張煥容，張　冰，王　棟，岳　華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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基因A型鴨甲肝病毒弱毒株免疫雛鴨的8種細(xì)胞因子mRNA變化分析

張煥容*，張冰，王棟，岳華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

為研究基因A型鴨甲肝病毒(DHAV-A)MY弱毒株對(duì)雛鴨細(xì)胞因子表達(dá)的影響，闡明細(xì)胞因子在DHAV-A弱毒疫苗免疫中的作用，利用熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法，檢測(cè)DHAV-A MY弱毒株接種1日齡SPF雛鴨后0.25、0.5、1、2、3和5 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝、脾和腦組織中IFN-α、IFN-β、IFN-γ，以及IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α共8種細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并結(jié)合各時(shí)間點(diǎn)DHAV-A的荷載量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：肝和腦組織中2 d時(shí)間點(diǎn)以及脾組織中3 d時(shí)間點(diǎn)病毒荷載量達(dá)到最高；三種組織中，8種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平均隨著病毒荷載量的增加而升高，且在各組織病毒荷載量最高時(shí)間點(diǎn)，8種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著升高(P<0.01)，結(jié)果證明DHAV-A MY弱毒株可刺激雛鴨抗病毒細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α以及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄，本研究豐富了DHAV-A MY弱毒株的免疫機(jī)制。

基因A型鴨甲肝病毒；弱毒株；細(xì)胞因子；熒光定量RT-PCR

基因A型鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus genotype A，DHAV-A)，是一種能夠引起雛鴨急性高度致死性的傳染性病原，雛鴨表現(xiàn)為急性發(fā)病、肝病變和高死亡率，主要危害4周齡以內(nèi)的雛鴨。DHAV-A屬于小RNA 病毒，入侵機(jī)體后主要感染鴨肝、脾和腦組織細(xì)胞，該病毒能夠與細(xì)胞膜上特定受體結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞，大量復(fù)制，破壞細(xì)胞平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加劇病程發(fā)展[1]。為了預(yù)防DHAV-A的感染，研究者們把分離的DHAV-A野毒經(jīng)過(guò)雞胚傳代弱化，培育出能夠激發(fā)雛鴨免疫又不致病的弱毒疫苗株。本研究中的DHAV-A MY株即為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)雞胚傳代弱化培育的弱毒株。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)廣泛應(yīng)用于病毒定量和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄等方面的研究。細(xì)胞因子在機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫、抗感染免疫、抗腫瘤免疫、抗排斥反應(yīng)、自身免疫疾病治療以及機(jī)體造血等方面都具有重要作用，其研究是當(dāng)代免疫學(xué)研究中最為活躍的領(lǐng)域之一[2]。本研究選取與細(xì)胞免疫和體液免疫密切相關(guān)的8種細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α[3-5]，采用RRT-PCR檢測(cè)DHAV-A MY弱毒株接種雛鴨后病毒增殖以及8種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，以期通過(guò)檢測(cè)IFN和TNF以及IL 等細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)表達(dá)，深入了解DHAV-A弱毒株刺激雛鴨后機(jī)體細(xì)胞因子的活化水平，為闡明DHAV-A MY弱毒株免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1基因A 型鴨甲肝病毒弱毒株和SPF鴨胚基因A 型鴨甲肝病毒(DHAV-A)MY株弱毒株(TCID50=10-5.60·100 μL-1)，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；SPF鴨胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，自行孵化，隔離飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑Trizol?試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；PrimescriptTMRT、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.2方法

1.2.1雛鴨分組接種DHAV-A MY弱毒株與樣品采集48 只1 日齡SPF 雛鴨隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組24只，試驗(yàn)組每只雛鴨腿部肌肉注射0.5 mL 10 000 ×TCID50DHAV-A MY 弱毒株，對(duì)照組每只雛鴨相同途徑注射0.5 mL無(wú)菌生理鹽水，于注射后0.25、0.5、1、2、3和5 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)取4只雛鴨，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，采取雛鴨肝、脾和腦組織置于液氮中，用于提取組織的總RNA。

1.2.2總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照Trizol?試劑盒說(shuō)明書提取肝、脾和腦組織中的總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3引物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，合成鴨內(nèi)參基因β-actin及DHAV-A、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α 引物(表1)。

1.2.4熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件內(nèi)參基因、細(xì)胞因子及DHAV-A的熒光定量PCR反應(yīng)體系均為25 μL：SYBR Green Ⅰ master mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL (10 μmol·L-1)，cDNA模板2 μL，補(bǔ)充去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s；優(yōu)化的DHAV-A和IL-8退火溫度為60 ℃，IFN-α退火溫度為64 ℃，IFN-β退火溫度為56 ℃，IFN-γ退火溫度為62 ℃，IL-1β退火溫度為54 ℃，IL-2退火溫度為59 ℃，IL-6和TNF-α退火溫度為58 ℃，β-actin退火溫度為61 ℃；退火31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(表2)。1.2.5數(shù)據(jù)處理以β-actin作為內(nèi)參基因，利用公式2-△△Ct相對(duì)定量方法對(duì)各細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平和病毒拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只雛鴨(n=4)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 17.0軟件的t檢驗(yàn)方法分析樣本之間的差異性，其中P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1DHAV-A MY弱毒在雛鴨肝、脾及腦組織中的增殖情況

