茍惠天，薛慧文，殷　宏，孫曉林*，羅建勛*

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

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基于COⅠ基因序列對(duì)我國(guó)部分巴貝斯蟲分類的研究

茍惠天1，薛慧文1，殷宏2，孫曉林1*，羅建勛2*

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

為了確定巴貝斯蟲中國(guó)分離株的分類地位，對(duì)我國(guó)報(bào)道的7種巴貝斯蟲11個(gè)地方分離株的COⅠ基因序列進(jìn)行測(cè)定；并與GenBank中其他巴貝斯蟲COⅠ和相應(yīng)18S rRNA基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，比較基于不同基因的分類結(jié)果。結(jié)果顯示：11株巴貝斯蟲的COⅠ基因大小在935～999 bp，與18S rRNA基因比較，COⅠ基因序列含有較多的變異位點(diǎn)及簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；基于兩個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)于牛巴貝斯蟲的分類結(jié)果基本一致。但也存在如下差異：18S rRNA無(wú)法將泰勒蟲與巴貝斯蟲進(jìn)行區(qū)分，而COⅠ基因可明顯區(qū)分；羊巴貝斯蟲新疆未定種的分類地位在基于COⅠ基因的分類中更具合理性。來(lái)源于COⅠ和18S rRNA的信息都說(shuō)明我國(guó)莫氏巴貝斯蟲的不同地方株間可能存在亞種關(guān)系。該研究為巴貝斯蟲的分子分類提供了候選基因。

巴貝斯蟲；分類；系統(tǒng)發(fā)育樹；COⅠ基因

巴貝斯蟲(Babesiaspp.)屬于頂復(fù)門、梨形蟲綱、巴貝斯蟲科、巴貝斯蟲屬，是一類能引起人和動(dòng)物巴貝斯蟲病的蜱傳性血液原蟲。該病呈全球分布，給公共健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)重大影響[1]。在中國(guó)引起牛巴貝斯蟲病的病原有雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、卵形巴貝斯蟲(B.ovata)、大巴貝斯蟲(B.major)、東方巴貝斯蟲(B.orientalis)和巴貝斯蟲未定種喀什分離株(BabesiaU sp.Kashi)。已證實(shí)微小扇頭蜱、長(zhǎng)角血蜱、刻點(diǎn)血蜱、鐮形扇頭蜱、小亞璃眼蜱及其他一些硬蜱可以傳播這些巴貝斯蟲[2-3]。引起羊巴貝斯蟲病的病原有綿羊巴貝斯蟲(B.ovis)、莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)和巴貝斯蟲未定種新疆分離株(Babesiasp.Xinjiang)；已知青海血蜱、長(zhǎng)角血蜱和小亞璃眼蜱是以上三種巴貝斯蟲的傳播媒介[4-5]。

近年來(lái)，18S rRNA作為分子標(biāo)記在巴貝斯蟲的研究中得到了廣泛應(yīng)用[6]。但是由于物種多樣性以及單個(gè)標(biāo)記基因很難真實(shí)反映物種間的進(jìn)化關(guān)系。所以一些新的標(biāo)記基因也被用于此類研究，諸如轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)及主要表面蛋白基因(MPSP)的應(yīng)用[7-8]。細(xì)胞色素C氧化酶基因Ⅰ(COⅠ)作為線粒體基因組的重要組成部分，較之于核糖體基因，更能真實(shí)地反映物種的遺傳信息，因此近年來(lái)被廣泛地用于物種的系統(tǒng)進(jìn)化分析及生物條形碼研究中[9-10]。但迄今為止，有關(guān)以COⅠ作為標(biāo)記基因?qū)Π拓愃瓜x的進(jìn)化分析的研究，在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有報(bào)道。筆者試圖通過(guò)比較基于兩個(gè)分類基因COⅠ和18S rRNA在巴貝斯蟲中的進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)一步了解巴貝斯蟲不同蟲株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系[11]。

1　材料與方法

1.1蟲株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)涉及的11株巴貝斯蟲均分離自中國(guó)。包括六株牛巴貝斯蟲和五株羊巴貝斯蟲。以上蟲株在實(shí)驗(yàn)室液氮保存，詳細(xì)資料見(jiàn)表1。

