宋　爽，曾　磊，魯紹芳，郭珍珍，魯維飛，韓立強，王　江，王月影，褚貝貝，楊國宇

(河南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，鄭州 450002)

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豬TRIM11基因克隆及其促進豬偽狂犬病毒在體外增殖的研究

宋爽，曾磊，魯紹芳，郭珍珍，魯維飛，韓立強，王江，王月影，褚貝貝*，楊國宇*

(河南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，鄭州 450002)

為初步研究豬TRIM11的免疫學功能，以豬頜下淋巴結cDNA為模板擴增TRIM11 基因cDNA并對該基因進行了蛋白質結構預測和組織表達譜分析，將該基因與PiggyBac載體相連獲得真核表達載體PB-TRIM11，之后轉染PK15細胞獲得穩(wěn)定表達細胞系。用豬偽狂犬病毒(PRV)刺激過表達TRIM11 PK15細胞和對照組細胞后，于不同時間收獲細胞上清，比較兩組細胞上清中病毒滴度變化。結果表明，豬TRIM11的ORF長度為1 407 bp，編碼468個氨基酸，該氨基酸序列含有3個TRIM家族保守的結構域。組織表達譜分析顯示，豬TRIM11在脂肪組織、肺的表達量較高，而在心、回腸、十二指腸、直腸中的轉錄量較低。成功克隆了豬TRIM11 cDNA序列并構建了真核轉錄載體PB-TRIM11，qRT-PCR檢測結果表明TRIM11在PK15細胞系中成功表達。檢測感染PRV后過表達TRIM11 PK15細胞和對照組細胞上清液病毒的TCID50發(fā)現(xiàn)過表達TRIM11組的病毒滴度始終高于對照組。過表達TRIM11有一定的促進PRV增殖的作用，為進一步研究豬TRIM11在天然免疫中的作用奠定了基礎。

三基序結合蛋白；豬偽狂犬病毒；病毒增殖；穩(wěn)定細胞系

三基序結合蛋白(TRIM)家族在人上已發(fā)現(xiàn)超過70個家族成員。所有的TRIM蛋白都含有一個由鋅指結構、1或2個B-box、1個卷曲螺旋(RBCC)組成的N端三結構域[1]。TRIM蛋白功能多種多樣，除了參與細胞增殖、分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生和細胞凋亡，也在免疫相關信號通路和抗病毒免疫反應中發(fā)揮重要作用[2]。TRIM11(含有468個氨基酸殘基)是一種典型的RBCC蛋白且形成寡聚物，在細胞質與細胞核中都存在[3]。近年來有研究表明，TRIM11可以與TBK1含有接頭蛋白的復合體結合，抑制RIG-Ⅰ介導的IFN-β產(chǎn)生的信號通路，降低Ⅰ型皰疹病毒感染中IFN的產(chǎn)生量，負調(diào)控抗病毒免疫反應[4]。

豬偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)也稱為奧葉基氏病毒或豬Ⅰ型皰疹病毒，是皰疹病毒科中皰疹病毒甲亞科的一員，其基因組是一個雙鏈線性DNA分子[5]。主要感染豬和其他家畜，在偶然情況下也會感染野生動物[6]。猜測豬TRIM11基因在病毒感染細胞過程中也可能起到負調(diào)控抗病毒免疫反應作用。作者選擇豬的TRIM11基因作為研究對象，對其進行克隆，并構建真核表達質粒PB-TRIM11，之后轉染PK15細胞，構建穩(wěn)定表達豬TRIM11基因的PK15細胞系。通過PRV感染過表達細胞系，對TRIM11基因對PRV增殖的作用進行了初步研究。

