何祖勇，劉志國，孫燕霞，叢佩清，陳瑤生*

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

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共表達(dá)3種纖維素降解酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立與分析

何祖勇1#，劉志國1，2#，孫燕霞1，叢佩清1，陳瑤生1*

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

本研究旨在應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作能特異性分解纖維素和木質(zhì)素的轉(zhuǎn)基因單胃動(dòng)物，對(duì)于培育高飼料轉(zhuǎn)化率的家畜具有重要的研究意義。利用2A肽策略構(gòu)建由EF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的可同時(shí)表達(dá)3種能夠降解纖維素和木質(zhì)素的酶(EGXA、BGL4和XYNB)的真核表達(dá)載體，并通過原核顯微注射技術(shù)獲得同時(shí)表達(dá)3種酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，2A肽能夠介導(dǎo)3種酶同時(shí)在HEK293A細(xì)胞中正常表達(dá)。通過酶活分析、Western blot和免疫組織化學(xué)等檢測發(fā)現(xiàn)，3種酶均能在轉(zhuǎn)基因小鼠消化系統(tǒng)各組織中表達(dá)，并且具有正?；钚?。本研究結(jié)果表明，在EF1α啟動(dòng)子的控制下，2A肽能夠在小鼠中介導(dǎo)EGXA、BGL4和XYNB的正常表達(dá)，并成功建立表達(dá)外源纖維素酶和木質(zhì)素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為培育具有高飼料轉(zhuǎn)化率的動(dòng)物奠定研究基礎(chǔ)。

β-葡萄糖苷酶；纖維素酶；共表達(dá)；轉(zhuǎn)基因小鼠；木聚糖酶；2A肽

纖維素和木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的主要組成成分，是自然界中含量最為豐富的干物質(zhì)。但是單胃動(dòng)物，如豬和禽類動(dòng)物，因自身不能合成和分泌降解纖維素和木質(zhì)素所需的水解酶而無法利用這兩種物質(zhì)，卻會(huì)因此增加腸道中食糜的黏稠度，嚴(yán)重抑制營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降低飼料轉(zhuǎn)化率[1-2]，此外還會(huì)導(dǎo)致排泄物中的殘余營養(yǎng)物質(zhì)增多，造成環(huán)境污染。在動(dòng)物飼料中人工添加纖維素酶和木聚糖酶雖然可以部分解決這個(gè)問題[3]，但是這無疑會(huì)增加動(dòng)物的養(yǎng)殖成本，并且在飼料的生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)冗^程中還有可能發(fā)生酶活喪失的問題[4]，因此培育能穩(wěn)定表達(dá)纖維素酶和木聚糖酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，利用自身合成分泌的酶來消化飼料中的纖維素和木質(zhì)素，從而無需在飼料中額外添加酶，可能是一種更有效的解決方法。有研究證明，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)微生物酶的可行性[5-11]，但是纖維素的完全水解過程比較復(fù)雜，至少需要3種酶的協(xié)同作用：內(nèi)切-β-1.4-葡糖聚酶(endo-β-1，4-glucanase (EC3.2.l.4))，外切-β-1.4-D-葡糖聚酶(exo-β-1，4-D-glucanase或稱為β-1，4-D-glucan cellobilhydrolase (EC3.2.1.91))以及β-1.4-葡糖苷酶( β-1，4-glucosidase (EC3.2.1.21))。因此，為了有效降解植物細(xì)胞壁，必須在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)同時(shí)表達(dá)至少3種酶。多功能纖維素酶EGXA源于軟體動(dòng)物福壽螺(Ampullariacrossean)[12]，同時(shí)具有內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶3種活性，可水解微晶纖維素、羧甲基纖維素以及木聚糖。相對(duì)于大多來源于細(xì)菌的纖維素酶基因，EGXA具有更高的水解活力以及在更好的低pH環(huán)境下的穩(wěn)定性[13]。BGL4 是一種源于灰質(zhì)腐霉(Humicolagrisea)的葡糖苷酶[7]，不僅具有非常高的酶活力，而且熱穩(wěn)定性好，并同時(shí)具有一定的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性。木聚糖酶XYNB是從橄欖綠鏈霉菌A1(StreptomycesolivaceoviridisA1)中克隆得到的，具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)、熱穩(wěn)定性和金屬離子抗性，且經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后仍能保持大部分活性[14]。因此，選擇這3種酶作為制作轉(zhuǎn)纖維素酶轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的外源基因。

