左其生，王穎潔，趙瑞豐，程少澤，汪怡臨，靳　鍇，王　飛，

紀艷芹，路鎮(zhèn)宇，張文慧，張亞妮*，李碧春*

(揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009)

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CRISPR/Cas技術(shù)可有效介導(dǎo)家雞基因敲除

左其生，王穎潔，趙瑞豐，程少澤，汪怡臨，靳鍇，王飛，

紀艷芹，路鎮(zhèn)宇，張文慧，張亞妮*，李碧春*

(揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009)

本研究旨在家雞上建立一種高效、穩(wěn)定的基因組定點編輯技術(shù)體系，實現(xiàn)目的基因定點敲除，為后續(xù)家雞基因編輯提供操作依據(jù)?；贜CBI數(shù)據(jù)庫提供的CDS序列克隆C2EIP(chr2，Expression In PGC) 基因全長，并根據(jù)基因序列中APM的位置設(shè)計特異性gRNA1、gRNA2和gRNA3，并構(gòu)建cas9/gRNA載體；將設(shè)計好的cas9/gRNA轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的DF-1，利用Luciferase SSA重組檢測法、T7E1酶切法以及TA克隆測序法檢測gRNA在DF-1細胞中基因的敲除效率。Luciferase SSA重組檢測結(jié)果表明，只有cas9/gRNA3載體具有基因敲除活性，熒光活性比對照組高兩倍，T7E1酶切結(jié)果顯示cas9/gRNA3基因的敲除活性為27%，TA克隆測序結(jié)果表明，30個測序菌液中有8個菌液出現(xiàn)不同數(shù)目的堿基缺失或增加，初步估計基因敲除效率為26%。通過本研究在家雞中初步建立了cas9介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)，該技術(shù)能夠穩(wěn)定的在雞的細胞DF-1上介導(dǎo)基因敲除。

CRISPR/Cas；基因敲除；雞

雞作為經(jīng)典的發(fā)育生物學(xué)模型，因其雞胚獲取方便，數(shù)量大，被廣泛的應(yīng)用于探索基因在細胞分化過程中具體調(diào)控機制的研究[1]。家雞的基因功能驗證目前主要是通過過表達的方式，即通過干細胞介導(dǎo)法來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞或嵌合體雞[2]，但是對家雞的基因敲除目前國內(nèi)外尚無研究。

CRISPR/Cas基因敲除技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于模式動物并能穩(wěn)定的介導(dǎo)基因的敲除。P.Mali等[3]改造了cas9系統(tǒng)以用于人類基因組編輯，并順利地在HEK293和K652細胞中實現(xiàn)基因的靶向敲除。L.Cong等[4]利用cas9系統(tǒng)將小鼠nero2A細胞中的Th基因以及HEK293細胞中的EMX1和PVALB基因?qū)崿F(xiàn)定點敲除。W.Jiang等[5]與P.D.Hsu等[6]對CRISPR系統(tǒng)進行改造后發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)可以在活細胞中啟動任何基因的編輯，該系統(tǒng)還可以鑒定涉及特定疾病的基因，同時利用該系統(tǒng)鑒定了黑色素瘤細胞在抵抗癌癥藥物反應(yīng)過程中的幾個相關(guān)基因。CRISPR系統(tǒng)不僅可以調(diào)控基因的表達，還可以以敲入的方式校正基因的表達，Y.Wu等[7]利用CRISPR系統(tǒng)成功將小鼠白內(nèi)障遺傳病治愈，G.Schwank等[8]利用該技術(shù)校正人干細胞中一種與囊腫性纖維化相關(guān)聯(lián)的基因缺陷。雖然cas9介導(dǎo)的基因編輯工具已經(jīng)廣泛的用于人[9]、小鼠[10]、斑馬魚[11-12]等物種，而且在植物上也有廣泛的應(yīng)用[13]，但是該方法在家禽細胞中的應(yīng)用尚未見報道。