1　材料與方法

1.1細胞和病毒

豬偽狂犬病毒(PRV strain Bartha K16)，豬腎傳代細胞PK15細胞，非洲綠猴腎細胞Vero細胞均由本實驗室保存。

1.2主要試劑

豬頜下淋巴結、睪丸、肺等組織提取RNA反轉錄的cDNA，大腸桿菌(Escherichiacoil)感受態(tài)Top10由本實驗室保存；氨芐青霉素、嘌呤霉素為美國Sigma公司產(chǎn)品；ExTaq酶、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、DL2000為TaKaRa公司產(chǎn)品；Q5?熱啟動超保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NheⅠ、SwaⅠ、T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；質粒中提試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；轉染試劑Turbofect為Thermo公司產(chǎn)品。

1.3引物設計

參照GenBank中的豬源TRIM11(序列號：GACC01000116.1)基因序列，設計了包含NheⅠ和SwaⅠ酶切位點的擴增引物，以及用于Q-PCR定量的特異引物。引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1擴增TRIM11和參照基因引物

Table 1The primers used to amplifyTRIM11 and reference gene

1.4豬TRIM11基因序列和系統(tǒng)進化分析

用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預測豬TRIM11的CDS序列，豬TRIM11分子大小和等電點用DNAStar進行計算，二級結構域模式分析用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de)。構建豬TRIM11的系統(tǒng)進化樹。首先從NCBI數(shù)據(jù)庫上下載不同物種間TRIM11蛋白序列，然后在MEGA 6 software中構建系統(tǒng)進化樹，計算方法為NJ法。NJ法系統(tǒng)進化樹的穩(wěn)健性使用自展內(nèi)部分枝法(Bootstrapping)評定，Bootstrap Replication為1 000。

1.5豬TRIM11基因的克隆與PB-TRIM11表達載體構建

利用PCR技術，以實驗室保存的豬頜下淋巴結組織提取的RNA反轉錄成的cDNA為模板，擴增得到豬TRIM11基因的cDNA序列。產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收大小為1 432 bp左右條帶，并進行純化。用NheⅠ和SwaⅠ分別雙酶切載體PiggyBac和純化得到的目的片段，連接過夜后轉化Top10感受態(tài)細胞。將轉化后的菌液涂布于預先加入Amp的LB瓊脂平板，37 ℃過夜。挑取單菌落擴大培養(yǎng)，采用菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳篩選陽性克隆，命名為PB-TRIM11，送生物工程(上海)股份有限公司測序。將鑒定正確的質粒按中提試劑盒說明書進行提取，-20 ℃保存，備用。

1.6PB-TRIM11質粒轉染PK15細胞

將處于對數(shù)生長期的PK15細胞接種于6孔板中，達到80%融合度時，利用Turbofect進行轉染。48 h后以PiggyBac系統(tǒng)自帶的GFP為依據(jù)，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。更換含有4 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行篩選，加壓篩選4周后，熒光顯微鏡下可見有綠色熒光且抗嘌呤霉素的陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)即可得到穩(wěn)定表達豬TRIM11的PK15細胞系。

1.7熒光定量PCR法檢測TRIM11 mRNA轉錄水平

將穩(wěn)定轉染TRIM11基因和穩(wěn)定轉染PiggyBac空載體的PK15細胞，以7.5×105·孔-1分別接種于6孔板中，每組在6孔板中做3個復孔，6 h后收集細胞，Trizol法提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒操作說明將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR法檢測TRIM11 mRNA表達水平。兩組之間比較采用independent-sampleTtest (P<0.05)。

1.8TRIM11對PRV增殖的影響

1.8.1豬偽狂犬病毒(PRV strain Bartha K16)的培養(yǎng)及預處理將實驗室保存的一支PRV懸液接種于長滿單層PK15細胞的25 cm2細胞瓶內(nèi)，于37 ℃孵育1 h后，每瓶加8 mL含2%胎牛血清的DMEM維持液，培養(yǎng)至24 h細胞出現(xiàn)明顯病變時收獲培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物反復凍融3次后，1 500 r·min-1離心15 min，收集病毒上清液，置-80 ℃?zhèn)溆?。?6孔微量培養(yǎng)板，每孔接種1×104個PK15細胞，待細胞長成單層后，取100 μL制得的病毒懸液，用DMEM培養(yǎng)液進行10倍稀釋(10-1～10-10)，同時設立陰性對照，接種96孔微量培養(yǎng)板，測定所制病毒懸液的TCID50。TCID50計算按Reed-Muench法進行。