2A肽(2A peptide)的應(yīng)用為多基因共表達(dá)提供了一個(gè)比較有效的方法。2A肽是在研究病毒剪切的過程中發(fā)現(xiàn)的一類具有自剪切功能的短肽，可以介導(dǎo)連接在其上下游的基因以相同的表達(dá)水平進(jìn)行表達(dá)。2A肽由18～22個(gè)氨基酸組成，因其分子量較小，在表達(dá)載體中占用空間較小，從而留給外源功能基因更大的空間。本研究應(yīng)用2A肽策略構(gòu)建由EF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGXA、BGL4、XYNB基因共表達(dá)載體，在HEK293A細(xì)胞系中檢測3個(gè)基因的共表達(dá)情況；進(jìn)一步通過原核顯微注射技術(shù)制備轉(zhuǎn)EGXA、BGL4、XYNB基因小鼠，并分析3種外源基因在組織中的表達(dá)情況。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒、內(nèi)切酶等試劑

真核表達(dá)質(zhì)粒pBluescript Ⅱ SK+、pBudCE4.1分別購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司和Life Technology公司。限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamH Ⅰ、SacⅠ、SpeⅠ、Hind Ⅲ均購自寶生物工程(大連)有限公司。人胚腎細(xì)胞系HEK293A、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購自Life Technology公司。除特別說明外，所有細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑均購自Gibco公司。試驗(yàn)小鼠均為中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)昆明白小鼠(生產(chǎn)合格證號(hào)：SYXK(粵)2011-0112)。

1.2載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列信息，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成源于豬腸病毒(Porcine teschovirus，PTV)，口蹄疫病毒(Foot and mouth picornavirus，F(xiàn)MDV)以及馬鼻炎病毒(Equine rhinitis A virus，ERAV)3種病毒的2A肽DNA序列，并將它們連接到pBluescript Ⅱ SK+載體中，得到攜帶2A序列以及多種酶切位點(diǎn)的載體pBlu-FMDV-2A、pBlu-ERAV-2A以及pBlu-PTV-2A。在EGXA，BGL4 和XYNB 3種經(jīng)過“人源化”密碼子優(yōu)化的DNA序列前端連接牛β-酪蛋白信號(hào)肽[15]，然后通過限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NheⅠ和BamHⅠ分別將其連接到pBlu-FMDV-2A、pBlu-ERAV-2A、pBlu-PTV-2A載體中，使每種基因序列都和一種2A序列連接。將BGL4-2A、XYNB-2A片段通過SacⅠ、SpeⅠ以及Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)克隆到pBlu-EGXA-2A載體上，形成pBlu-EGXA-BGL4-XYNB。

將合成的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescence protein，EGFP)編碼區(qū)序列克隆到pBudCE4.1載體中CMV啟動(dòng)子下游。最后，從pBlu-EGXA-BGL4-XYNB載體上切下EGXA-2A-BGL4-2A-XYNB-2A片段，克隆到pBudCE4.1-EGFP載體中EF1α啟動(dòng)子下游，形成最終的真核多基因共表達(dá)載體pBud-EF1α-EGXA-2A-BGL4-2A-XYNB-CMV-GFP(圖1)，以下簡稱pBud-EGXA-BGL4-XYNB。

2A FMDV、2A ERAV 和2A PTV1分別代表源于口蹄疫病毒、馬鼻炎病毒以及豬腸病毒的2A肽。分別介導(dǎo)EGX A、BGL 4和XYN B 3種基因的共表達(dá)，且同時(shí)可作為檢測3種酶的蛋白標(biāo)簽。EGX A、BGL 4和XYN B 3種基因DNA序列經(jīng)過“人源化”密碼子優(yōu)化，并添加牛β-酪蛋白信號(hào)肽 2A FMDV，2A ERAV and 2A PTV1 represent 2A sequences from FMDV，ERAV and PTV respectively，they mediate the co-expression of EGX A，BGL 4 and XYN B and also can be used as protein tags.The DNA sequences of EGX A，BGL 4 and XYN B were optimized using “humanised” codon usage method and bovine β-Casein signal peptide was added before each gene圖1　3基因共表達(dá)載體pBud-EGX A-BGL 4-XYN B結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　Schematic diagram of pBud-EGX A-BGL 4-XYN B vector