結(jié)果顯示，肝和腦組織中病毒荷載量在接毒后2 d達(dá)到最高值，分別是對(duì)照組的280.14倍(P<0.01)和4.40倍(P<0.05)，脾中病毒荷載量在接毒后3 d達(dá)到最高值，為對(duì)照組的86.6倍(P<0.05)，雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后0.25～1 d時(shí)間段各時(shí)間點(diǎn)，肝、脾和腦組織中病毒荷載量較低，在2 d時(shí)迅速上升(P<0.01)，肝中病毒荷載量最高，隨后肝中病毒荷載量大幅度下降(P<0.01)，2～5 d時(shí)間段各時(shí)間點(diǎn)，三種組織中病毒荷載量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖1)。

**.P<0.01圖1　DHAV-A MY弱毒接種雛鴨肝、脾和腦組織中DHAV-A的增殖情況Fig.1　Proliferation of attenuated DHAV-A in the liver，spleen and brain tissues of attenuated DHAV-A MY strain injected ducklings

2.2雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株后肝、脾和腦細(xì)胞`因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株后0.25、0.5、1、2、3和5 d各時(shí)間點(diǎn)，IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 以及IFN-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA在肝、脾和腦中的轉(zhuǎn)錄水平分別如圖2～4所示。在 2 d 時(shí)間點(diǎn)，肝組織中除IL-2、IL-6、IL-8外，其余5種細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高 (P<0.01)；3 d時(shí)間點(diǎn)，脾組織中除TNF-α外，7種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P<0.01)；5 d 時(shí)間點(diǎn)，腦組織中8種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高 (P<0.01)。

**.P<0.01，*.0.01

**.P<0.01，*.0.01

**.P<0.01，*.0.01

3　討　論

利用RRT-PCR 方法檢測(cè)雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株后肝、脾和腦組織中病毒復(fù)制情況，發(fā)現(xiàn)接種后6 h即可在以上組織中檢測(cè)到病毒，肝中病毒荷載量2 d 時(shí)達(dá)到峰值，這與C.Q.Gu等[1]研究結(jié)果類似。但DHAV-A MY弱毒株在組織中的增殖呈一過(guò)性，免疫后3 d肝中病毒含量迅速下降，而C.Q.Gu等[1]和楊苗[11]研究顯示雛鴨感染DHAV-A強(qiáng)毒JX株和XC株后3 d時(shí)病毒荷載量仍非常高，并持續(xù)1月。汪銘書等[12]利用Dot-ELISA方法檢測(cè)雛鴨接種DHAV-A弱毒株QL79株后各組織器官DHAV-A 弱毒分布，結(jié)果表明雛鴨接種DHAV-A 弱毒QL79株后很難在雛鴨腦組織中檢測(cè)到DHAV-A，這與本試驗(yàn)中腦組織病毒荷載量極低的結(jié)果相符。DHAV-A MY弱毒株在雛鴨體內(nèi)有限制增殖和難以通過(guò)血腦屏障是其作為安全的弱毒疫苗候選株的重要生物學(xué)特征。

程安春等[13]認(rèn)為DHAV-A弱毒苗免疫雛鴨后到達(dá)免疫器官脾刺激了雛鴨的免疫應(yīng)答反應(yīng)，隨后抑制了肝和脾組織中疫苗毒的復(fù)制，本研究得到了與之相同的結(jié)果。雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后，隨著弱毒在肝、脾和腦組織中病毒荷載量的升高，誘導(dǎo)各組織細(xì)胞高水平表達(dá)多種細(xì)胞因子，2 d時(shí)肝組織和腦組織中病毒荷載量達(dá)到峰值，此時(shí)，各種細(xì)胞因子在肝和腦組織中的表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)；脾中病毒荷載量在3 d時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值時(shí)，各種細(xì)胞因子在脾組織中的表達(dá)水平也極顯著升高(P<0.01)；說(shuō)明病毒的增殖可以活化雛鴨的細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)。C.Q.Gu等[1]研究顯示雛鴨感染DHAV-A強(qiáng)毒JX株2～5 d時(shí)IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，而本試驗(yàn)中雛鴨接種DHAV-A MY弱毒株2～5 d 時(shí)IFN-α mRNA 水平升高，這種反差說(shuō)明DHAV-A弱毒株可以促進(jìn)干擾素的表達(dá)從而抑制病毒的增殖，而DHAV-A強(qiáng)毒株可以抑制干擾素生成從而導(dǎo)致強(qiáng)毒株的感染。3種干擾素中IFN-α 轉(zhuǎn)錄水平最高，說(shuō)明了IFN-α在隨后的抗DHAV-A弱毒株增殖中起主要作用。DHAV-A MY弱毒株接種后3～5 d，肝和腦中荷載量快速下降，各種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄量也快速下降，說(shuō)明由于弱毒株的下降，導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用減弱。脾組織中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平在DHAV-A MY弱毒株接種后3～5 d仍極顯著高于肝和腦組織中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平，這與脾中病毒荷載量晚于肝和腦達(dá)到高峰相一致，且脾是機(jī)體最重要的免疫器官，能在病毒的誘導(dǎo)下產(chǎn)生高水平細(xì)胞因子。雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后，鴨IFN-α、IFN-β 和IFN-γ的大量表達(dá)能夠在肝、脾和腦組織中起到很好的抗病毒作用，可有效減少DHAV-A MY弱毒對(duì)雛鴨肝、脾和腦組織等的損傷。

IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8都是和炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子。雛鴨接種DHAV-A MY弱毒后0.25～1 d 時(shí)，DHAV-A MY弱毒增殖刺激了單核-巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致鴨IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8的快速轉(zhuǎn)錄，這與郭智莉的研究結(jié)果一致[14]，雛鴨免疫DHAV-A MY弱毒2 d時(shí)，肝組織中DHAV-A 弱毒荷載量達(dá)到最大值，鴨IL-1β和IL-2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄量反而比1 d時(shí)下降，說(shuō)明病毒的大量增殖對(duì)鴨IL-1β和IL-2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄起到了一定的抑制作用[15]。

文獻(xiàn)報(bào)道[8，15]TNF-α可以參與機(jī)體防御反應(yīng)起到免疫調(diào)節(jié)作用，且不依賴宿主的其他免疫因素就能起到獨(dú)立的抗病毒作用，是一種重要的抗病毒細(xì)胞因子。本研究中，肝、脾和腦組織中鴨TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄量升降與相應(yīng)組織中DHAV-A弱毒荷載量的升降趨勢(shì)一致，說(shuō)明在雛鴨接種DHAV-A弱毒后誘導(dǎo)了鴨TNF-α的表達(dá)從而通過(guò)免疫調(diào)節(jié)起到了抑制病毒增殖的作用。

4　結(jié)　論

通過(guò)對(duì)SPF 雛鴨接種DHAV-A MY 弱毒株后組織中8種細(xì)胞因子mRNA的定量檢測(cè)，證明DHAV-A MY弱毒可刺激雛鴨抗病毒細(xì)胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α以及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)采用新的方法評(píng)估DHAV-A弱毒疫苗的安全性和免疫機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

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(編輯白永平)

mRNA Change Analysis of Eight Cytokines in Ducklings Stimulated by Attenuated Duck Hepatitis A Virus Genotype A MY Strain

ZHANG Huan-rong*，ZHANG Bing，WANG Dong，YUE Hua

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

In order to explore the roles of cytokines responding to attenuated duck hepatitis A virus genotype A (DHAV-A) vaccine immunization，the effects of attenuated DHAV-A MY strain on cytokine transcription in ducklings were analyzed.The mRNA transcription levels of 8 cytokines，such as IFN-α，IFN-β，IFN-γ and IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，and TNF-α，were determined by RRT-PCR in liver，spleen and brain of ducklings at different time points of 0.25 0.5，1，2，3 and 5 days post attenuated DHAV-A MY strain injecting 1-day-old SPF ducklings，and the virus loads of DHAV-A MY strain in liver，spleen and brain were also detected by RRT-PCR.The results indicated that the virus load reached the highest level in liver and brain at 2 d time point，and at 3 d time point in spleen post attenuated DHAV-A MY strain injection.The mRNA transcription levels of 8 cytokines in liver，spleen and brain up-regulated very significantly at the corresponding time points when the virus load reached the highest level post DHAV-A MY strain injection (P<0.01).The results indicated that attenuated DHAV-A MY strain could stimulate the transcription of anti-viral cytokines IFN-α，IFN-β，IFN-γ and TNF-α，as well as proinflammatory cytokines IL-1β，IL-2，IL-6 and IL-8，our results enrich the immunization mechanism of DHAV-A MY strain.

duck hepatitis A virus genotype A；attenuated strain；cytokine；RRT-PCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.017

2015-11-25

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014NZYQN58); 國(guó)家民委科技項(xiàng)目(14XNZ025)

張煥容(1968-)，女，重慶江津人，博士，教授，主要從事動(dòng)物傳染病研究，Tel：028-85522727

張煥容, E-mail：zhrong05@163.com

S855.3

A

0366-6964(2016)06-1215-07