1.8.2過表達豬TRIM11對PRV增殖的影響將穩(wěn)定轉染TRIM11基因和穩(wěn)定轉染PiggyBac空載體的PK15細胞，以7.5×105·孔-1分別接種于6孔板中，每組做3個復孔，待細胞長至單層后接種0.1 MOI PRV，37 ℃孵育1 h后用PBS漂洗細胞去除未吸附的病毒，每孔加入2 mL含2%胎牛血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。于病毒感染12、24、36 h后觀察細胞病變并收集細胞上清液測定TCID50。取96孔微量培養(yǎng)板，每孔接種1×104個Vero細胞，待細胞長成單層后，取100 μL待測細胞上清液，用DMEM培養(yǎng)液進行10倍稀釋(10-1～10-10)，同時設立陰性對照，接種96孔微量培養(yǎng)板，測定TCID50。TCID50計算按Reed-Muench法進行。兩組之間比較采用independent sampleTtest(P<0.05)。

2　結　果

2.1豬TRIM11基因的序列分析及蛋白質二級結構域模式

首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索預測的豬TRIM11基因的CDS序列(序列號為：GACC01000116.1)。豬TRIM11的CDS區(qū)長1 407 bp，編碼468個氨基酸(圖1)，蛋白質的相對分子質量為53 ku，等電點為5.409。TRIM家族的顯著特點是具有3個結構域(tripartite motif)[7]，蛋白質二級結構域模式分析顯示TRIM11蛋白含有3個TRIM家族保守的結構域，這三個結構域從N端到C端的順序依次是RING結構、2個B-box結構域、一個卷曲結構域(coiled-coil domain)，此外該蛋白C端結構域為PRY結構域和SPRY結構域。PRY和SPRY結構域組成了B30.2結構域[8](圖2)。

2.2豬TRIM11序列相似性和在不同物種間的系統(tǒng)進化

在TRIM11序列系統(tǒng)進化樹上，豬和牛、虎鯨、山羊先聚在一起，然后又與太平洋海象聚成一支，與人和褐家鼠最后也聚成了一支。結果顯示，豬和牛、虎鯨、山羊的親緣關系很近，其相似性高達98%、99%、98%，人和豬的相似性為72%(圖3)。

2.3熒光定量PCR分析豬TRIM11基因的組織特異性

為了分析豬TRIM11基因mRNA在不同組織中的轉錄及分布情況，本研究使用了豬的15個組織提取的RNA反轉錄的cDNA，采用熒光定量PCR的方法進行了分析，以GAPDH為內(nèi)參，采用與心組織的比值作為目的基因的相對轉錄水平，豬TRIM11基因在不同組織中的轉錄和分布明顯不同，在肺、脂肪組織中的轉錄量較高，而在心、十二指腸、回腸、直腸中的轉錄量較低(圖4)。

劃線處為起始密碼子，邊框處為終止密碼子，陰影部分從起始密碼子到終止密碼子依次為預測的RING、BBOX、Coiled-Coil domain、PRY結構域和SPY結構域。結構域起止用三角符號標注The start codon is underlined and the stop codon is boxed.The shaded parts represent the predicted RING domain，two B-box motifs，coiled-coil region，PRV domain，SPRY domain.Use a small triangle to sign the starting point or the ending point of the predicted domain/motif/region圖1　豬TRIM11基因的CDS序列和氨基酸序列Fig.1　The CDS sequence and Amino Acid Sequence of porcine TRIM11