6～12月齡的黃牛和綿羊購(gòu)自無(wú)巴貝斯蟲病報(bào)道的地區(qū)。在試驗(yàn)前30 d所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物摘除脾。在試驗(yàn)前10 d，所有的動(dòng)物取耳尖血制備涂片，再次檢查是否有巴貝斯蟲感染。只有檢查結(jié)果為陰性的動(dòng)物，方可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2DNA提取、目的基因擴(kuò)增及測(cè)序

對(duì)6只黃牛和5只綿羊分別感染含有不同巴貝斯蟲分離株的蟲血各10 mL。當(dāng)染蟲率大于5%時(shí)，靜脈采血，分離紅細(xì)胞。使用DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國(guó))進(jìn)行巴貝斯蟲基因組的提取，方法按說(shuō)明書操作，分光光度計(jì)測(cè)算DNA的濃度。以未感染梨形蟲的動(dòng)物血液作為陰性對(duì)照。

利用GenBank已公布的巴貝斯蟲COⅠ基因的序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。BaF1(ORF第91位)：5′-ATAGGATTCTATATGAGTAT-3′，BaR1(ORF第1 318位)：5′-ATAATCAGGTATTCTCCTTGG-3′；BaF2(ORF第190位)：5′-TCTCTTCATGGTTTAATTATGATAT-3′，BaR2(ORF第1 315位)：5′-TA-GCTCCAATTGATAAAACAAAGTG-3′。PCR擴(kuò)增按照50 μL體系進(jìn)行，其中基因組DNA 100 ng，上下游引物各1 pmol·L-1，dNTP 160 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶1 U，MgCl21.75 mmol·L-1，最后用滅菌水補(bǔ)足50 μL，以上試劑均購(gòu)自大連寶生物公司。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃或58 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min，最后4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物再進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

切膠純化PCR產(chǎn)物，然后將目的片段克隆到pGEM-T easy載體(Promega，美國(guó))。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，每株巴貝斯蟲送5個(gè)鑒定為陽(yáng)性的克隆到測(cè)序公司，用ABI 3730進(jìn)行序列測(cè)定。另外，對(duì)測(cè)序巴貝斯蟲的相應(yīng)18S rRNA基因序列，分別從GenBank中進(jìn)行下載。

1.3序列比對(duì)和進(jìn)化分析

使用Lasergene軟件包中的SeqMan對(duì)每一條測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，并將拼接結(jié)果在NCBI中作BLAST比對(duì)，檢測(cè)是否混雜有其他DNA。同時(shí)以兩株泰勒蟲(Theileriaparva和Theileriasergenti)的COⅠ基因序列作為外群。使用MEGA4中的多序列比對(duì)方法，分別對(duì)COⅠ和18S rRNA兩組序列進(jìn)行比對(duì)，使用K2-P方法計(jì)算遺傳距離[12]。用最大簡(jiǎn)約法(MP)和貝葉斯法(BI)分別針對(duì)COⅠ和18S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在最大簡(jiǎn)約法中，使用TBR啟發(fā)式搜索的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，空位被視為缺失，顛換和轉(zhuǎn)換具有相等的權(quán)重，自展分析次數(shù)為1 000[13]。在貝葉斯法中，分析采用GTR+I+Γ模型，四條鏈分別進(jìn)行計(jì)算，COⅠ和18S rRNA各運(yùn)算2.0×105代后數(shù)據(jù)得到收斂[14]。最后將兩種方法產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)育樹用Tree View軟件顯示，并進(jìn)一步編輯。

2　結(jié)　果

2.1COⅠ基因的擴(kuò)增

從11株巴貝斯蟲基因組中均擴(kuò)增到COⅠ基因序列，大小為935～999 bp，經(jīng)Blast N比對(duì)無(wú)誤后登錄GenBank，序列號(hào)見(jiàn)表1。

表1本研究中所用到COⅠ 和18S rRNA的序列信息

Table 1Origins of the piroplasma and GenBank accession numbers for theCOⅠ and 18S rRNA gene used in this study