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293A細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基在5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取傳至3～5代的HEK293A細(xì)胞，等細(xì)胞匯合度約80%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在相同條件下，每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個(gè)孔作為重復(fù)。轉(zhuǎn)染4 h后，將無血清培養(yǎng)基換為DMEM培養(yǎng)基(10%FBS)。連續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞熒光觀察，觀察轉(zhuǎn)染效果。在轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4轉(zhuǎn)基因小鼠制備

多基因共表達(dá)載體pBud-EGXA-BGL4-XYNB經(jīng)限制性內(nèi)切酶PvuI酶切后進(jìn)行凝膠電泳回收，稀釋至3～5 ng·μL-1。之后將該質(zhì)粒按照小鼠原核顯微注射標(biāo)準(zhǔn)操作流程注射到昆明白小鼠的受精卵中。試驗(yàn)小鼠的使用符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定，并通過中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核。

1.5轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定

通過PCR反應(yīng)鑒定胚胎移植后出生的小鼠及其后代是否為轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體。取出生后3周的小鼠尾尖，用組織DNA提取試劑盒(Omega，美國)提取DNA后，用表1中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR檢測結(jié)果為陽性的小鼠用于進(jìn)一步的Western blot分析以及酶活性分析。

表1鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和小鼠的引物及其序列

Table 1Primer sequences used in the screening of transgenic cells and mice

引物Primers序列(5'-3')Sequences擴(kuò)增片段長度/bpSizeEGXA-FEGXA-RCAGACCTTGATCGCTTGGGTGGCATGGTGACCGTACAAGA885

1.6Western blot分析

根據(jù)PCR檢測結(jié)果，將陽性小鼠處死，以其全同胞陰性小鼠作為陰性對(duì)照，分別解剖獲取舌、食道、胃、十二指腸、空腸和大腸6種組織。取100 mg組織按照活性蛋白提取試劑盒和全蛋白提取試劑盒(凱基生物，南京)說明書操作提取組織總蛋白，用Bradford法檢測蛋白濃度，分裝保存于-70 ℃。轉(zhuǎn)染后的HEK293A細(xì)胞使用活性蛋白提取試劑盒(凱基生物，南京)提取總蛋白，用Bradford法檢測蛋白濃度，分裝保存于-70 ℃。取適量的蛋白樣品，加入50 μL的SDS-PAGE上樣緩沖液，在10%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后分別以anti-2A肽(Millipore，美國)一抗以及羊抗兔二抗孵育，之后通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法檢測攜帶2A肽的蛋白表達(dá)情況。

1.7免疫組織化學(xué)分析

將轉(zhuǎn)基因陽性小鼠處死，以其全同胞陰性小鼠作為陰性對(duì)照，解剖采集舌、食道、胃、十二指腸、空腸和大腸組織塊，并立即放入液氮中。將組織塊切成6 μm厚的冷凍切片，用丙酮固定15 min后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谶M(jìn)行免疫組織化學(xué)分析時(shí)，先用3% H2O2處理組織切片，去除內(nèi)源性過氧化氫酶活性。再用5%的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)封閉。之后分別以anti-2A肽(Millipore，美國)一抗以及羊抗兔二抗孵育，漂洗后進(jìn)行DAB染色3～20 min，蘇木精復(fù)染1～2 min后，脫水，封片后在顯微鏡下觀察。