圖2　豬TRIM11蛋白二級結構域模式Fig.2　Schematic model of porcine TRIM11

用MEGA 6軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，不同物種TRIM11蛋白序列從GenBank中獲得，序列號為：JAA53691(Sus scrofa)，XP_004420550.1(Ceratotherium simum simum)，XP_011370226.1 (Pteropus vampyrus)，XP_004780674.1 (Mustela putorius furo)，XP_848259.1(Canis lupus familiaris)，XP_004407123.1(Odobenus rosmarus divergens)，XP_004284071.1(Orcinus orca)，XP_007986332.1 (Chlorocebus sabaeus)，XP_006534642.1 (Mus musculus)，XP_003980669.1(Felis catus)，NP_001071388.1 (Bos taurus)，XP_011542587.1 (Homo sapiens)，XP_013820385.1 (Capra hircus)，XP_006246567.1 (Rattus norvegicus)，XP_006147045.1 (Tupaia chinensis)，XP_008250757.1 (Oryctolagus cuniculus)，XP_010599060.1 (Loxodonta africana)The MEGA 6 software was used to construct the phylogenetic tree with the neighbor-joining method.The protein sequences of TRIM11 from different species were taken from GenBank，under accession numbers：XP_004420550.1 (Ceratotherium simum simum)，XP_011370226.1 (Pteropus vampyrus)，XP_004780674.1 (Mustela putorius furo)，XP_848259.1(Canis lupus familiaris)，XP_004407123.1(Odobenus rosmarus divergens)，XP_004284071.1 (Orcinus orca)，XP_007986332.1 (Chlorocebus sabaeus)，XP_006534642.1 (Mus musculus)，XP_003980669.1 (Felis catus)，NP_001071388.1 (Bos taurus)，XP_011542587.1 (Homo sapiens)，XP_013820385.1 (Capra hircus)，XP_006246567.1 (Rattus norvegicus)，XP_006147045.1 (Tupaia chinensis)，XP_008250757.1 (Oryctolagus cuniculus)，XP_010599060.1 (Loxodonta africana)圖3　不同物種間TRIM11蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.3　Phylogenetic tree of the TRIM11 proteins from different species

圖4　豬TRIM11 mRNA在不同組織中的相對轉錄量Fig.4　Relative porcine TRIM11 mRNA transcription in different tissues

2.4豬TRIM11基因的克隆及PB-TRIM11重組質粒的構建

采用降落PCR技術，擴增TRIM11基因。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得單一目的條帶，目的片段大小與預期的TRIM11基因(1 432 bp)一致(圖5)。將經(jīng)NheⅠ和SwaⅠ雙酶切的載體PiggyBac和豬TRIM11基因連接，轉化Top10感受態(tài)，經(jīng)氨芐青霉素篩選，進行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液送至上海生物工程股份有限公司測序，測序結果Blast分析顯示，該重組質粒包含了豬TRIM11基因CDS序列與兩端的酶切位點序列，提示成功構建了豬PB-TRIM11重組質粒。

M.DNA相對分子質量標準DL2000；1.TRIM11的PCR擴增產(chǎn)物M.DNA marker (DL2000)；1.PCR product of TRIM11圖5　豬TRIM11基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.5　PCR product of pig TRIM11

2.5PB-TRIM11轉染PK15的熒光顯微鏡觀察

將PB-TRIM11重組質粒轉染PK15細胞，由于PiggyBac載體上有綠色熒光蛋白GFP，轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效果(圖6)。經(jīng)嘌呤霉素篩選4周后，可見單克隆出現(xiàn)，細胞GFP表達穩(wěn)定。

2.6豬PB-TRIM11重組質粒在細胞中的表達檢測

以GAPDH為內(nèi)參，熒光定量檢測穩(wěn)定轉染PB-TRIM11細胞中的TRIM11 mRNA的轉錄情況。結果顯示(圖7)，和轉染PiggyBac組相比，穩(wěn)定轉染PB-TRIM11組的TRIM11轉錄量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.7過表達豬TRIM11對PRV病毒增殖的影響

