周　琪，賀現(xiàn)輝，陽(yáng)巧梅，馮賽祥，樊惠英*，廖　明*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.邵陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，邵陽(yáng) 422000)

?

副豬嗜血桿菌SC096株莢膜多糖抗豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬能力的研究

周琪1，賀現(xiàn)輝1，陽(yáng)巧梅2，馮賽祥1，樊惠英1*，廖明1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.邵陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，邵陽(yáng) 422000)

為探討莢膜多糖在副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)抗豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬中的作用，作者用間接免疫熒光試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)H.parasuisSC096分離株及其莢膜缺陷型菌株進(jìn)行了抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)。間接免疫熒光試驗(yàn)顯示野生菌株組的H.parasuis大多數(shù)存在于巨噬細(xì)胞外，而莢膜多糖缺失突變體則主要存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)應(yīng)的野生型菌株組巨噬細(xì)胞總的吞噬率為12.51%，吞入效率為89.61%；而莢膜多糖缺陷型組巨噬細(xì)胞總的吞噬率為27.18%，吞入效率為91.06%。加入外源莢膜多糖后，野生型菌株組巨噬細(xì)胞總的吞噬率降為2.72%，吞入效率降為32.72%；莢膜多糖缺陷型組巨噬細(xì)胞總的吞噬率降為3.59%，吞入效率基本不變，為91.36%。莢膜多糖缺失后H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬能力降低，表明H.parasuisSC096株莢膜多糖具有抑制巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用。

副豬嗜血桿菌；莢膜多糖；豬肺泡巨噬細(xì)胞；吞噬能力

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)是豬上呼吸道的一種共棲菌，可在特定的條件下入侵機(jī)體而引起嚴(yán)重的全身性疾病[1]。一般認(rèn)為該病的暴發(fā)與豬群的運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素和免疫狀況有著重要關(guān)系[2]。研究發(fā)現(xiàn)莢膜對(duì)其致病過(guò)程起著重要作用，H.parasuis分為有莢膜菌株和無(wú)莢膜菌株，T.Morozumi等通過(guò)十六烷基三甲基溴化銨沉淀和莢膜染色等方法鑒定了H.parasuis的莢膜結(jié)構(gòu)，有莢膜菌株一般是球桿菌樣，而不是通常的棒狀或絲狀，從健康豬上鼻腔分離的H.parasuis菌株多數(shù)具有莢膜，而分離自患病豬的感染的實(shí)質(zhì)性器官等部位的H.parasuis菌株卻只有少數(shù)具有莢膜[3]。有研究表明從健康豬鼻腔中分離的H.parasuis不能有效逃避肺巨噬細(xì)胞的吞噬作用，而在發(fā)病臟器中分離的副豬嗜血桿菌逃避肺巨噬細(xì)胞吞噬的能力更強(qiáng)。同時(shí)，在和肺泡巨噬細(xì)胞作用之后體外傳代丟失的莢膜結(jié)構(gòu)可以恢復(fù)，這暗示了這種莢膜結(jié)構(gòu)可能使副豬嗜血桿菌更有效地逃避肺巨噬細(xì)胞的吞噬，但具體的抗吞噬機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究[4]。莢膜多糖(CPS)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響機(jī)制尚不明確。目前已知細(xì)胞松弛素B會(huì)影響巨噬細(xì)胞的吞噬作用，細(xì)胞松弛素B通過(guò)降解細(xì)胞的微絲來(lái)阻斷吞噬泡的形成，從而抑制細(xì)胞的吞噬[5]。

因此，本研究利用H.parasuisSC096分離株及其莢膜多糖缺陷型菌株和純化的莢膜多糖及細(xì)胞松弛素B分別進(jìn)行抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)，用間接免疫熒光試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬效率，研究莢膜多糖對(duì)H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響，鑒定H.parasuis莢膜多糖功能，為進(jìn)一步開(kāi)展H.parasuis致病機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株與細(xì)胞

