陳　曦，湯　承，張　斌，宋志剛，周　芳，岳　華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

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牦牛星狀病毒的RT-PCR檢測方法的建立和變異分析

陳曦，湯承，張斌，宋志剛，周芳，岳華*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041)

近期作者實驗室從腹瀉牦牛糞便樣本中鑒定出一種新型星狀病毒(AstV)——牦牛AstV，本研究旨在建立檢測牦牛AstV的RT-PCR方法。首先設(shè)計引物擴增牦牛AstV 630 bp的ORF2基因片段，進行序列分析；在此基礎(chǔ)上設(shè)計檢測引物，建立檢測牦牛AstV的RT-PCR方法。結(jié)果顯示，從20份牦牛腹瀉糞便中擴增出13個牦牛AstVORF2基因片段，核苷酸相似性為99.3%～100%，而與牛腸源星狀病毒(BAstV)ORF2基因的相似性僅為59.5%～80.8%；所建立的RT-PCR方法只擴增牦牛AstV的特異片段，對BAstV和其他無關(guān)病原無擴增；對病毒核酸的最低檢測限為57.3 fg·μL-1；比較試驗表明，所建立的RT-PCR方法對牦牛AstV的檢出率明顯優(yōu)于現(xiàn)有檢測BAstV的RT-PCR方法。其對牦牛腹瀉與健康糞便樣本中牦牛AstV的檢出率分別為55.5%(76/137)和7.7%(2/26)(P<0.01)。試驗結(jié)果表明，擴增的ORF2基因片段的核苷酸序列在牦牛AstV毒株間高度保守，但相對于BAstV變異大；基于該序列建立的檢測牦牛AstV的RT-PCR方法特異性好，靈敏度高，穩(wěn)定性好，為牦牛AstV的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供了有力工具；同時，本試驗結(jié)果也提示牦牛AstV與犢牦牛腹瀉有聯(lián)系。

牦牛；星狀病毒；RT-PCR；ORF2基因；遺傳變異

牛星狀病毒(bovine astrovirus，BAstV)是于1978年從英國7日齡犢牛腹瀉糞便中首次分離并命名的，由于該病毒感染SPF牛后未引起腹瀉癥狀，被認(rèn)為是無致病性的[1]。然而，1984年G.N.Woode等的研究發(fā)現(xiàn)BAstV分離株US1接種SPF牛后雖然不能引起臨床癥狀，但能夠引起?；啬c圓頂上皮細胞中的M細胞發(fā)生病變，并且糞便顏色由棕變黃；同時，該研究還表明BAstV單獨存在時不能導(dǎo)致牛發(fā)生腹瀉癥狀，但與其他病毒(如輪狀病毒、冠狀病毒等)混合感染時引起的臨床癥狀更加嚴(yán)重[2]。近年的流行病學(xué)資料也表明，BAstV與犢牛腹瀉有聯(lián)系[3-5]。

最近，作者實驗室采用宏病毒組技術(shù)首次從腹瀉牦牛糞便樣本中鑒定出AstV，并獲得了一株牦牛AstV的基因組序列，與腸源BAstV的核苷酸序列相似性為46.4%～66.2%，其中ORF1a、ORF1b和ORF2與腸源BAstV的相應(yīng)核苷酸序列相似性分別為61.7%～78.8%、74.4%～87.0%和40.6%～57.4%；而氨基酸序列的相似性分別為71.7%～91.6%、86.3%～96.4%和50.2%～64.2%[6]。該毒株的ORF2基因發(fā)生了基因重組現(xiàn)象，推導(dǎo)的重組位點位于核苷酸序列的804 bp處，序列分析顯示1—804 bp片段與BAstV B76-HK的相似性最高，而805 bp以后的片段與鹿AstV CCAstV株的同源關(guān)系最近，是一種新型AstV[6]。本研究的目的是建立檢測牦牛AstV的RT-PCR方法，并且對2014—2015年四川省阿壩州的137份腹瀉犢牦牛糞便樣本和26份健康犢牦牛糞便樣本進行檢測。

1　材料與方法

1.1病毒(菌)株與臨床樣本

牦牛AstV 核酸樣本為宏病毒組測序證實的陽性樣本；用于特異性驗證的病毒(菌)株和核酸樣本：牦牛源輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV.swun0105)、牦牛源牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV.swun0603)、牦牛源腸炎病毒(bovine enterovirus，BEV.swun0510)；牦牛源K99大腸桿菌(swun4025)、牦牛源都柏林沙門菌(swun3736)、牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌(swun2930)、牦牛源空腸彎曲桿菌(swun1639)；BAstV、牦牛源冠狀病毒(bovine coronavirus，BCV)、牦牛源細小病毒、牦牛源Kobu病毒核酸樣本以及牦牛源艾美爾球蟲、牦牛源瑞氏隱孢子蟲的DNA樣本由本實驗室保存。臨床樣本為2014年7月和2015年6月從四川省阿壩州采集的163份犢牦牛(≤3月齡)糞便樣本，其中腹瀉糞便樣本137份，分別來自12個牧場；健康糞便樣本26份，來自于同地區(qū)未發(fā)生腹瀉性疾病的4個牧場，保存在-80 ℃。

