 bp即可分辨，故每個(gè)反應(yīng)可檢測(cè)20個(gè)以上目的基因；應(yīng)用嵌合引物和通用引物的多重PCR，一個(gè)反應(yīng)也可以同時(shí)檢測(cè)8個(gè)以上目的基因[14，23-25]，比傳統(tǒng)的多重PCR或多重定量PCR每個(gè)反應(yīng)檢測(cè)目的基因數(shù)目多一倍以上[26-27]。檢測(cè)一份樣品，只需抽提一次，PCR加樣一次，電泳一次，即可得到8種以上目的基因的檢測(cè)結(jié)果。一個(gè)電泳上樣板為96孔板，操作一次GeXP即可檢測(cè)96份樣品。這在進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)或流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，尤其凸顯其高通量的優(yōu)勢(shì)。

應(yīng)用建立的多重GeXP-PCR方法檢測(cè)300份臨床樣品，同時(shí)用本研究設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行單重定量PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性結(jié)果的準(zhǔn)確性為100%。同時(shí)經(jīng)過(guò)不斷的流行病學(xué)調(diào)查，我們也發(fā)現(xiàn)病毒不斷處于變異的狀態(tài)，故一套多重GeXP-PCR體系將不能長(zhǎng)期滿足臨床檢測(cè)的需求，需要不斷更新病毒序列信息，設(shè)計(jì)更多的引物來(lái)達(dá)到應(yīng)對(duì)病毒不斷變異的要求。

在實(shí)際操作中，MDV和 CIAV 是DNA病毒，ALV (以ALV-A/B/J為主)、REV、IBDV和ARV是RNA病毒，故使用RNA/DNA共提試劑盒進(jìn)行核酸提取，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)核酸中的DNA成分無(wú)影響。同時(shí)ALV和REV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，抽提的DNA中也含有病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄嵌入宿主基因組的前病毒DNA，故進(jìn)行多重PCR檢測(cè)時(shí)，是同時(shí)以ALV和REV的基因組RNA和前病毒DNA為模板。

4　結(jié)　論

本研究建立的基于GeXP多基因表達(dá)分析系統(tǒng)的多重PCR方法，能夠特異、敏感和高通量的鑒別檢測(cè)6種雞免疫抑制病病毒，可以成為臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查時(shí)的有力工具。

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(編輯白永平)

Simultaneous Detecting Six Immunosuppressive Chicken Viruses by a GeXP Analyser-based Multiplex PCR Assay

ZENG Ting-ting，XIE Zhi-xun*，XIE Li-ji，DENG Xian-wen，XIE Zhi-qin，LUO Si-si，HUANG Li，HUANG Jiao-ling

(GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandDiagnostics，

The objective of this research was to develop a novel，high-throughput Genome Lab Gene Expression Profiler Analyser-based multiplex PCR method (GeXP-multiplex PCR) for simultaneous detection of 6 immunosuppressive chicken viruses.Using chimeric primers，6 immunosuppressive chicken viruses，including Marek’s disease virus (MDV)，three subgroups of avian leucosis virus (ALV-A/B/J)，reticuloendotheliosis virus (REV)，infectious bursal disease virus (IBDV)，chicken infectious anaemia virus (CIAV) and avian reovirus (ARV) were amplified and identified by their respective amplicon sizes.The concentration of the chimeric primers，Mg2+andTaq，and annealing temperature，and time were optimised according to the amplification efficiency of the GeXP-multiplex PCR assay.The assay specificity for each immunosuppressive viral target was individually and simultaneously tested with a mixture of 8 sets of chimeric primers in a multiplex PCR assay.Plasmid DNA and transcribed ssRNA were diluted to a final concentration ranging from 105copies·20 μL-1to 1 copy·20 μL-1and then subjected to the GeXP-multiplex PCR assay with 8 sets of chimeric primers，both individually and in pre-mixed solutions.A total of 300 clinic specimens of disease chicken were detected by using GeXP-multiplex PCR.The results were confirmed using independent real-time PCR and sequencing to determine true positives.The specificity and sensitivity of the optimised GeXP-multiplex PCR assay were evaluated，and the data demonstrated that this technique could selectively amplify these 6 viruses at a sensitivity of 100 copies·20 μL-1when all 6 viruses were present.Of the 300 examined clinical specimens，190 were positive for immunosuppressive viruses according to the GeXP-multiplex PCR assay.The GeXP-multiplex PCR assay is a high-throughput，sensitive and specific method for the detection of 6 immunosuppressive viruses that can be used for differential diagnosis and molecular epidemiologic surveys.

GeXP analyser；multiplex PCR；high-throughput；chicken immunosuppressive viruses

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.015

2015-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160512)；廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFCA118006)；廣西特聘專家專項(xiàng)基金 (2011B020)；廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項(xiàng)目(桂漁牧科201452003；201528013)

曾婷婷(1986-)，廣西合浦人，碩士，助理研究員，主要從事禽病原分子生物學(xué)研究，E-mail：tingtingzeng1986@163.com

謝芝勛，研究員，廣西特聘專家，E-mail：xiezhixun@126.com

S858.315.3

A

0366-6964(2016)06-1198-11