副豬嗜血桿菌SC096分離株及其莢膜多糖缺陷型菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)購(gòu)自美國(guó)ATCC(細(xì)胞編號(hào)CRL-2845)。

1.2主要儀器與試劑

流式細(xì)胞儀(貝克曼公司，美國(guó))，顯微鏡(奧林巴斯CX311，日本)，超聲波破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司 JY96-IIn)；TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)和LB培養(yǎng)基為青島海博試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞膜紅色熒光探針 (DiI)為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker PageRulerTMPrestained Protein Ladder SM0671為加拿大 Fermentas公司產(chǎn)品。試驗(yàn)所用抗體見(jiàn)表1。

表1試驗(yàn)所用抗體

Table 1Antibodys used in this study

名稱Name宿主Host來(lái)源SourceH.parasuisSC096capsularpolysaccharidedeficientstrainPolyclonalAntibodyRabbitOurlaboratoryBovineserumalbuminPolyclonalAntibodyMouseMillipore,USAMouseIgGPolyclonalAntibodylinkedFITCGoatMillipore,USARabbitIgGPolyclonalAntibodylinkedFITCGoatMillipore,USAMouseIgGPolyclonalAntibodylinkedPIGoatMillipore,USARabbitIgGPolyclonalAntibodylinkedPIGoatMillipore,USA

1.3細(xì)菌及細(xì)胞培養(yǎng)

副豬嗜血桿菌在TSA上復(fù)蘇，取單菌落接種于TSB中培養(yǎng)12 h作為種子液，將上述種子液按照1%比例接種于新鮮TSB中，37 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)。將PAMs細(xì)胞(CRL-2845)解凍后轉(zhuǎn)移至75 cm2細(xì)胞瓶，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)傳代，按1∶2的比例擴(kuò)增細(xì)胞。

1.4間接免疫熒光檢測(cè)H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

將細(xì)胞傳至12孔培養(yǎng)板中，加入細(xì)胞膜紅色熒光探針 (DiI)。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(約4.0×105·孔-1)時(shí)，分別加入FITC染色的H.parasuisSC096株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株(約1.0×107CFU·孔-1)，37 ℃孵育1 h，再用無(wú)菌預(yù)冷PBS洗5遍，洗去未被吞噬的細(xì)菌。每個(gè)樣品均有重復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。然后用pH 7.4的PBST清洗細(xì)胞3遍，4%多聚甲醛固定20 min。PBST洗滌3次，每次5 min，0.25% Triton X-100作用30 min。PBST洗滌3次，每次5 min，滴加5%脫脂奶粉封閉1 h或者4 ℃過(guò)夜。PBST洗滌3次，每次5 min，分別滴加抗相應(yīng)H.parasuis菌株的一抗，37 ℃濕盒作用1 h或者4 ℃過(guò)夜。PBST洗滌3次，每次5 min，滴加稀釋的FITC標(biāo)記的熒光抗兔二抗，室溫作用1 h。PBST洗滌3次，每次5 min，熒光顯微鏡觀察。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

1.5.1莢膜多糖(CPS)提取及純化將培養(yǎng)好的細(xì)菌用PBS洗兩遍，離心。將細(xì)菌團(tuán)用60 ℃水飽和酚進(jìn)行萃取[6]。30 min后，所得到的苯酚和水相合并，并用蒸餾水透析以除去苯酚。透析液通過(guò)離心澄清并濃縮，冷凍干燥。粗制劑在緩沖液(10 mmol·L-1pH為7.5的Tris-HCl，1 mmol·L-1的氯化鎂，1 mmol·L-1的氯化鈣，50 μg·mL-1核糖核酸酶A和50 μg·mL-1DNA酶Ⅰ)中37 ℃振蕩溫育3 h，加入蛋白酶K 50 μg·mL-160 ℃消化3 h，離心取上清。CPS 100 000 g 離心6 h后，將凝膠樣CPS團(tuán)塊重懸于無(wú)熱原水，凍干。從粗品CPS中去除LPS污染物：將樣品以5 mg·mL-1濃度溶解于2%乙酸，100 ℃孵育2 h。經(jīng)水解的樣品冷卻至室溫，通過(guò)離心澄清將上清液小心地取出并再次透析。將透析后液體冷凍干燥濃縮，凍干的樣品以20 mg·mL-1溶解于PBS中，并過(guò)濾滅菌。純化的CPS進(jìn)行SDS-PAGE并銀染。