經(jīng)過測定，制得的PRV懸液在PK15細胞上的TCID50為10-6.23·0.1 mL-1。過表達TRIM11組與PiggyBac空載組的細胞分別接種0.1 MOI PRV 12、24、36 h后，于顯微鏡下放大100倍觀察細胞病變情況，可以看到兩組細胞于12 h開始出現(xiàn)病變，24 h細胞變圓形成合胞體病變明顯，36 h細胞脫落明顯出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象。

A1、B1.PK15細胞；A2、A3.轉染PiggyBac空白載體和PB-TRIM11載體48 h的PK15細胞；B2、B3.分別表示轉染PiggyBac空白載體和PB-TRIM11載體28 d的PK15細胞A1，B1.PK15 cells；A2、A3.PK15 cells transfected with PiggyBac empty vector or PB-TRIM11 vector after 48 hours；B2，B3.PK15 cells transfected with PiggyBac empty vector or PB-TRIM11 vector after 28 days (200×)圖6　熒光顯微鏡下轉染結果(200×)Fig.6　Transfection results under fluorescence microscope (200×)

過表達TRIM11組與PiggyBac空載體組的細胞分別接種0.1 MOI PRV 12、24、36 h后，收取細胞上清液檢測病毒滴度發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM11組的病毒滴度始終高于PiggyBac空載體組，這種差異在12 h時更明顯，約1-log10(P<0.05)，隨著時間的延長而縮小，提示過表達TRIM11在PRV感染早期，一定程度上促進了病毒的增殖(圖8)。

Control.轉染PiggyBac vector組；*. P<0.05；以GAPDH為內(nèi)參Control.The PK15 cells stably transfected with PiggyBac vector；* indicated the significant level at 5%；GAPDH was used as internal standard圖7　熒光定量PCR檢測PK15細胞中TRIM11 mRNA轉錄水平Fig.7　The transcription level of TRIM11 mRNA in PK15 cells determined by fluorescence quantitative

*.P<0.05圖8　穩(wěn)定表達TRIM11的PK15細胞對PRV增殖的影響Fig.8　The PK15 cells stably expressing TRIM11 influnence on PRV multiplication

3　討　論

最大的含有RING結構域的蛋白家族是三結構域(TRIM)蛋白也稱為RING/B-box/Coil(RBCC)蛋白家族。在功能上，許多TRIM蛋白家族成員如TRIM8、TRIM25、TRIM32等的RING結構具有E3泛素連接酶活性[9]。近年來的研究表明TRIM蛋白在病毒感染中調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的有關信號通路，調(diào)控抗病毒免疫反應。例如，最近有研究報道TRIM32參與病毒誘導的MITA泛素化修飾，正調(diào)控Ⅰ型干擾素表達信號通路，抑制VSV病毒復制[10]。TRIM25能夠泛素化病毒RNA受體視黃酸誘導基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)的N末端，這種改變能夠激活RIG-Ⅰ下游配體結合參與線粒體抗病毒信號通路(MAVS)直接引起Ⅰ型干擾素(IFN)的產(chǎn)生從而抑制病毒復制[11]。TRIM8通過介導TAK1 K63連接的聚泛素化，在IL-1β和TNFα誘導的NF-κB激活中充當了一個關鍵的調(diào)節(jié)因子，而NF-κB在免疫調(diào)節(jié)中起著關鍵作用，TAK1也參與了模式識別受體介導的信號通路[12]。

TRIM11是TRIM/RBCC蛋白家族中E3泛素連接酶中的一員，因其與人體肽相互作用而被知曉。雖然之前也有報道稱TRIM11參與了HIV-1復制的抑制[13]，但最近在Y.Lee等[4]的研究中發(fā)現(xiàn)在HSV-1感染中TRIM11可以和TBK1(RIG-Ⅰ介導的IFN-β產(chǎn)生信號通路的關鍵因子)的CC2結構域結合抑制IRF3的激活最終導致IFN-β產(chǎn)生的減少，負調(diào)控抗病毒免疫反應，這種作用不依賴于其RING結構域。