名稱Species分離地Origin宿主Host序列Type長(zhǎng)度/bpLength登錄號(hào)GenBanknumber序列來(lái)源SequenceSourceB.major中國(guó)新疆中國(guó)新疆牛COⅠ18S9351693JQ518310AY603399本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.ovata中國(guó)河南中國(guó)河南牛COⅠ18S9761685JQ518306AY603401本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.ovata中國(guó)甘肅中國(guó)甘肅牛COⅠ18S9771687JQ518307AY603400本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.bigemina中國(guó)云南中國(guó)云南牛COⅠ18S9771693JQ518300AY603402本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.bigemina日本中國(guó)牛COⅠ18S14321693AB499085HQ840960GenBank中下載GenBank中下載B.bovis中國(guó)河南中國(guó)河南牛COⅠ18S9641653JQ518301AY603398本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.bovis日本美國(guó)牛COⅠ18S14341588AB499088HQ264112GenBank中下載GenBank中下載B.bovis美國(guó)美國(guó)牛COⅠ18S14341588EU075182HQ264111GenBank中下載GenBank中下載BabesiaUsp.中國(guó)新疆中國(guó)新疆牛COⅠ18S9771689JQ518308AY726556本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.motasi中國(guó)甘肅中國(guó)甘肅羊COⅠ18S9771683JQ518302AY260181本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.motasi中國(guó)甘肅中國(guó)甘肅羊COⅠ18S9771687JQ518303AY260182本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.motasi中國(guó)甘肅中國(guó)甘肅羊COⅠ18S9771680JQ518304DQ159072本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.motasi中國(guó)河北中國(guó)河北羊COⅠ18S9771683JQ518305DQ159074本研究擴(kuò)增GenBank中下載Babesiasp.中國(guó)新疆中國(guó)新疆羊COⅠ18S9761715JN391437DQ159073本研究擴(kuò)增GenBank中下載B.caballi南非南非馬COⅠ18S14341694AB499086Z15104GenBank中下載GenBank中下載B.gibsoni日本日本狗COⅠ18S14341707AB499087EU084677GenBank中下載GenBank中下載T.parva日本日本水牛COⅠ18S14391583AB499089HQ895969GenBank中下載GenBank中下載

2.2COⅠ基因和18S rRNA基因的序列比對(duì)

從GenBank中下載到18S rRNA基因的大小為1 583～1 715 bp。所有序列經(jīng)Claustal W比對(duì)后，得出18S rRNA基因含有1 563個(gè)信息位點(diǎn)，其中變異位點(diǎn)308個(gè)，248個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；COⅠ基因中含有923個(gè)信息位點(diǎn)，其中變異位點(diǎn)354個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)281個(gè)?；趦蓚€(gè)基因不同種之間，同一種不同分離株之間的序列相似性見(jiàn)表2。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了確定巴貝斯蟲的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，分別對(duì)COⅠ和18S rRNA基因序列用MP法和BI法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。由于每一個(gè)基因其MP樹和BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)幾乎一致，所以用合一樹來(lái)表示。圖1中A、B分別代表COⅠ和18S rRNA的合一樹。通過(guò)比較，基于兩個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，都能真實(shí)反應(yīng)牛巴貝斯蟲間的分類地位。但也存在如下差異：發(fā)現(xiàn)18S無(wú)法將泰勒蟲與巴貝斯蟲進(jìn)行很好區(qū)分，而COⅠ基因可明顯區(qū)分；羊巴貝斯蟲新疆未定種的分類地位在兩個(gè)發(fā)育樹中存在較大差異。

表2巴貝斯蟲中國(guó)分離株COⅠ和18S rRNA基因序列的相似性比對(duì)