1.5.2細(xì)胞的處理參考A.Olvera等的報(bào)道[4]，將H.parasuisSC096株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株與熒光染料FITC孵育1 h著色，洗去多余染料。將細(xì)胞傳至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(約4.0×105·孔-1)時(shí)，分別加入FITC 染色的H.parasuisSC096 株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株(約1.0×107CFU·孔-1)，另一組同時(shí)加入30 μg提純的莢膜多糖(另設(shè)不加莢膜多糖，而是加細(xì)胞松馳素B的對(duì)照)，放回培養(yǎng)箱孵育1 h后，用無(wú)菌預(yù)冷PBS洗5遍，洗去未被吞噬的細(xì)菌。每個(gè)樣品均設(shè)重復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3流式細(xì)胞術(shù)冰上小心刮取細(xì)胞，輕輕將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，800 g離心5 min收集細(xì)胞，用2 mL預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞一次，800 g離心5 min。用2 mL 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞40 min，800 g離心5 min；2 mL PBS重懸細(xì)胞，800 g離心5 min；用1 mL含0.2% Triton-X100和5% 血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置10 min，800 g離心5 min。分別加入H.parasuisSC096 株野生型和莢膜多糖缺陷型菌株抗體，冰上放置40 min，800 g離心5 min，用2 mL冷的PBS 重懸細(xì)胞，800 g離心5 min，洗去未結(jié)合一抗，重復(fù)一次。加入熒光標(biāo)記(PI)的二抗，冰上避光放置40 min后，800 g離心5 min，去上清，PBS洗滌兩次。加入0.5 mL 1%多聚甲醛重懸細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2　結(jié)　果

2.1間接免疫熒光檢測(cè)副豬嗜血桿菌SC096株抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

間接免疫熒光結(jié)果顯示，H.parasuisSC096野生型菌株和肺泡巨噬細(xì)胞孵育后，抗吞噬能力較強(qiáng)，細(xì)菌(綠色)多分布在巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜(棕紅色環(huán))區(qū)域之外(圖1A，白色箭頭所示處)；而莢膜多糖缺陷型菌株抗吞噬能力較弱，細(xì)菌(綠色)多分布在巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜(棕紅色環(huán))區(qū)域之內(nèi)(圖1B，白色箭頭所示處)。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)副豬嗜血桿菌SC096株抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)2.2.1莢膜多糖的提取SDS-PAGE銀染結(jié)果顯示，提取的H.parasuisSC096株莢膜多糖在35 ku處有一個(gè)清晰的條帶，泳道背景清晰，無(wú)其他雜帶(圖2，泳道1)，脂多糖對(duì)照條帶出現(xiàn)在15～25 ku，條帶清晰，泳道背景清晰，無(wú)其他雜帶(圖2，泳道2)。

A.野生型菌株抗巨噬細(xì)胞吞噬，綠色為細(xì)菌，棕紅色環(huán)為巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜，細(xì)菌多在細(xì)胞膜外，見(jiàn)白色箭頭所示；B.莢膜多糖缺陷型菌株抗巨噬細(xì)胞吞噬，綠色為細(xì)菌，棕紅色環(huán)為巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜，細(xì)菌多在細(xì)胞膜內(nèi)，見(jiàn)白色箭頭所示A.Wild-type strain inhibit phagocytosis of macrophages，bacteria are stained green，the cell membrane of macrophages are stained red in circle shape，and most bacteria located outside the membrane (white arrow)；B.Capsular polysaccharide-deficient strain anti-macrophage phagocytosis，bacteria are stained green，the cell membrane of macrophages are stained red in circle shape，and most bacteria located inside the membrane (white arrow)圖1　H.parasuis SC096株野生型及莢膜多糖缺陷型菌株抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)(間接免疫熒光)Fig.1　Anti-macrophage experimental results of H.parasuis SC096 strains wild-type and capsular polysaccharide-deficient strain (By indirect immunofluorescence assay)