1.8酶活性分析

將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細(xì)胞的活性蛋白樣品，以及轉(zhuǎn)基因小鼠、全同胞陰性小鼠的各組織活性蛋白樣品進(jìn)行纖維素和木質(zhì)素酶的酶活性分析。外源基因EGXA的纖維素酶活性按照纖維素酶酶活測定試劑盒(Fluorescent Celluase Assay Kit，Marker Gene Technologies，美國)的原理和操作步驟進(jìn)行酶活測定和分析；外源基因BGL4的葡萄糖苷酶活性按照β-葡萄糖苷酶酶活測定試劑盒(β-Glucosaccharase Assay Kit，BioAssay Systems，美國)的說明書進(jìn)行操作和分析；外源基因XYNB的木聚糖酶活性按照木聚糖酶酶活測定試劑盒(Xylanase assay Kit，Invitrogen，美國)的說明書進(jìn)行酶活測定和計(jì)算[16]。

1.9統(tǒng)計(jì)分析

所有酶活數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。統(tǒng)計(jì)分析使用單因素方差分析以及Duncan’s post-hoc test檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1EGXA、BGL4以及XYNB酶在HEK293A細(xì)胞中的共表達(dá)

本課題組之前已成功在HEK293A細(xì)胞中分別表達(dá)EGXA、BGL4 以及XYNB酶[15-16]。表達(dá)效果良好，酶活力水平較高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證2A肽能否介導(dǎo)這3種纖維素酶同時(shí)在真核細(xì)胞中表達(dá)，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pBud-EGXA-2A-BGL4-2A-XYNB(圖1)。該載體含有兩個(gè)真核啟動(dòng)子，除同時(shí)表達(dá)3種纖維素酶蛋白外，還可同時(shí)表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，以便直觀的觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000在相同條件下分別向HEK293A細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pBud-EGXA-BGL4-XYNB質(zhì)粒以及pEGFP-N1質(zhì)粒(圖2)，pBud-EGXA-BGL4-XYNB轉(zhuǎn)染效率較低，但是仍然能觀察到EGFP蛋白的表達(dá)。

A.HEK293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體PEGFP-N1質(zhì)粒；B.HEK293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染pBud-EGX A-BGL 4-XYN B質(zhì)粒；左邊為明場，右邊為綠色熒光，標(biāo)尺為100 μmA.HEK293A cells transfected with PEGFP-N1；B.HEK293A cells transfected with pBud-EGX A-BGL 4-XYN B；Left panels are bright field photos，right panels are green fluorescent photos.Scale bar=100 μm圖2　HEK293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染pBud-EGX A-BGL 4-XYN B后EGFP蛋白表達(dá)情況Fig.2　Expression of pBud-EGX A-BGL 4-XYN B in HEK293A cell

為進(jìn)一步檢測3種纖維素酶的表達(dá)情況，收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總蛋白，使用anti-2A肽抗體作為一抗，進(jìn)行Western blot檢測(圖略)。檢測發(fā)現(xiàn)EGXA、BGL4以及XYNB蛋白均能正常表達(dá)，且表達(dá)水平基本一致。這進(jìn)一步說明構(gòu)建的多基因表達(dá)載體已經(jīng)有效的轉(zhuǎn)入HEK29A細(xì)胞中，并正常表達(dá)。表明2A肽能夠高效介導(dǎo)EGXA、BGL4以及XYNB蛋白的自我切割。

2.2轉(zhuǎn)EGXA、BGL4和XYNB基因小鼠的制備

通過在HEK293A細(xì)胞中的試驗(yàn)驗(yàn)證2A肽介導(dǎo)的多基因表達(dá)載體的有效性后，進(jìn)一步制作同時(shí)表達(dá)3種纖維素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。將pBud-EGXA-BGL4-XYNB載體線性化后，顯微注射到昆明小鼠的受精卵中，選擇GFP陽性的受精卵(圖3A)移植到代孕母鼠中。代孕母鼠共產(chǎn)下52只小鼠，通過PCR鑒定(圖3B)發(fā)現(xiàn)，其中3只為轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體(TGM02、TGM03和TGM07)。但其中兩只雌性小鼠(TGF02和TGF03)由于未知原因無法生育后代。另外一只雄性小鼠與野生型昆明鼠交配后，獲得10只轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體，其中3只為雌性個(gè)體，7只為雄性個(gè)體(圖3C)。

