崔鵬飛，彭　志，張　芳，關(guān)立崢，肖　麗，李莉莎，鄧國(guó)華*，陳化蘭*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

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四株鴨源H3N8亞型禽流感病毒對(duì)SPF雞的感染性分析

崔鵬飛1，2，彭志2，張芳2，關(guān)立崢1，2，肖麗2，李莉莎2，鄧國(guó)華2*，陳化蘭1，2*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

為評(píng)價(jià)鴨源H3N8亞型禽流感病毒對(duì)雞的感染風(fēng)險(xiǎn)，作者選取了4株HA基因位于不同進(jìn)化分支的病毒進(jìn)行了SPF雞的感染性試驗(yàn)。結(jié)果表明，這4株H3N8亞型禽流感病毒不需要提前適應(yīng)就可以感染雞，病毒對(duì)雞不同臟器的組織嗜性存在較大差異。雞感染病毒后未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，大部分感染雞可以通過(guò)呼吸道和消化道向外排毒。此外，DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013這兩株病毒還可以由感染組的雞傳播給接觸組的雞。綜上所述，本研究中的4株鴨源H3N8亞型禽流感病毒具有感染雞并在雞群間傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)，在家禽的飼養(yǎng)和流通環(huán)節(jié)中應(yīng)盡量避免雞群與鴨群的接觸。

禽流感病毒；H3N8；雞；感染性

H3N8亞型流感病毒宿主范圍廣泛，除了感染野鳥(niǎo)和家禽外，還可以感染馬、犬、貓、豬、海豹、駱駝、驢等多種哺乳動(dòng)物，并且跨物種傳播的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生[1-4]。近期禽流感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明H3亞型禽流感病毒是我國(guó)主要流行的低致病性禽流感病毒亞型之一，NA亞型以N2和N8亞型為主，其中H3N8亞型禽流感病毒主要從養(yǎng)殖場(chǎng)或者活禽市場(chǎng)的家鴨體內(nèi)分離到并且該亞型病毒的分離數(shù)量具有逐年增多的趨勢(shì)[5-7]。雖然H3N8亞型禽流感病毒很少在雞體內(nèi)分離到，但是之前已經(jīng)有一些關(guān)于H3亞型禽流感病毒感染雞的報(bào)道。2002年在意大利的患有中度呼吸道疾病的雞體內(nèi)分離到多株H3N2亞型禽流感病毒，該病毒可以在雞的呼吸道內(nèi)有效復(fù)制并引起雞的產(chǎn)蛋量下降[8]。2006年至2007年期間，蒲娟等對(duì)我國(guó)18個(gè)省市地區(qū)的173個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了H3亞型禽流感病毒的血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果在459份血清中共檢測(cè)出141份樣品為H3亞型禽流感病毒抗體陽(yáng)性[9]。為評(píng)價(jià)H3N8亞型禽流感病毒對(duì)雞群的感染風(fēng)險(xiǎn)，作者選擇了4株HA基因位于不同進(jìn)化分支的鴨源H3N8亞型禽流感病毒進(jìn)行了SPF雞的感染性試驗(yàn)。

1　 材料與方法

1.1毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究用到的病毒包括A/duck/Guangdong/S1286/2009(H3N8)(簡(jiǎn)稱DK/GD/S1286/2009)、A/duck/Hunan/S1674/2013(H3N8)(簡(jiǎn)稱DK/HuN/S1674/2013)、A/duck/Zhejiang/S4088/2013(H3N8)(簡(jiǎn)稱DK/ZJ/S4088/2013)、A/duck/Guizhou/S1245/2013(H3N8)(簡(jiǎn)稱DK/GZ/S1245/2013)，這4株病毒均由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。4周齡SPF雞和9～11日齡SPF雞胚均由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要試劑

病毒RNA提取試劑盒為北京天根生化有限公司產(chǎn)品；RNA酶抑制劑和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品；rTaq DNA聚合酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1為ABI公司產(chǎn)品。

1.3HA基因的進(jìn)化分析

按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取病毒的RNA，RT-PCR擴(kuò)增病毒的HA基因，利用ABI公司的測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1進(jìn)行HA基因序列測(cè)定。經(jīng)DNAStar軟件拼接后，利用MEGA 5.0軟件繪制HA基因進(jìn)化樹(shù)。

1.4雞胚半數(shù)感染量(EID50)測(cè)定

將種毒進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度以0.1 mL·枚-1的劑量接種5枚9～11日齡的SPF雞胚，37 ℃培養(yǎng)48 h后檢測(cè)各稀釋度血凝陽(yáng)性雞胚數(shù)目，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算各病毒的EID50。

1.5病毒對(duì)SPF雞的感染性試驗(yàn)