雞作為家禽生物的代表，一直被應(yīng)用于生殖細胞發(fā)育分化的研究。本實驗室一直致力于雞雄性生殖細胞分化調(diào)控機制的研究，目前已完成雞雄性生殖細胞發(fā)育分化過程中的轉(zhuǎn)錄組測序，并對調(diào)控這一過程的關(guān)鍵基因進行了篩選[14]，為了進一步研究這些基因的功能，對這些基因進行基因組水平編輯已成為必要。基于此，本試驗擬在雞上建立一種以CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的能夠穩(wěn)定敲除基因的新方法，為雞中進行基因敲除提供操作依據(jù)，并能為構(gòu)建雞雄性生殖細胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示生殖細胞形成機制提供試驗基礎(chǔ)。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料

DF-1細胞由本實驗室購買并保存；Luciferase-SSA載體由本試驗構(gòu)建并保存；VK001-08(gRNA/Cas9表達質(zhì)粒，CU6啟動gRNA表達，CMV啟動Cas9蛋白表達)購自北京唯尚立德公司。

1.2試驗方法1.2.1C2EIP基因克隆與靶位點選擇通過NCBI提供的CDS序列，設(shè)計引物克隆候選基因全長。引物序列，F(xiàn)：5′-GAGGCTATCAAATGGCAG-3′，R：5′-ACACCCAATGAAAATAAAT-3′。根據(jù)PAM定位克隆的CDS序列，篩選并設(shè)計3個靶位點序列，分別命名為gRNA1、gRNA2和gRNA3，并將靶位點序列進行BLAST比對，確保gRNA的靶向性，不會靶向作用其他無關(guān)基因。具體信息見表1。

表1gRNA靶位點核苷酸序列

Table 1Nucleotide sequence of gRNA to target site

名稱NamegRNA序列SequenceofgRNAPAMgRNA1CTTTTCTGTGCCATTCTCCAAGGgRNA2AGCACAGAGGAGTTCCTCTGAGGgRNA3TTGGATTGACATTACTCTGTAGG

1.2.2cas9/gRNA表達載體構(gòu)建根據(jù)選擇的gRNA分別設(shè)oligo引物，引物分別為5′AAACACCG-gRNA-1，5′CTCTAAAAC-gRNA-1-anti；5′AAACACCG-gRNA-2，5′CTCTAAAAC-gRNA-2-anti；5′AAACACCG-gRNA-3，5′CTCTAAAAC-gRNA-3-anti。步驟1：將正義鏈和反義鏈進行退火處理形成雙鏈，形成oligo二聚體，退火體系為正、反義鏈各1 μL，Solution I(2×) 1 μL，H2O 3 μL。退火程序：95 ℃ 5 min，自然冷卻至16 ℃，16 ℃ 10 min。步驟2：oligo二聚體插入載體，反應(yīng)體系為：VK001-8載體 1 μL，oligo二聚體2 μL，H2O 7 μL。反應(yīng)程序：25 ℃靜置5 min。取步驟2的最終產(chǎn)物5～10 μL加入到剛解凍的50 μL DH5α感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30 min后，42 ℃熱激90 s，冰上靜置2 min，直接涂于氨芐抗性的平板。 12 h后挑3～5個白色菌落搖菌，提取質(zhì)粒DNA進行測序。測序引物：sqprimer：TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG。

1.2.3DF-1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染DF-1細胞為雞胚胎成纖維細胞的細胞系，在含有15%胎牛血清和雙抗的DMEM中生長，細胞培養(yǎng)過程中1～2 d換液1次，當細胞的匯合度達到85%左右時，用PBS洗滌3遍，胰酶消化3 min，加入有血清的培養(yǎng)基終止消化，消化后的細胞收集到15 mL離心管中，1 200 r·min-1離心6 min，離心后棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸吹打200次，接種至24孔板，接種細胞數(shù)為105個。第2天當細胞生長匯合度達60%左右進行轉(zhuǎn)染試驗，轉(zhuǎn)染試劑為Fugene，轉(zhuǎn)染條件為Fugene(V)∶質(zhì)粒(μg)=3∶1，轉(zhuǎn)染后48 h進行流式細胞分選獲取細胞并提取基因組。