A.顯微注射pBud-EGX A-BGL 4-XYN B質(zhì)粒4～6 h 后小鼠受精卵中EGFP蛋白的表達(dá)情況，標(biāo)尺為250 μm；B.F0代轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定。左邊7～1.TGM07、TGM06、TGM05、TGM04、TGM03、TGM02 以及TGM01號(hào)小鼠的組織樣品；右邊1～5.TGF01、TGF02、TGF03、TGF04以及 TGF05號(hào)小鼠的組織樣品。C.F1代小鼠的PCR鑒定。M.DNA marker，N.野生型小鼠的組織樣品，P.質(zhì)粒pBud-EGX A-BGL 4-XYN B，擴(kuò)增引物為EGX A-F和EGX A-RA.Photos were taken at 4-6 hours after microinjection.Scale bars=250 μm；B.Identification of F0 generation transgenic mice by PCR.In the left panel，7 to 1 represent the samples from littermates of TGM07，TGM06，TGM05，TGM04，TGM03，TGM02 and TGM01，respectively.In the right panel，1 to 5 represent the samples from littermates of TGF01，TGF02，TGF03，TGF04 and TGF05；C.Identification of F1 generation transgenic mice by PCR.Genomic DNA was isolated from the tails of F0，F(xiàn)1 generation and wild type mice，used as the templates in PCR screening.Primers are EGXA-F and EGXA-R.M，N and P represent DNA marker，negative control and positive control respectively圖3　顯微注射后的小鼠受精卵(A)以及轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定(B、C)Fig.3　Expression of pBud-EGX A-BGL 4-XYN B in mouse embryos (A) and PCR identification of transgenic mouse (B，C)

2.33種纖維素酶在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達(dá)

取TGM05號(hào)轉(zhuǎn)基因小鼠與其全同胞CT03非轉(zhuǎn)基因小鼠處死，解剖，取心、肝、脾、肺、腎、大腦、骨骼肌、胃、大腸、小腸和卵巢共11個(gè)組織的樣品，提取活性蛋白進(jìn)行纖維素酶活性檢測(圖4)。并取消化道組織：舌頭、食道、胃、十二指腸、空腸和大腸等樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(圖5)。

在解剖過程中，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)纖維素酶轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的組織器官有顯著差異。通過對(duì)小鼠不同組織中EGXA、BGL4和XYNB 3種酶活力的檢測發(fā)現(xiàn)，盡管使用的并不是消化道特異性啟動(dòng)子，但3種外源纖維素酶的活性都是在大腸、小腸等組織中最高。另外，除少數(shù)組織中無法檢測出相關(guān)酶活性外(圖4C)，轉(zhuǎn)基因小鼠組織中3種酶的活性均顯著高于野生型小鼠。特別是在大腸與小腸中，轉(zhuǎn)基因小鼠的EGXA和XYNB酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型小鼠(圖4A，B)。不同于EGXA和XYNB酶，BGL4酶活性在轉(zhuǎn)基因小鼠的腎、腦以及卵巢組織中遠(yuǎn)高于野生型小鼠。

取轉(zhuǎn)基因小鼠的胃、大腸和小腸樣品進(jìn)行Western blot檢測3種外源纖維素酶在轉(zhuǎn)基因小鼠的胃腸道中的表達(dá)。檢測發(fā)現(xiàn)(圖4D)，在3個(gè)組織中，胃組織中未發(fā)現(xiàn)3種外源蛋白，而大腸、小腸組織樣中則有明顯的3種外源蛋白的條帶。另外，在3種外源蛋白中，BGL4蛋白在大腸、小腸組織中的表達(dá)量明顯低于EGXA和XYNB，與酶活性檢測結(jié)果一致。酶活性試驗(yàn)和Western blot檢測結(jié)果表明，盡管沒有使用消化道特異性啟動(dòng)子，3種外源纖維素酶仍然在轉(zhuǎn)基因小鼠的大腸、小腸組織中高效表達(dá)，尤其是EGXA和XYNB酶，兩者在大腸和小腸中的活性顯著高于野生型小鼠。