將病毒稀釋至106EID50·100 μL-1，吸取100 μL稀釋后的病毒液鼻腔感染11只4周齡的SPF雞，感染24 h后放入2只未經(jīng)感染的SPF雞作為空白對(duì)照，以檢測(cè)病毒的傳播能力。感染3 d后，隨機(jī)剖殺3只感染雞，取腦、氣管、胸腺、肝、脾、腎、胰腺、心、法氏囊、盲腸扁桃體和肺，利用雞胚進(jìn)行病毒滴定，以檢測(cè)病毒在雞各臟器的復(fù)制情況。在感染后第3、5和7天分別采集感染雞和空白對(duì)照雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子，利用雞胚進(jìn)行病毒滴定，以檢測(cè)雞的排毒情況。感染后每天觀察并記錄雞的臨床表現(xiàn)，以評(píng)價(jià)病毒對(duì)雞的致病性。在感染后第14天，采血分離血清，通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)雞的血清轉(zhuǎn)陽(yáng)情況。

2　結(jié)　果

2.1HA基因的遺傳演化分析

如圖1所示，本研究的4株H3N8亞型禽流感病毒的HA基因位于4個(gè)不同的進(jìn)化分支，HA基因核苷酸相似性在88.2%～91.2%，氨基酸相似性在95.6%～97.4%。這4株病毒的HA蛋白裂解位點(diǎn)處氨基酸序列均為PEKQT↓RGL，僅具有一個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白第226位點(diǎn)和第228位點(diǎn)分別為谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，具有結(jié)合禽源受體的分子特征。潛在的N-糖基化位點(diǎn)符合以下分子特征：N-X-S/T(其中N為天冬酰胺，X為除了脯氨酸外的任意氨基酸，S為絲氨酸，T為蘇氨酸)，本研究中的4株H3N8亞型禽流感病毒的HA均具有5個(gè)保守的潛在N-糖基化位點(diǎn)，分別為第22位的NGT，第38位的NAT，第165位的NVT，第285位的NGS，第483位的NGT。 此外，DK/GD/S1286/2009和DK/GZ/S1245/2013的HA蛋白在第6位還有一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)NDS，而DK/HuN/S1674/2013和DK/ZJ/S4088/2013的HA蛋白在第8位還有一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)NST。

2.2H3N8亞型禽流感病毒感染雞的臨床癥狀觀察

在14 d的觀察期內(nèi)，所有雞感染H3N8亞型禽流感病毒后均未出現(xiàn)死亡，也未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，對(duì)雞呈現(xiàn)低致病性，與其HA蛋白裂解位點(diǎn)處僅有一個(gè)堿性氨基酸的分子特征相一致。

圖1　H3N8亞型AIV的HA基因進(jìn)化樹(shù)Fig.1　The phylogenetic tree of the HA gene of H3N8 viruses

2.3H3N8亞型禽流感病毒感染雞的排毒檢測(cè)

通過(guò)對(duì)感染后第3、5和7天的咽喉拭子和泄殖腔拭子進(jìn)行滴定，發(fā)現(xiàn)雞感染4株病毒后均可向外界排毒，但是排毒能力卻有較大差異。其中雞感染DK/HuN/S1674/2013后排毒能力較弱，雖然被感染的8只雞中有7只雞發(fā)生血清轉(zhuǎn)陽(yáng)，但是只檢測(cè)到其中3只雞在感染后第3天通過(guò)上呼吸道向外排毒。雞感染DK/GD/S1286/2009、DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013后排毒能力較強(qiáng)，并且感染后第3天以呼吸道排毒為主，在感染后第5 和7天則以消化道排毒為主(表1)。DK/GD/S1286/2009和DK/HuN/S1674/2013的接觸組雞未感染病毒，在咽喉拭子和泄殖腔拭子內(nèi)未檢測(cè)到病毒，血清也未轉(zhuǎn)陽(yáng)，表明這兩株病毒不具備在雞群間傳播的能力。DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013的2只接觸組雞中均有1只可通過(guò)咽喉和泄殖腔向外排毒，并且排毒雞的血清也發(fā)生轉(zhuǎn)陽(yáng)，表明這兩株病毒能夠在雞群間傳播(表1)。

2.4H3N8亞型禽流感病毒感染雞組織中的病毒載量

感染3 d后，隨機(jī)剖殺3只感染組雞，采集腦、氣管、胸腺、肝、脾、腎、胰腺、心、法氏囊、盲腸扁桃體和肺進(jìn)行病毒滴定。結(jié)果這4株病毒對(duì)雞各臟器的組織嗜性存在較大差異，其中DK/HuN/S1674/2013感染組雞的各個(gè)臟器內(nèi)均未檢測(cè)到病毒；DK/GD/S1286/2009感染組的3只雞在氣管、法氏囊和盲腸扁桃體內(nèi)以及部分感染雞的肺、胸腺和腎內(nèi)可以檢測(cè)到病毒。DK/ZJ/S4088/2013感染組只有1只雞可以在胰腺、腎、法氏囊和盲腸扁桃體內(nèi)檢測(cè)到病毒。DK/GZ/S1245/2013感染組只有1只雞可以在氣管內(nèi)檢測(cè)到病毒(表2)。