1.2主要試劑及儀器

TRIzolTMReagent、PrimescriptTM、PMD19-T載體均購自TaKaRa公司；DNA Marker、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(Bio-Rad公司，美國)；紫外分光光度計Cary50Probe(Vatian公司，美國)；高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.3引物設(shè)計與合成

本研究在對前期獲得的宏病毒組數(shù)據(jù)和牦牛AstV S8株基因組序列(KM822593)分析的基礎(chǔ)上[6]，采用Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物(P1、P2)：F：5′-TCTTTGGAGGGGAGGACC-3′，R：5′- ATCCCCCTTGGTGTTGGT-3′，擴增長度為630 bp的牦牛AstVORF2基因片段，該片段位于ORF2基因的1—630 bp處。從20份牦牛腹瀉糞便樣本中擴增目的片段并測序，應(yīng)用MEGA5.1和MegAlign序列分析軟件進行序列分析和遺傳進化分析。

特異性檢測牦牛AstV的RT-PCR的引物(P3、P4)設(shè)計根據(jù)上述序列分析的結(jié)果，選取保守序列設(shè)計特異性檢測牦牛AstV的引物，引物信息見表1，擴增位于牦牛AstVORF2基因77—421 bp的長度為345 bp的目的片段，引物由大連寶生物工程有限公司合成。

表1三種RT-PCR方法的引物信息

Table 1Primer information for three kinds of RT-PCR assay

檢測方法Detectionmethod靶基因Targetgene引物序列Sequence引物來源Origin1ORF2F:5'-CAGCAGCAGAGGAGGAAGAGA-3'R:5'-CGAAACAGCACTGGCACCC-3'本研究2ORF1bF:5'-GTGTTTGGCATGTGGGTYAARCC-3'R:5'-RTCVYYBKTGGTGGT-3'[3]3ORF1bF:5'-GAYTGGACBCGHTWTGATGG-3'R:5'-KYTTRACCCACATNCCAA-3'[7]

1.4核酸的提取與cDNA合成

將臨床糞便樣本與PBS(1∶5)充分重懸混勻，-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，再以12 000 r·min-1離心30 min，取上清，然后按照TRIzol Reagent說明書提取總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＜毦鶧NA采用酚—氯仿法提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5牦牛AstV陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以牦牛AstV cDNA為模板，加入P3、P4引物擴增牦牛AstV的ORF2基因345 bp的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，將其克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送擎科生物有限公司測序。測序正確的陽性質(zhì)粒作為AstV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，核酸蛋白檢測儀測定其濃度。

1.6反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

采用25 μL體系(預(yù)混酶12.5 μL，牦牛AstV陽性標(biāo)準(zhǔn)品2 μL，ddH2O補足至25 μL)，對退火溫度從50～60 ℃進行優(yōu)化，再以優(yōu)化的退火溫度對引物濃度10 μmol·μL-1(0.1 ～1.0 μL)進行優(yōu)化。

1.7敏感性測定

將牦牛AstV陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍遞增稀釋后作為模板(1×100、1×10-1～1×10-8)，用建立的RT-PCR進行檢測，確定其檢測限。

1.8特異性評價

用建立的RT-PCR對“1.1”中特異性檢測待檢病原的核酸樣本進行檢測，并設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本和陰性對照，以評價該方法的特異性。

1.9穩(wěn)定性評價

用建立的RT-PCR對3個陽性模板進行3次重復(fù)檢測，以評價方法的穩(wěn)定性。

1.10與現(xiàn)有檢測BAstV的RT-PCR方法的比較

采用本試驗中建立的RT-PCR方法和現(xiàn)有的2種檢測BAstV的RT-PCR方法(表1)同時對54份牦牛腹瀉糞便樣本及80份肉牛腹瀉樣本進行檢測，比較這三種方法的檢出率。

1.11臨床樣本檢測與統(tǒng)計學(xué)分析

采用建立的RT-PCR方法對上述137份腹瀉糞便樣本和26份健康糞便樣本進行檢測，隨機選取10份陽性樣本測序驗證；分別統(tǒng)計，牦牛AstV在腹瀉糞便樣本和健康糞便樣本的檢出率，應(yīng)用SPSS軟件對檢測結(jié)果產(chǎn)生的差異進行顯著性分析。