M.PageRulerTM Prestained Protein Ladder SM0671；1.H.parasuis SC096株莢膜多糖；2.H.parasuis SC096株脂多糖M.PageRulerTM Prestained Protein Ladder SM0671；1.Capsular polysaccharide of H.parasuis SC096 strain；2.Lipopolysaccharide of H.parasuis SC096 strain圖2　H.parasuis SC096株莢膜多糖提取結(jié)果Fig.2　Capsular polysaccharide of H.parasuis SC096 strain

2.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(表2)，野生型菌株組巨噬細(xì)胞總的吞噬率為12.51%，吞入效率為89.61%；莢膜多糖缺陷型組巨噬細(xì)胞總的吞噬率為27.18%，吞入效率為91.06%。加入外源莢膜多糖后，野生型菌株組巨噬細(xì)胞總的吞噬率降為2.72%，吞入效率降為32.72%；莢膜多糖缺陷型組巨噬細(xì)胞總的吞噬率降為3.59%，吞入效率基本不變，為91.36%。加入和外源莢膜多糖等量的細(xì)胞松弛素B后，野生型菌株組總的吞噬率降為5.52%，莢膜多糖缺陷型降為15.59%。

流式細(xì)胞儀雙通道檢測(cè)結(jié)果顯示為4個(gè)區(qū)間，B1對(duì)應(yīng)紅色熒光，B2對(duì)應(yīng)既有紅色熒光又有綠色熒光，B3對(duì)應(yīng)無(wú)熒光，B4對(duì)應(yīng)只有綠色熒光(圖3)。其中，綠色熒光結(jié)果表示H.parasuis帶有的熒光，紅色熒光為吞噬結(jié)束后抗H.parasuis抗體結(jié)合上的熒光。當(dāng)H.parasuis被巨噬細(xì)胞吞噬吞入到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，則抗體無(wú)法把紅色熒光標(biāo)記到細(xì)菌上，而當(dāng)其被捕獲在巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜上，未被完全吞噬進(jìn)去時(shí)，抗體可以把紅色熒光結(jié)合到細(xì)菌上。即，只有綠色熒光的細(xì)胞為完全吞入H.parasuis的巨噬細(xì)胞，既有紅光又有綠光的為未完全吞入H.parasuis的巨噬細(xì)胞。

表2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H.parasuisSC096株野生型及莢膜多糖缺陷型菌株試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Table 2Statistical results of anti-macrophage by results ofH.parasuisSC096 strains wild-type and capsular polysaccharide-deficient strain (By flow cytometry)

%

A.野生型組；B.野生型+莢膜多糖組；C.野生型+細(xì)胞松弛素B組；D.莢膜多糖缺陷型組；E.莢膜多糖缺陷型+莢膜多糖組；F.莢膜多糖缺陷型+細(xì)胞松弛素B組A.Wild-type；B.Wild-type +CPS；C.Wild-type +Cytochalasin B；D.Capsular polysaccharide-deficient strain；E.Capsular polysaccharide-deficient strain +CPS；F.Capsular polysaccharide-deficient strain +Cytochalasin B圖3　H.parasuis SC096株野生型及莢膜多糖缺陷型菌株抗巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果(流式細(xì)胞術(shù))Fig.3　Anti-macrophage experimental results of H.parasuis SC096 strains wild-type and capsular polysaccharide-deficient strain (By flow cytometry)