1.2.4Luciferase-SSA報告載體活性檢測將終止子和靶位點插入Luciferase載體中，靶位點位于終止子前，以FUGENE為轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染CRISPR/gRNA載體，以及新構(gòu)建的Luciferase報告基因和內(nèi)參donor質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染空載體，檢測Luciferase信號(圖1)。具體的工作原理：在cas9/ sgRNA的作用下，靶點位置將會產(chǎn)生DSB，細胞通過同源重組方式修復(fù)DNA，形成一個有活性的Luciferase，通過多功能酶標儀檢測Luciferase活性。

圖1　Luciferase-SSA報告載體活性檢測結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　The structural representation of the detection of Luciferase-SSA activity

1.2.5T7E1酶切試驗 T7 核酸內(nèi)切酶 I (T7 endonuclease I，T7E1 )能夠識別不完全配對DNA并對其進行切割，可用于檢測CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變。對去轉(zhuǎn)染后流式細胞分選的細胞提取基因組，以未轉(zhuǎn)染的細胞為對照。根據(jù)靶位點在基因組中的位置在靶位點前后各250 bp左右設(shè)計引物，并擴增總長500 bp左右的片段，引物序列，F(xiàn)：5′CCTGCCCTTTACTTCGGGG3′，R：5′TGTTCCTCAAAATGCCGTGG3′，對擴增獲得的片段進行98 ℃解鏈，自然冷卻至室溫，添加T7E1酶進行酶切，酶切體系為T7E1酶 1 μL，buffer 1 μL，擴增片段800 ng，H2O補足10 μL。酶切條件：37 ℃ 30 min，4 ℃保存。酶切后通過2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察試驗結(jié)果。計算公式：突變產(chǎn)物剪切條帶灰度值/(突變產(chǎn)物剪切條帶灰度值+未突變條帶灰度值)。

1.2.6TA克隆測序分析CRISPR/Cas9基因敲除載體轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的DF-1，48 h后流式細胞術(shù)篩選出GFP陽性細胞，提取基因組DNA，設(shè)計引物，克隆出靶位點前后各250 bp共計500 bp左右片段，進行TA克隆，挑菌測序并與原始序列進行對比，計算CRISPR/Cas9基因敲除載體的具體效率，計算方法：序列發(fā)生突變的菌液數(shù)/全部測序菌液數(shù)×100%。

2　結(jié)　果

2.1C2EIP基因克隆與cas9/gRNA表達載體構(gòu)建

以雞原始生殖干細胞cDNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫C2EIP的CDS序列設(shè)計引物克隆該基因，序列全長為714 bp(圖2A)，經(jīng)測序結(jié)果正確。根據(jù)測序后的序列設(shè)計3條靶位點，同時設(shè)計靶位點序列的oligo引物，通過退火雜交并與cas9/gRNA表達載體進行連接，測序結(jié)果表明gRNA1、gRNA2和gRNA3已經(jīng)完整的連入載體(圖2B)。

2.2Luciferase-SSA報告載體法檢測cas9/gRNA載體基因敲除活性

為了檢測構(gòu)建的cas9/gRNA基因敲除載體是否具有敲除活性，將敲除載體與Luciferase-SSA報告載體以及donor載體共轉(zhuǎn)染DF-1細胞(圖3A)，48 h后收集細胞檢測Luciferase活性，結(jié)果顯示，gRNA1和gRNA2載體Luciferase的活性與未轉(zhuǎn)染組之間沒有顯著差異，但是gRNA3的熒光活性值與對照組相比增加2倍左右(圖3B)。這說明cas9/gRNA-3載體能夠有效的敲除Luciferase-SSA報告載體中對應(yīng)的靶位點，Luciferase-SSA報告載體通過同源末端重組形成完整的Luciferase。