1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.腎；6.腦；7.肌肉；8.胃；9.大腸；10.小腸；11.卵巢。所有酶活數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”，每個(gè)組織的檢測結(jié)果均為同一組織上3個(gè)不同部位樣品檢測結(jié)果的平均值。*.P<0.05。St.胃組織樣品；Li.大腸組織樣品；Si.小腸組織樣品。TG.轉(zhuǎn)基因個(gè)體；WT.野生型個(gè)體1.Heat；2.Liver；3.Spleen；4.Lung；5.Kidney；6.Brain；7.Muscle；8.Stomach；9.Large intestine；10.Small intestine；11.Ovary.Data are expressed as “means±SE”，each column represents 3 different samples from the same tissue.*.P<0.05.St，Li and Si.Stomach，large intestine and small intestine.TG.Transgenic mice;WT.Wild-type mice圖4　轉(zhuǎn)3基因小鼠各組織中EGXA(A)，BGL4(B)以及XYNB(C)3種酶的酶活水平以及蛋白表達(dá)情況(D)Fig.4　Fibrolytic enzyme activities in transgenic mouse and non-transgenic full sib tissues (A，B，C ) and detection of 2A-taged proteins in transgenic mice tissues (D)

轉(zhuǎn)基因小鼠的舌、十二指腸和大腸組織中，外源蛋白的表達(dá)量顯著高于野生型小鼠。TG.轉(zhuǎn)基因個(gè)體；WT.野生型個(gè)體The exogenous proteins were highly expressed in tongue，duodenum and large intestine tissues.Signals were detected using an HRP-DAB system.TG.Transgenic mice;WT.Wild-type mice圖5　轉(zhuǎn)3基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因小鼠消化道組織的免疫組織化學(xué)分析(標(biāo)尺為250 μm)Fig.5　Immunohistochemical analysis of tissues from digestive tracts of transgenic and wild type mice (Scale bar=250 μm)

取轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的舌、食管、胃、十二指腸、空腸、大腸6個(gè)組織的樣品，用anti-2A抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(圖5)。檢測顯示，在整個(gè)消化道中，外源纖維素酶主要在舌、十二指腸和大腸這3個(gè)部位表達(dá)，與酶活性檢測以及Western blot檢測結(jié)果一致。

綜上表明，在不使用組織特異性啟動(dòng)子的情況下，小鼠的舌、大腸、小腸等部位對(duì)外源蛋白的表達(dá)效果較好。提示這些組織可能會(huì)提供一個(gè)相對(duì)溫和的環(huán)境，有利于外源蛋白的積累以及活性的保持。其次，EGXA、BGL4和XYNB 3種纖維素酶中，BGL4蛋白的表達(dá)量和活性均較弱，而這3種酶在HEK293A細(xì)胞中的表達(dá)卻是基本一致的，說明BGL4蛋白在小鼠的腸道中可能更容易被降解。這些發(fā)現(xiàn)有助于今后更好的設(shè)計(jì)和制作消化道特異性表達(dá)外源消化酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，提高外源蛋白的表達(dá)效率。

3　討　論

纖維素是自然界中含量最為豐富的干物質(zhì)，大約占植物干物質(zhì)總量的45%～50%[17]。如果能使單胃動(dòng)物自身合成分泌纖維素酶，降解和利用飼料中的纖維素，不僅能消除纖維素導(dǎo)致的抗?fàn)I養(yǎng)作用，還能充分利用纖維素中的能量，提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率。本研究成功利用2A肽介導(dǎo)3種降解纖維素和木質(zhì)素所必需的酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)協(xié)同表達(dá)，為培育高飼料轉(zhuǎn)化率的動(dòng)物新品種奠定了理論基礎(chǔ)。

2A肽現(xiàn)已被證明能夠高效的介導(dǎo)多個(gè)基因的共表達(dá)，且能使上下游基因以相同的表達(dá)水平進(jìn)行表達(dá)[18]。因此，該技術(shù)比內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、多啟動(dòng)子、融合蛋白等策略更具優(yōu)勢(shì)。在本研究中，使用3種來源于不同物種的2A序列，以避免在質(zhì)粒載體制備過程中可能發(fā)生的同源重組。與此同時(shí)，本研究結(jié)果表明，2A肽可以直接作為鑒定外源蛋白的標(biāo)簽，從而免去了制備特異性抗體的繁瑣過程。Western blot檢測表明，3種不同來源的2A肽都能高效的進(jìn)行自我切割，沒有形成多蛋白融合體。而酶活檢測則證明共表達(dá)的3種外源纖維素酶EGXA、BGL4和XYNB都具有正常功能，2A肽的添加并沒有影響這3種蛋白的折疊以及蛋白功能，與前人的研究結(jié)果一致[19-20]，表明2A肽能夠有效地介導(dǎo)多順反子的共表達(dá)。