3　討　論

莢膜是細(xì)胞壁外包圍的一層黏液性物質(zhì)，有黏附、營(yíng)養(yǎng)、抗干燥、抗吞噬及抗有害物質(zhì)損傷等作用，在細(xì)菌的生存中起重要的作用。莢膜的主要成分是多糖和多肽，多糖有助于細(xì)菌躲避宿主的免疫攻擊，在宿主還沒(méi)有產(chǎn)生特異性抗體時(shí)，莢膜多糖對(duì)抵抗宿主非特異性免疫攻擊起到關(guān)鍵的作用，它能阻礙補(bǔ)體因子與細(xì)菌表面有效的激活因子接觸，從而阻止膜攻擊復(fù)合體(MAC)對(duì)細(xì)菌的攻擊[7-8]。有些細(xì)菌的莢膜多糖可以抑制巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜脂微區(qū)(lipid microdomains)形成，進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力[9]，還有細(xì)菌的莢膜多糖可以與宿主細(xì)胞表面蛋白相互作用，抑制細(xì)胞IL-8的釋放[10]。

副豬嗜血桿菌莢膜多糖合成基因座的位置比較保守，但是不同血清型菌株的基因組成相差較大，莢膜多糖的遺傳和結(jié)構(gòu)差異決定了副豬嗜血桿菌血清型具有多樣性[11]。H.parasuis莢膜通常在抵御宿主補(bǔ)體攻擊中具有作用，有研究發(fā)現(xiàn)高抗血清殺傷的H.parasuis菌株SH0165莢膜多糖基因座上的capD基因是關(guān)鍵的毒力因子，capD缺陷會(huì)使SH0165致病能力下降以及對(duì)補(bǔ)體敏感[12]。莢膜結(jié)構(gòu)對(duì)H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬也有重要作用，A.Olvera等[4]發(fā)現(xiàn)分離自有全身癥狀豬的H.parasuis，在與PAMs細(xì)胞相互作用后可觀察到有明顯的莢膜，這表明在抗吞噬作用中莢膜表面結(jié)構(gòu)發(fā)揮了一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)Wza基因編碼莢膜多糖輸出蛋白[13]，敲除Wza基因的突變株表現(xiàn)出對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬作用更加敏感[14]。關(guān)于莢膜多糖抗巨噬細(xì)胞吞噬的原理，在其他細(xì)菌上也有過(guò)報(bào)道，有的細(xì)菌莢膜靠模擬宿主體內(nèi)成分逃避免疫識(shí)別的方法，進(jìn)而逃避巨噬細(xì)胞的吞噬，有的細(xì)菌莢膜多糖可以抑制巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用[15-17]。

本研究中作者先采用間接免疫熒光法檢測(cè)了PAMs細(xì)胞對(duì)H.parasuisSC096株及其莢膜多糖缺陷型菌株的吞噬情況，發(fā)現(xiàn)H.parasuisSC096株多存在于PAMs細(xì)胞外，而莢膜多糖缺陷型菌株則主要存在于PAMs細(xì)胞內(nèi)，說(shuō)明莢膜多糖缺陷型菌株更易被巨噬細(xì)胞吞噬，其抗吞噬能力較SC096親本株弱。這一結(jié)果表明莢膜多糖缺失后H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬能力降低，莢膜多糖在H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬過(guò)程中可能起重要作用。

作者還運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分別統(tǒng)計(jì)了PAMs細(xì)胞對(duì)SC096野生型菌株及其莢膜多糖缺陷型菌株的吞噬數(shù)。數(shù)據(jù)表明無(wú)論是總的吞噬率還是吞入效率，野生型菌株組均小于莢膜多糖缺陷型菌株組，說(shuō)明莢膜多糖缺失后的菌株更易被巨噬細(xì)胞捕捉和吞噬。加入外源莢膜多糖后，野生型菌株組和莢膜多糖缺陷型菌株組的巨噬細(xì)胞吞噬率都有所降低，說(shuō)明外源的莢膜多糖可以降低巨噬細(xì)胞對(duì)H.parasuis的吞噬效率，抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力，但野生型組的PAMs細(xì)胞吞噬率仍遠(yuǎn)低于莢膜多糖缺陷型組，這提示菌體表面的莢膜結(jié)構(gòu)可以抵御巨噬細(xì)胞的吞噬。另外，細(xì)胞松弛素B可以抑制巨噬細(xì)胞形成吞噬結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制其吞噬能力。加入和外源莢膜多糖等量的細(xì)胞松弛素B后，野生型菌株組和莢膜多糖缺陷型菌株組總的吞噬率也有所降低，但降低程度不如外源莢膜多糖。這提示外源性莢膜多糖抑制巨噬細(xì)胞吞噬的能力強(qiáng)于細(xì)胞松弛素B。研究結(jié)果初步解釋了H.parasuisSC096株莢膜多糖抗巨噬細(xì)胞吞噬的機(jī)制，為進(jìn)一步研究副豬嗜血桿菌的致病機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