偽狂犬病毒(PRV)是一種豬的α皰疹病毒，其與人類病原體單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、HSV-2以及水痘帶狀皰疹病毒有關[14]。推測在PRV感染中TRIM11也可能抑制抗病毒免疫反應。作者選擇豬的TRIM11基因為研究對象，對其進行克隆，構建真核表達載體PB-TRIM11，之后用PB-TRIM11和PiggyBac空載體轉染PK15細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，構建穩(wěn)定細胞系，探究在PK15細胞中過表達 TRIM11 對PK15細胞感染PRV后的影響。結果表明經(jīng)篩選后的轉染PB-TRIM11的PK15細胞比對照組細胞TRIM11基因約過表達1倍。在0.1 MOI的PRV感染細胞0、12、24、36 h時，過表達 TRIM11組上清中的病毒滴度始終高于對照組，且在12 h時這種差異更明顯(P<0.05)，提示過表達TRIM11在PRV感染早期，一定程度上促進了PRV的增殖。以往有研究[15]RIG-Ⅰ介導了PRV感染早期誘導的IFN-β表達，推測TRIM11促進PRV增殖的作用可能與其負調(diào)控RIG-Ⅰ誘導Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的信號通路有關，有待進一步研究。

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(編輯白永平)

Molecular Cloning of PorcineTRIM11 Gene and Its Promotion Effect on Pseudorabies Virus Replicationinvitro

SONG Shuang，ZENG Lei，LU Shao-fang，GUO Zhen-zhen，LU Wei-fei，HAN Li-qiang，WANG Jiang，WANG Yue-ying，CHU Bei-bei*，YANG Guo-yu*

(KeyLaboratoryofAnimalBiochemistyandNutrition，MinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

In order to preliminary study the immunologic functions of porcineTRIM11，the cDNA of the target gene was amplified from the cDNA of porcine submandibular lymph node，the protein structure of porcineTRIM11 was predicted and its tissue expression profile was analysed，the cloned porcineTRIM11 cDNA was connected into PiggyBac (PB) transposon vector，then the recombinant vector (PB-TRIM11) was transfected to PK15 cells to establish stably transfected PK15 cell line.The results showed that the coding length of the cloned porcineTRIM11 was 1 407 bp and the sequence code 468 amino acids.Porcine TRIM11 protein was characterized by the presence of the tripartite motif.Tissue transcription profile analysis showed that，the transcription ofTRIM11 was higher in fat，lung，whereas the transcription of porcineTRIM11 was lower in heart，ileum，recutum，duodenum.DNA sequence analysis ofTRIM11 showed that the clonedTRIM11 cDNA was consistent with sequence from GenBank and the recombinant vector (PB-TRIM11) was constructed.The transfected PK15 cell line stably expressing TRIM11 was established successfully and the transcription ofTRIM11 was identified by qRT-PCR.PK15 cell line that stably express porcine TRIM11 and control cells were infected with pseudorabies virus (PRV)，respectively，then the cell supernatants were harvested at various time points after infection and the virus titers were detected.The results showed that the viral TCID50of theTRIM11 over-expression group was higher than the control all the time.It indicates that theTRIM11 over-expression cells might be more susceptible to PRV.The study provides the experimental basis for the role of porcine TRIM11 in the innate immunity system in the future.

tripartite motif protein；pseudorabies virus；virus multiplication；stable cell line

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.020

2015-12-01

國家自然科學基金(3149600030) ；農(nóng)業(yè)部轉基因專項(2014ZX0801015B)；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(142300413209)

宋爽(1990-)，女，河南許昌人，碩士生，主要從事動物生物化學研究，E-mail:Domhill@163.com

褚貝貝，E-mail: chubeibei_hau@hotmail.com；楊國宇，教授，博士，主要從事動物生物化學研究，E-mail: haubiochem@163.com

S852.4；S852.659.1

A

0366-6964(2016)06-1239-08