本研究在建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型時(shí)，沒有使用組織特異性啟動(dòng)子如腮腺分泌蛋白(Parotid secret protein，PSP)啟動(dòng)子[11]或其他消化道特異表達(dá)的啟動(dòng)子。而是使用了組成性啟動(dòng)子EF-1α，目的是為了觀察小鼠的哪些組織部位能更高效表達(dá)外源纖維素酶并保持其活性。通過Western blot、酶活試驗(yàn)以及免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)，3種外源纖維素酶在轉(zhuǎn)基因小鼠的舌、大腸、小腸等部位有較高表達(dá)，而在食管和胃等組織中卻基本沒有表達(dá)。這可能說明在哺乳動(dòng)物的消化道中，口腔、大腸和小腸等組織更容易合成、分泌外源纖維素酶蛋白以及保持其活性，因此更適合作為表達(dá)外源蛋白的靶點(diǎn)。另外，在轉(zhuǎn)入的3種纖維素酶中，盡管BGL4酶在小鼠腸道中的活性與野生型小鼠相比有顯著差異，但其活性與EGXA、XYNB相比較低。這可能是BGL4蛋白與其他兩種蛋白相比，穩(wěn)定性較差導(dǎo)致的。將其替換為穩(wěn)定性、耐酸堿能力更強(qiáng)的葡糖苷酶可能會(huì)獲得更好效果。

本研究表明，2A肽能夠有效介導(dǎo)3個(gè)外源基因在HEK293A細(xì)胞以及小鼠中的共表達(dá)。并獲得3基因共表達(dá)轉(zhuǎn)纖維素酶轉(zhuǎn)基因小鼠，為培育具有高飼料轉(zhuǎn)化率的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物奠定基礎(chǔ)。

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(編輯程金華)

Generation of a Transgenic Mouse Model Co-expressing Three Fibrolytic Enzyme Genes

HE Zu-yong1#，LIU Zhi-guo1，2#，SUN Yan-xia1，CONG Pei-qing1，CHEN Yao-sheng1*

(1.StateKeyLaboratoryofBiocontrol，SchoolofLifeSciences，SunYatSenUniversity，Guangzhou510006，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

By expressing fibrolytic enzymes targeting cellulose and xylan through transgenic technology，new breeds of monogastric animals with enhanced feed conversion rates could be developed.Here we described the co-expression of cellulase genesEGXA andBGL4，and the xylanase geneXYNB，under the control of EF1α promoter and linked via 2A peptides，in both HEK293A cells and transgenic mice.Recombinant enzyme expression was detected in gastrointestinal tract as determined by both Western blot and immunohistochemistry，and were functionally active in cellulolytic enzyme assays.Notably，all 3 fibrolytic enzymes were highly expressed in the intestine tissue of transgenic mice.In summary，we have demonstrated that the EF1α promoter in conjunction with 2A peptide sequences could successfully mediate the co-expression ofEGXA，BGL4 andXYNB genes in transgenic mice.The study presents a feasible method for generating genetically modified animals with enhanced feed conversion ability.

β-glucosidase；cellulase；co-expression；transgenic mice；xylanase；2A peptide

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.011

2015-11-19

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1201213)；國家轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08006005-005)

何祖勇(1981-)，男，福建莆田人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究，E-mail:zuyonghe@foxmail.com，Tel：020-39943536；劉志國(1986-)，男，河北唐山人，助理研究員，博士，主要從事胚胎工程與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究，E-mail: zhiguoliu2010@126.com，Tel：010-62813339。何祖勇和劉志國為共同第一作者

陳瑤生，教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：chyaosh@mail.sysu.edu.cn

Q78

A

0366-6964(2016)06-1162-08