Table 2Sequence similarity ofCOⅠand 18S rRNA ofBabesiaspp.from China isolates

%

3　討　論

國(guó)內(nèi)外有關(guān)巴貝斯蟲的分子分類學(xué)研究主要依靠18S rRNA基因。但近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示，18S rRNA作為分類基因在科或更高階元的研究時(shí)，顯示出一定優(yōu)勢(shì)；在本研究中，18S rRNA變異位點(diǎn)主要集中在少數(shù)幾個(gè)區(qū)域，如：第157—216位，第568—625位，第701—733位，第1 233—1 259位，其余部位則為高度保守。由于其序列的高度保守性，在區(qū)分親緣關(guān)系很近的物種(屬以下)時(shí)，其結(jié)果不甚理想。線粒體基因組，特別是COⅠ基因，因其獨(dú)立的進(jìn)化機(jī)制，在很大程度上保證了物種遺傳信息的真實(shí)性。另外，具有適度的序列變異性，使其在任何分類階元中都可使用。因此，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者將其作為新的分類基因。國(guó)際DNA條形碼聯(lián)盟更是推薦COⅠ為首選基因，進(jìn)行物種的分子分類。與18S rRNA比較，COⅠ基因的變異位點(diǎn)比例更高，但整段序列并沒(méi)有明顯的保守區(qū)和變異區(qū)，而是變異位點(diǎn)和保守位點(diǎn)交替排列。因此，基于COⅠ基因的巴貝斯蟲分類，能夠更清楚地反映出巴貝斯蟲與泰勒蟲的分類地位，不同宿主巴貝斯蟲之間、同一種巴貝斯蟲不同分離株間的關(guān)系[15]。

有關(guān)羊的巴貝斯蟲在之前的研究中主要有兩種：莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)和羊巴貝斯蟲(B.ovis)，其傳播媒介分別是刻點(diǎn)血蜱和囊性扇頭蜱，隨后的研究發(fā)現(xiàn)粗糙巴貝斯蟲(B.crassa)也可感染羊。有關(guān)莫氏巴貝斯蟲的分類，有學(xué)者認(rèn)為其存在亞種。Uilenberg提出至少可以將歐洲的巴貝斯蟲分為高致病性和低致病性兩個(gè)類群[16-17]。筆者實(shí)驗(yàn)室在過(guò)去的研究中，從不同地區(qū)綿羊和山羊的血液樣品中曾分離到幾株大型巴貝斯蟲[4，18]。這些巴貝斯蟲后來(lái)被命名為莫氏巴貝斯蟲臨潭株(B.motasiLintan)、莫氏巴貝斯蟲寧縣株(B.motasiNingxian)、莫氏巴貝斯蟲天祝株(B.motasiTianzhu)和莫氏巴貝斯蟲河北株(B.motasiHebei)。通過(guò)COⅠ系統(tǒng)發(fā)育樹，可以看到臨潭株和天祝株落在一個(gè)分枝中，河北株和寧縣株在另一分枝中。該結(jié)果與18S rRNA的進(jìn)化樹不太一致，但是與ITS分析的結(jié)果相一致。寧縣株是從甘肅省東部地區(qū)的綿羊血液之中分離得到的，對(duì)綿羊和山羊具有高致病性，其形狀與歐洲的莫氏巴貝斯蟲非常相似，長(zhǎng)角血蜱是已知該巴貝斯蟲的傳播媒介。臨潭株可被青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱傳播，并且具有低致病性。河北株和天祝株的生物學(xué)特性尚不十分清楚，但是它們都分離自血蜱屬分布的地區(qū)[17]。此外，以臨潭株體外培養(yǎng)物經(jīng)純化后作為抗原，進(jìn)行的ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示，與寧縣株和河北株的陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，但卻可以與天祝株的陽(yáng)性血清具有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)[19]。以上結(jié)果說(shuō)明我國(guó)莫氏巴貝斯蟲的不同地方株間很可能存在亞種關(guān)系。

A.COⅠ基因序列；B.18S rRNA基因序列；系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用MP和BI兩種計(jì)算方法，節(jié)點(diǎn)數(shù)字分別表示自展值和后驗(yàn)概率；兩株泰勒蟲作為外群These trees were calculated using the BI and MP methods.Trees were constructed with COⅠ sequences (A) and 18S rRNA sequences (B).The bootstrap values supporting and posterior probability each node are shown.Two Theileria isolates were usedas outgroup圖1　基于COⅠ和18S rRNA基因的巴貝斯蟲系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Phylogenetic trees of Babesia isolates based on their COⅠand 18S rRNA genes