4　結(jié)　論

比較H.parasuisSC096株野生型和莢膜缺陷型菌株抗豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬的能力，發(fā)現(xiàn)莢膜丟失后H.parasuis抗巨噬細(xì)胞吞噬的能力下降。H.parasuisSC096株莢膜多糖可以明顯抑制巨噬細(xì)胞對(duì)該菌的吞噬能力。

[1]OLIVEIRA S，PIJOAN C.Haemophilusparasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control[J].VetMicrobiol，2004，99(1)：1-12.

[2]SOLANO G I，SEGALéS J，COLLINS J E，et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSv) interaction withHaemophilusparasuis[J].VetMicrobiol，1997，55(1-4)：247-257.

[3]MOROZUMI T，NICOLET J.Morphological variations ofHaemophilusparasuisstrains[J].JClinMicrobiol，1986，23(1)：138-142.

[4]OLVERA A，BALLESTER M，NOFRARIAS M，et al.Differences in phagocytosis susceptibility inHaemophilusparasuisstrains[J].VetRes，2009，40(3)：24.

[5]李卓婭，GEMSA D，馮新為.細(xì)胞骨架系統(tǒng)對(duì)TNF-α 產(chǎn)生的影響[J].上海免疫學(xué)雜志，1995，15(5)：261-263.

LI Z Y，GEMSA D，F(xiàn)ENG X W.Effect of the cytoskeletal system on TNF-α production[J].ShanghaiJournalofImmunology，1995，15(5)：261-263.(in Chinese)

[6]HEISS C，BURTNICK M N，WANG Z，et al.Structural analysis of capsular polysaccharides expressed byBurkholderiamalleiandBurkholderiapseudomallei[J].CarbohydrRes，2012，349：90-94.

[7]FRANK M M，JOINER K，HAMMER C.The function of antibody and complement in the lysis of bacteria[J].RevInfectDis，1987，9(Suppl 5)：S537-S545.

[8]HOWARD C J，GLYNN A A.The virulence for mice of strains ofEscherichiacolirelated to the effects of K antigens on their resistance to phagocytosis and killing by complement[J].Immunology，1971，20(5)：767-777.

[9]HOUDE M，GOTTSCHALK M，GAGNON F，et al.Streptococcussuiscapsular polysaccharide inhibits phagocytosis through destabilization of lipid microdomains and prevents lactosylceramide-dependent recognition[J].InfectImmun，2012，80(2)：506-517.

[10]SHARMA A，QADRI A.Vi polysaccharide ofSalmonellatyphitargets the prohibitin family of molecules in intestinal epithelial cells and suppresses early inflammatory responses[J].ProcNatlAcadSciUSA，2004，101(50)：17492-17497.

[11]HOWELL K J，WEINERT L A，LUAN S L，et al.Gene content and diversity of the loci encoding biosynthesis of capsular polysaccharides of the 15 serovar reference strains ofHaemophilusparasuis[J].JBacteriol，2013，195(18)：4264-4273.

[12]WANG X，XU X，WU Y，et al.Polysaccharide biosynthesis proteinCapDis a novel pathogenicity-associated determinant ofHaemophilusparasuisinvolved in serum-resistance ability[J].VetMicrobiol，2013，164(1-2)：184-189.