A.C2EIP克隆結(jié)果；B.gRNAs(下劃線)連入cas9/gRNA載體后的測序結(jié)果A.The cloning result of C2EIP；B.The result of the gRNAs(with underline) connected into cas9/gRNA vector successfully圖2　C2EIP基因克隆和cas9/gRNA載體構(gòu)建Fig.2　C2EIP gene cloning and construction of cas9/gRNA vector

A.cas9/gRNA基因敲除載體轉(zhuǎn)染DF-1細胞示意圖(200×)；B. Luciferase-SSA報告載體法檢測結(jié)果。**.P<0.01A. The cas9/gRNA knockout vector transfected into DF-1(200×); B. The result of SSA .**.P<0.01圖3　cas9/gRNA載體基因敲除活性檢測Fig.3　Activity detection of cas9/gRNA vector

2.3T7E1酶切檢測靶向C2EIP cas9/gRNA3的活性

將cas9/gRNA3載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DF-1，48 h后收集細胞，提取基因組，通過PCR擴增gRNA3附近424 bp片段，通過T7E1酶切方法進一步檢測cas9/gRNA3載體的活性。從圖4可以看出，在cas9/gRNA3試驗組能清楚的檢測到酶切后200 bp左右的片段，而在對照組則沒有，將cas9/gRNA3試驗組和對照組的樣進行混合后也能觀察到200 bp左右的片段。通過條帶的灰度值估算活性約為27%。

圖4　T7E1酶切檢測結(jié)果Fig.4　The result of T7E1 enzyme digestion

2.4TA克隆測序分析cas9/gRNA3基因敲除效率

在試驗2.3中克隆純化424 bp片段，進行TA載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α并在氨芐培養(yǎng)基上涂板，14 h左右進行挑菌測序，測序結(jié)果表明，測序的30管菌液中有8管菌液發(fā)生了突變，初步估計基因敲除效率為26%左右(圖5)。

圖5　TA克隆測序檢測cas9/gRNA3載體的基因敲除效率Fig.5　Sequencing of TA clone dected the activity of cas9/gRNA3

3　討　論

從CRISPR/Cas發(fā)現(xiàn)至今，這項技術(shù)已經(jīng)被廣泛的用在動物的細胞水平或者個體水平的基礎(chǔ)研究，也已經(jīng)在HEK293細胞、iPS等細胞中產(chǎn)生了穩(wěn)定的敲除細胞株，另外科研人員也利用了顯微注射等方法獲得小鼠、大鼠和斑馬魚等模式動物的敲除個體并順利產(chǎn)生后代。M.Jinek等[15-16]以人類細胞為試驗材料進行基因的靶向修飾，試驗中篩選的細胞順利產(chǎn)生DSB，說明cas9系統(tǒng)可應(yīng)用于人類細胞。S.W.Cho等[17-18]以人的細胞為試驗材料，通過試驗證明在共轉(zhuǎn)染體系中g(shù)RNA濃度的增加能夠提高基因的敲除效率，最高效率達到33%。P.Mail[3]等人改造了cas9系統(tǒng)以用于人類基因組編輯，并順利地在HEK293和K652細胞中實現(xiàn)基因的靶向敲除。L.Cong等[4]利用cas9系統(tǒng)在小鼠nero2A細胞中的Th基因以及HEK293細胞的EMX1基因和PVALB基因?qū)崿F(xiàn)定點敲除。P.Mali等[3]通過試驗表明，gRNA在結(jié)構(gòu)上越接近crRNA和tracrRNA復(fù)合體，則在試驗過程中能夠獲得較高的敲除效率。目前利用cas9進行基因敲除的技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，利用此技術(shù)在細胞中可實現(xiàn)單基因或者多基因的敲除。P.Mail等[3]利用此技術(shù)在人的細胞中實現(xiàn)了基因的敲除，靶向敲除效率：HEK 293為10%～25%，K562為8%～13%，iPS為2%～49%；H.Yang等[19]通過共轉(zhuǎn)染的方法在小鼠的胚胎干細胞中對Tet1、Tet2、Tet3、Uty和Sry等基因?qū)崿F(xiàn)了單基因、雙基因及多基因的敲除，敲除效率達40%左右，并通過測序、RFLP以及DNA印跡等方法進行了驗證。Z.Zhang等[14]也在人和小鼠的細胞中實現(xiàn)了多基因的同時敲除。多基因敲除試驗的成功將有利于科研人員在體內(nèi)研究冗余基因以及上位基因的功能。Z.Zhang等[14]通過該技術(shù)在不同細胞上研究后認為，Cas9/gRNA技術(shù)能夠用于任何細胞并完成基因編輯，然而其所用的試驗材料都以哺乳動物建系的細胞為試驗基礎(chǔ)，在其他物種上并未進行系統(tǒng)的驗證，尤其是鳥類。