3　討　論

HA蛋白是流感病毒主要的表面抗原和保護(hù)性抗原，是一種多功能蛋白，與病毒的感染性、致病性、組織嗜性和宿主特異性密切相關(guān)[10-11]。為了評(píng)價(jià)H3N8亞型禽流感病毒對(duì)雞的感染風(fēng)險(xiǎn)，作者選取了4株HA基因位于不同進(jìn)化分支的鴨源H3N8亞型禽流感病毒進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。這4株病毒HA基因的核苷酸差異較大，相似性在88.2%～91.2%，HA蛋白氨基酸相似性在95.6%～97.4%，HA蛋白裂解位點(diǎn)處僅有一個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒的分子特征，雞的感染性試驗(yàn)結(jié)果表明，雞感染這4株H3N8亞型禽流感病毒后均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，與上述低致病性分子特征相一致。

雖然本研究中的4株H3N8亞型禽流感病毒可以感染雞，但是在日常監(jiān)測(cè)過(guò)程中該亞型的病毒主要分離自鴨群，這可能與當(dāng)前我國(guó)家禽的飼養(yǎng)模式有關(guān)。當(dāng)前我國(guó)雞群主要是封閉式飼養(yǎng)，雞群與外界接觸的機(jī)會(huì)比較少；然而我國(guó)家鴨主要是開(kāi)放式飼養(yǎng)，尤其是在水系發(fā)達(dá)的南方地區(qū)，家鴨與候鳥(niǎo)或者留鳥(niǎo)接觸密切，而H3N8亞型禽流感病毒是野鳥(niǎo)主要攜帶的流感病毒亞型之一[12-15]，這就為H3N8亞型禽流感病毒在家鴨與野鳥(niǎo)之間的傳播提供了機(jī)會(huì)。此外，有研究表明禽流感病毒NA蛋白的莖部缺失有利于病毒由水生家禽向陸生家禽的適應(yīng)[16-17]，然而在所有作者分離的H3N8亞型禽流感病毒中均未發(fā)現(xiàn)NA蛋白莖部缺失，這可能也是限制H3N8亞型禽流感病毒在雞群中流行的因素之一。

4　結(jié)　論

本研究中的4株鴨源H3N8亞型禽流感病毒不需要提前適應(yīng)就可以直接感染雞，并且大部分被感染的雞可以通過(guò)呼吸道和消化道向外界排毒，DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013這兩株病毒還可以由感染組的雞傳播給接觸組的雞，具有在雞群間流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，在今后的禽流感監(jiān)測(cè)過(guò)程中應(yīng)密切關(guān)注H3N8亞型禽流感病毒的流行動(dòng)態(tài)，在家禽的飼養(yǎng)和流通環(huán)節(jié)中也應(yīng)盡量避免雞群與鴨群的接觸。

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(編輯白永平)

Infectivity of Four H3N8 Avian Influenza Viruses of Duck Origin in SPF Chickens

CUI Peng-fei1，2，PENG Zhi2，ZHANG Fang2，GUAN Li-zheng1，2，XIAO Li2，LI Li-sha2，DENG Guo-hua2*，CHEN Hua-lan1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.AnimalInfluenzaLaboratoryofMinistryofAgriculture，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)

In order to evaluate the infectious risk of H3N8 avian influenza viruses(AIV) of duck origin to chickens，four H3N8 AIV viruses withHAgenes belonged to different genotypes were selected to challenge SPF chickens.It was demonstrated that the four viruses could infect chickens without pre-adaptation，and the four viruses had different replication capacity in chicken’s organs.After challenge，there weren’t obvious clinical symptoms in chickens，and most challenged chickens could shed viruses through orpharyngeal and cloacal routes.In addition，DK/ZJ/S4088/2013 and DK/GZ/S1245/2013 could transmit from infected chickens to healthy contact chickens.In conclusion，the four duck H3N8 AIV viruses in this study posed the potential risk to infect chickens and even could transmit among chickens，and measures should be taken to avoid the contact between chickens and ducks in the breeding and circulation of poultry.

avian influenza viruses；H3N8；chicken；infectivity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.016

2016-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31572552)

崔鵬飛(1986-)，男，山東費(fèi)縣人，博士生，主要從事禽流感病毒生物學(xué)特性研究，E-mail：cpf8687@126.com

陳化蘭，研究員，E-mail：chenhualan@caas.cn; 鄧國(guó)華，研究員，E-mail：dgh1971@163.com

S852.659.5；S855.3

A

0366-6964(2016)06-1209-06