[13]曹瑞娟.副豬嗜血桿菌wza基因在其粘附和抗吞噬中的作用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

CAO R J.The research on adhesion and resisting phagocytosis ofwzainHaemophilusparasuis[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University，2014.(in Chinese)

[14]康磊，李軍星，王一成，等.副豬嗜血桿菌Wza基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，23(6)：806-815.

KANG L，LI J X，WANG Y C，et al.Construction and biological characteristic ofWza-deficient mutant ofHaemophilusparasuis[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2015，23(6)：806-815.(in Chinese)

[15]王斯陽(yáng).肺炎克雷伯桿菌感染小鼠白細(xì)胞IL-10及其mRNA的變化[D].沈陽(yáng)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2012.

WANG S Y.Diversificationin of IL-10 and its mRNA in mice infected withKlebsiellapneumoniae[D].Shenyang：China Medical University，2012.(in Chinese)

[16]李平，譚宏月，胡嬋，等.新生隱球菌GXM的純化及其對(duì)巨噬細(xì)胞甘露糖受體表達(dá)調(diào)節(jié)的研究[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志，2012，7(5)：265-268.

LI P，TAN H Y，HU C，et al.Purification of capsular polysaccharide GXM fromCryptococcusneoformansand it’s role in regulating MR expression in macrophages[J].ChineseJournalofMycology，2012，7(5)：265-268.(in Chinese)

[17]丁丹丹.豬鏈球菌2型cps2E基因缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

DING D D.Construction and characterization ofcps2Edeleted mutants ofStreptococcussuisserotype 2[D].Wuhan：Huazhong Agricultural University，2014.(in Chinese)

(編輯白永平)

Role of Capsular Polysaccharide inHaemophilusparasuisSC096 Strain Anti-Porcine Alveolar Macrophage Phagocytosis

ZHOU Qi1，HE Xian-hui1，YANG Qiao-mei2，F(xiàn)ENG Sai-xiang1，F(xiàn)AN Hui-ying1*，LIAO Ming1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China；2.ShaoyangPolytechnic，Shaoyang422000，China)

The aim of the experiment was to clarify the role of the capsular polysaccharide in anti-porcine alveolar macrophage phagocytosis ofHaemophilusparasuis.The anti-phagocytosis test was conducted by using indirect immunofluorescence method and flow cytometry withH.parasuisSC096 wild-type strain，and capsular deficient strain.The results showed that theH.parasuisSC096 wild-type strains were observed mainly outside the macrophages，while capsular polysaccharide-deficient were observed in macrophages by indirect immunofluorescence experiments.Flow cytometry results showed that the total macrophage phagocytosis rate was 12.51% and swallowed efficiency was 89.61% in the wild-type strain group；the total macrophage phagocytosis rate was 27.18% and swallowed efficiency was 91.06% in the capsular polysaccharide-deficient group.By adding exogenous capsular polysaccharide，total macrophage phagocytosis rate was reduced to 2.72%，swallowed efficiency was reduced to 32.72% in the wild-type strain group；the total macrophage phagocytosis rate dropped to 3.59%，swallowed efficiency was nearly unchanged at 91.36% in the capsular polysaccharide-deficient group.The ability of anti-macrophage phagocytosis ofH.parasuiswas reduced through removing capsular polysaccharide，which demonstrated that capsular polysaccharide may inhibit the ability of macrophage phagocytosis.

Haemophilusparasuis；capsular polysaccharide；porcine alveolar macrophage；phagocytosis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.019

2015-10-21

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303034)；農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)-現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃項(xiàng)目[農(nóng)財(cái)發(fā)(2012)160號(hào)]；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20114404110016)；廣東省"三高"農(nóng)業(yè)專項(xiàng)資金(5500-F15071)

周琪(1991-)，女，江西興國(guó)人，碩士生，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究，E-mail: 15909348676@163.com

廖明，男，教授，E-mail: mliao@scau.edu.cn; 樊惠英，女，教授，E-mail：hyfan@scau.edu.cn

S852.61

A

0366-6964(2016)06-1232-07