巴貝斯蟲新疆未定種(Babesiasp.Xinjiang)是筆者實(shí)驗(yàn)室于2001年從新疆采集的血紅扇頭蜱和小亞璃眼蜱，感染綿羊后，經(jīng)由羊血中分離得到的一種巴貝斯蟲。綜合形態(tài)學(xué)觀察，傳播試驗(yàn)等生物學(xué)特性，確定該巴貝斯蟲是獨(dú)立于莫氏巴貝斯蟲、綿羊巴貝斯蟲、粗糙巴貝斯蟲之外的一個(gè)新種[17]。本研究中，基于18S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹中，Babesiasp.Xinjiang與其他四株羊巴貝斯蟲的位置較遠(yuǎn)，反而與一株同樣分離自新疆，感染牛的巴貝斯蟲(Babesiasp.Kashi)歸為一支。該結(jié)果的出現(xiàn)可能與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用的序列相關(guān)。而在基于COⅠ的系統(tǒng)發(fā)育樹中，該未定種與莫氏巴貝斯蟲歸為一支，并位于致病性不同的四株莫氏巴貝斯蟲之間，顯示與莫氏巴貝斯蟲存在很近的遺傳關(guān)系。綜合以上18S rRNA和COⅠ的結(jié)果，都未能真實(shí)反應(yīng)該巴貝斯蟲未定種的分類地位。因此，對(duì)于該未定種的命名還需更多生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行佐證[11]。

總之，與之前基于18S rRNA和其他基因的研究結(jié)果比較，COⅠ基因的應(yīng)用，可以幫助更好地解釋巴貝斯蟲各種之間的進(jìn)化關(guān)系。但由于COⅠ基因在巴貝斯蟲上研究非常少，以致基因數(shù)據(jù)庫(kù)中能用到的數(shù)據(jù)量還很有限。因此，通過(guò)本研究，希望能引起廣大研究者的興趣，在以后的分類研究中引入COⅠ基因，推動(dòng)巴貝斯蟲甚至梨形蟲的分類研究。

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(編輯白永平)

Toxonomic Study of SomeBabesiaspp.Based onCOⅠGene in China

GOU Hui-tian1，XUE Hui-wen1，YIN Hong2，SUN Xiao-lin1*，LUO Jian-xun2*

(1．CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2．LanzhouVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalScience，Lanzhou730046，China)

In order to clarify the taxonomic status ofBabesiaspp，theCOⅠgene were sequenced from 11 isolates of 7 species reported in China；The phylogenetic tree were constructed usingCOⅠand 18S rRNA sequences downloaded from GenBank and this study，and also the two phylogenetic trees were compared.As result shown，the length ofCOⅠgene was 935-999 bp，and theCOⅠgene had more variation and informative sites than 18S rRNA.The taxonomic status of bovisBabesiaspp.based onCOⅠand 18S rRNA shared high similarity.However，there were also some differences from two phylogenetic trees.Such as，theCOⅠgene can differentiateBabesiaspp andTheileriaspp clearly.To 18S rRNA，it was more difficult.The taxonomic status based onCOⅠgene ofBabesiasp.from Xinjiang was more reasonable.The information of two phylogenetic tree suggested that theBabesiamotasiisolated from different region may represent different subspecies.This study supported the candidate gene of molecular taxonomy ofBabesiaspp.

Babesiaspp.；toxonomy；phylogenetic tree；COⅠgene

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.028

2015-11-16

國(guó)家自然科學(xué)基金(31560700)；甘肅省自然科學(xué)基金(145RJZA172)；蘭州市科技創(chuàng)新人才計(jì)劃(2014-2-11)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙創(chuàng)新基金(GSAU-STS-1422)

茍惠天(1980-)，甘肅臨洮人，講師，博士，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究工作，E-mail：gouht@gsau.edu.cn

羅建勛，男，研究員，E-mail：vectorparasit@126.com；孫曉林，男，教授，E-mail：sunxl@gsau.edu.cn

S852.72

A

0366-6964(2016)06-1293-06