2　結(jié)　果

從20份腹瀉糞便樣本中擴增出13個牦牛AstVORF2基因片段，長度為630 bp，毒株間的相似性為99.2%～100%，這一結(jié)果表明牦牛AstVORF2基因的1—630 bp區(qū)域高度保守，具備作為檢測牦牛AstV 分子檢測靶點的潛力。將擴增的牦牛AstVORF2基因片段與已報道的BAstV 毒株進行核苷酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，牦牛AstVORF2與牛腸源BAstV毒株的相似性為59.5%～80.8%。牦牛AstV 與牛腸源和呼吸道源BAstV之間的遺傳距離相對較近，但也存在明顯的遺傳距離，且所有牦牛AstV單獨聚成一支(圖1)。

2.2牦牛AstV檢測引物的特異性

采用自行設(shè)計的引物對牦牛AstV核酸陽性樣本進行PCR擴增，獲得的目的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果證明目的片段長度為345 bp，為牦牛AstV 的特異性序列，與牦牛AstVORF2基因序列的相似性為100%。

2.3優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系及條件

優(yōu)化的反應(yīng)體系：預(yù)混酶12.5 μL，上下游引物P3、P4(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2.4特異性

該方法能從牦牛AstV陽性核酸樣本中檢出目的基因片段，對BAstV陽性核酸樣本無擴增，對其他無關(guān)病原不擴增。可見，本研究建立的RT-PCR只適合牦牛AstV的檢測，而不能用于BAstV的檢測。

我們在前面說過，實踐標(biāo)準(zhǔn)的討論具有啟蒙的意義。我們可以從反思啟蒙的角度來反思實踐標(biāo)準(zhǔn)。在反思啟蒙的理論中有兩種啟蒙辯證法值得我們重視。一個是黑格爾對于啟蒙和信仰的分析，一個是霍克海默和阿多諾對于啟蒙的分析。

2.5敏感性

牦牛AstV陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為57.3 ng·μL-1，敏感性檢測結(jié)果顯示，1×10-6稀釋度陽性標(biāo)準(zhǔn)品仍可見目的條帶，對AstV的核酸最低檢測限為57.3 fg·μL-1。

2.6穩(wěn)定性

對同一模板的3次重復(fù)檢測結(jié)果一致，證明該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.7三種RT-PCR檢測方法的比較

三種檢測方法的引物信息見表1。

檢測方法1～3對54份牦牛腹瀉糞便樣本中牦牛AstV檢測的陽性率分別為70.4%、0、29.6%，可見作者所建立的RT-PCR方法對牦牛AstV的檢測效率明顯優(yōu)于現(xiàn)有的2種檢測BAstV的RT-PCR方法。三種方法對80份肉牛腹瀉糞便樣本中BAstV檢測的陽性率分別為0、0、8.7%，進一步證明本試驗建立的RT-PCR方法只適用于牦牛AstV的檢測。對方法2不能檢出BAstV原因的分析發(fā)現(xiàn)，該文獻報道的下游引物是錯誤的。

2.8臨床樣本檢測

利用作者建立的RT-PCR方法從137份腹瀉牦牛糞便和26份健康牦牛糞便中分別檢出76份和2份陽性樣本，對隨機挑選10份陽性樣本PCR產(chǎn)物測序結(jié)果證實為牦牛AstV特異片段。腹瀉犢牦牛糞便樣本中牦牛AstV的攜帶率為55.5%，顯著高于健康犢牦牛糞便中的攜帶率7.7% (P<0.01)，表明AstV感染可能與犢牦牛腹瀉有聯(lián)系。

3　討　論

近年來，關(guān)于BAstV感染的流行病學(xué)及病原遺傳變異的研究逐年增加[3，5，7-8]。作者最近利用二代測序技術(shù)首次從牦牛腹瀉糞便樣本中鑒定出AstV，是一種新型AstV[6]，采用現(xiàn)有的兩種檢測BAstV的RT-PCR方法[3，7]對陽性樣本卻不能檢出。因此，有必要建立檢測牦牛AstV的RT-PCR方法。有資料表明，AstVORF2基因的前段區(qū)域在種內(nèi)是高度保守的[9-11]。因此，為篩選分子檢測靶點，作者對13株牦牛AstVORF2 1—630 bp的基因片段進行了克隆測序，結(jié)果顯示該區(qū)域核苷酸序列在牦牛AstV種內(nèi)也是高度保守的?；谠撔蛄斜Ｊ貐^(qū)域設(shè)計了檢測引物，成功建立了檢測牦牛AstV 的RT-PCR方法，具有特異性強、敏感度高、穩(wěn)定性好的特點，為牦牛AstV的病原檢測及病原流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠手段。由于該方法是基于牦牛AstVORF2 基因保守序列建成的，而本試驗獲得的牦牛AstVORF2基因片段與BAstV 的核苷酸相似性僅為59.5%～80.8%，點突變很多。這可能是該方法不能對BAstV 陽性模板及牛腹瀉糞便中BAstV陽性樣本檢出的原因。因此，本試驗建立的RT-PCR方法只適用于牦牛AstV的檢測。在后續(xù)研究中，可進一步研究建立檢測牦牛AstV 和BAstV的雙重RT-PCR及通用型RT-PCR，以滿足不同研究的需要。