為了驗證cas9/gRNA系統(tǒng)能否在家禽上對基因進行精確的基因敲除，本試驗以雞胚成纖維建系細胞DF-1為試驗材料，系統(tǒng)的驗證了cas9/gRNA系統(tǒng)在家禽細胞中介導(dǎo)基因敲除情況。試驗結(jié)果表明，cas9/gRNA系統(tǒng)在雞的DF-1 細胞中能夠介導(dǎo)基因敲除，且基因的敲除效率為26%～27%，這表明該系統(tǒng)在家雞細胞中能夠穩(wěn)定應(yīng)用。雖然目前大量的研究表明,cas9/gRNA在哺乳動物、植物上介導(dǎo)基因的敲除效率能夠達到40%～80%，但是由于本試驗首次在雞上進行，技術(shù)和細胞質(zhì)量成為限制本試驗基因敲除效率的重要因素。本試驗的研究結(jié)果能夠充分的表明cas9/gRNA系統(tǒng)能夠在雞上進行基因編輯，介導(dǎo)基因敲除，這為cas9/gRNA系統(tǒng)的應(yīng)用前景開辟了一個全新的領(lǐng)域，也進一步的為基因功能驗證提供了一種新的方法和思路。

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(編輯郭云雁)

CRISPR/Cas Techniques Can Knockout the Gene of Chicken Effectively

ZUO Qi-sheng，WANG Ying-jie，ZHAO Rui-feng，CHENG Shao-ze，WANG Yi-lin，JIN Kai，WANG Fei，JI Yan-qin，LU Zhen-yu，ZHANG Wen-hui，ZHANG Ya-ni*，LI Bi-chun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

This study aimed to establish a highly efficient and stable gene editing technique mediated by CRISPR/Cas to knock out the targeted gene，and explore its application in chicken preliminarily，and to provide the operation basis for the subsequent poultry genetic edition.We cloned the full-length ofC2EIP(chr2，Expression in PGC) gene according to sequence in NCBI Database，and designed 3 gRNAs named gRNA1，gRNA2 and gRNA3 based on the location of APM in the sequence to construct the cas9/gRNA vector.SSA activity assay，T7E1 digestion method and sequencing of TA cloning were used to detect the knock-out efficiency of the gRNA after the cas9/gRNA vector transfected into DF-1.Results of SSA activity assay showed that only cas9/gRNA3 vector could knock out the gene effectively，fluorescence activity which transfected cas9/gRNA3 was twice higher than the control group；Result of T7E1 digestion showed that activity of cas9/gRNA3 was 27%，sequencing of TA cloning results showed there were 8 mutational samples in 30 samples，and the efficiency of gene-knockout was 26%.In this study we established the technology of gene knockout mediated by CRISPR/Cas in chicken，which can be used to konck out genes in DF-1 stably.

CRISPR/Cas；gene knockout；chicken

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.024

2015-10-08

國家自然科學(xué)基金(31301959；31272429；31472087)；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金資助課題(20123250120009)；中國博士后基金(2012M511326；2014T70550)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201411117033Z)

左其生(1992-)，男，江蘇鹽城人，博士生，主要從事動物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：744366503@qq.com

李碧春，教授，博士，主要從事動物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn；張亞妮，副教授，博士，主要從事動物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：ynzhang@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2016)06-1266-06