現(xiàn)有兩種檢測BAstV的RT-PCR方法對臨床樣本中牦牛AstV的檢出率顯著低于本研究建立的RT-PCR方法，分析其原因可能有兩個：一是核苷酸序列變異。現(xiàn)有的檢測BAstV的RT-PCR引物的靶基因都是ORF1b，而牦牛AstV的ORF1b的核苷酸序列與已知的BAstV的ORF1b的序列差異大，相似性僅為74.4%～87%，且核苷酸序列中存在很多點突變[6]，這可能是主要原因；二是現(xiàn)有的兩種PCR方法為解決BAstV的ORF1b核苷酸序列的點突變，均采用了簡并引物[3，7]，而簡并引物會影響PCR檢測的靈敏度[12]。實際上，作者用本研究建立的方法和文獻[7]的方法檢測均為陽性的樣本，進行了靈敏度比較，結(jié)果前者的靈敏度較后者高100倍。

圖1　牦牛AstV ORF2基因片段的鄰近法進化樹Fig.1　Neighbor-joining consensus tree for partial ORF2 gene fragment of yak AstV

J.K.Oem等和M.Candido等的流行病學(xué)調(diào)查表明，BAstV與犢牛腹瀉有關(guān)[3，5]，作者的檢測結(jié)果也提示牦牛AstV可能與犢牦牛腹瀉有聯(lián)系。然而，C.P.Sharp等對新西蘭牛的群體研究發(fā)現(xiàn)，BAstV在犢牛體內(nèi)的檢出率雖然高于成年牛，但認(rèn)為BAstV并不是導(dǎo)致犢牛腹瀉的主要病原[13]。鑒于牦牛AstV在犢牦牛腹瀉糞便中有很高的檢出率，有必要進一步確定其在牦牛腹瀉的作用。

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(編輯白永平)

Development of an RT-PCR Assay and Variation Analysis for Yak Astrovirus

CHEN Xi，TANG Cheng，ZHANG Bin，SONG Zhi-gang，ZHOU Fang，YUE Hua*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Recently，our laboratory identified a novel astrovirus from fecal samples of diarrheic yak，the aim of this study was to develop an RT-PCR assay for detecting the novel yak astrovirus (yak AstV).Firstly，one pair primers were designed to amplifyORF2 gene fragments (630 bp in length) of yak AstV.By sequence analysis，one pair primers of RT-PCR assay were then designed for detecting yak AstV.We obtained 13ORF2 gene fragments from 20 fecal samples of diarrheic yak，which shared a homology of 99.3%-100% within fragments，but only a homology of 59.5%-80.8% with bovine astrovirus (BAstV).The RT-PCR assay developed in this study was specific to yak astrovirus，no amplifying for BAstV and other pathogens tested in this study.The detection limit of viral nucleic acid of the assay was 57.3 fg·μL-1.The assay was significantly better in detecting yak AstV compared to the other two reported assays for detecting bovine astrovirus.The detecting results of clinical samples by this assay showed that the positive rates of yak AstV were 55.5% (76/137) in diarrheic fecal samples and 7.7% (2/26) in healthy fecal samples.Compared to healthy samples，yak AstV was significantly more prevalent in diarrheic fecal samples (P<0.01).In conclusion，ORF2 gene sequences of yak AstV cloned in this study varied a lot compared with those of BAstV，but were highly conserved within yak AstV species.Thus，the RT-PCR for detecting yak AstV based on theORF2 sequences of yak AstV greatly improved the detection rate of yak AstV，providing a useful tool for detection of this novel virus and epidemiological investigation.Meanwhile，the results of this study indicated that yak AstV might be associated with diarrhea in yak calves.

yak；astrovirus；RT-PCR assay；ORF2 gene；genetic variation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.027

2015-10-30

“十二五”高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)課題(2012AA101304)；四川省科技計劃項目青年基金(2014JQ0044)；四川省教育廳創(chuàng)新團隊(13TD0057)；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項目(CX2015SZ067)

陳曦(1990-)，女，河南睢縣人，碩士生，主要從事動物病原分子生物學(xué)研究，E-mail: 792875776@qq.com

岳華，博士，教授，Tel: +86-28-85528276, Fax: +86-28-85522727，E-mail: yhua900@163.com

S852.653

A

0366-6964(2016)06-1287-06