張永寧，宋姍姍，吳紹強(qiáng)，林祥梅

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029)

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施馬倫貝格病毒核衣殼蛋白的表達(dá)及單克隆抗體制備

張永寧#，宋姍姍#，吳紹強(qiáng)，林祥梅*

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029)

為表達(dá)與純化具有天然構(gòu)象的施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)核衣殼(N)蛋白，并制備其單抗(McAb)，本研究在SBV-N基因的N端加入6個(gè)組氨酸(6×His)標(biāo)簽后，將其克隆至桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacTM1中，構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFastBac-His-SBV-N。將pFastBac-His-SBV-N轉(zhuǎn)化DH10BacE.coli，通過藍(lán)白斑篩選獲得重組桿粒rBacmid-His-SBV-N。將rBacmid-His-SBV-N轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞制備表達(dá)His-SBV-N融合蛋白的重組桿狀病毒，借助Ni-NTA瓊脂糖純化重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中的His-SBV-N蛋白。以純化的His-SBV-N免疫BALB/c小鼠制備McAb，利用ELISA疊加試驗(yàn)檢測(cè)McAb抗原識(shí)別位點(diǎn)的異同，并采用高碘酸鈉法對(duì)識(shí)別不同抗原表位的McAb進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記。最終獲得了4株識(shí)別不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并進(jìn)行了HRP標(biāo)記；亞型鑒定表明，2A11為IgG1亞型，2E1、4H11和6E12均為IgG2b亞型；間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，4株McAb均能夠識(shí)別穩(wěn)定表達(dá)SBV-N蛋白的BHK-21細(xì)胞系；Western blot進(jìn)一步表明，HRP標(biāo)記的4株McAb均與His-SBV-N蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制備，為施馬倫貝格病血清學(xué)檢測(cè)方法的建立提供了良好的生物材料。

施馬倫貝格病毒；核衣殼蛋白；桿狀病毒表達(dá)載體；昆蟲細(xì)胞；單克隆抗體

施馬倫貝格病是由布尼亞病毒科(Bunyaviride)正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)的施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)引起的一種以發(fā)熱、腹瀉、產(chǎn)奶量下降及孕畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或畸形胎為主要臨床癥狀的蟲媒病[1-2]，傳播媒介為庫(kù)蠓[3]，主要感染綿羊、牛和山羊等反芻動(dòng)物[1-2]。公開資料顯示，目前該病主要流行于歐洲地區(qū)，而且呈現(xiàn)出向其他國(guó)家傳播的趨勢(shì)[4-6]。

SBV為單股負(fù)鏈的RNA病毒，基因組分為L(zhǎng)、M和S三個(gè)基因節(jié)段[1，7]。S基因核苷酸序列相對(duì)保守，編碼核衣殼(N)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs[7]；N蛋白由702個(gè)核苷酸編碼，相對(duì)分子質(zhì)量約為26 ku[7-8]。N蛋白是SBV病毒粒子中含量豐富、免疫原性強(qiáng)的蛋白質(zhì)，能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生早期抗體，成為SBV診斷的靶抗原[9-10]。

作者利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SBV-N蛋白，并制備其McAb(monoclonal antibody)，進(jìn)而篩選識(shí)別不同抗原表位的McAb進(jìn)行HRP標(biāo)記，以期為施馬倫貝格病血清學(xué)檢測(cè)方法的建立提供生物材料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑Ni-NTA瓊脂糖和質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；EcoRⅠ和NotⅠ為New England Biolabs公司產(chǎn)品；Sf-900 Ⅱ SFM、Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基和Cellfectin?Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑盒均為Invitrogen公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Protein G Sepharose購(gòu)自GE Healthcare公司；羅丹明(TRITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(IgG-TRITC)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)、高碘酸鈉和鼠McAb分型試劑盒購(gòu)自Sigma公司。

1.1.2質(zhì)粒、載體和細(xì)胞pET-28a-SBV-N重組質(zhì)粒[11]、pFastBacTM1桿狀病毒表達(dá)載體、DH5α、DH10BacE.coli、Sf9昆蟲細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)SBV-N蛋白的BHK-21細(xì)胞(BHK-21-EGFP-SBV-N)[12]均由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室制備和/或保存。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2SBV-N基因的擴(kuò)增與純化

根據(jù)GenBank中SBV的N基因序列(登錄號(hào)HE649914)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并在上游引物5′端引入EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn)和6×His編碼序列(斜體部分)，下游引物5′端引入NotⅠ的識(shí)別位點(diǎn)。上游引物為：5′ -CGGAATTCATGCATCACCATCACCATCACATGTCAAGCCAATTCATT-3′(下劃線處為EcoR Ⅰ識(shí)別位點(diǎn))，下游引物為：5′-TTTATAG-CGGCCGCTTAGATGTTGATACCGAATTGCTGCAAG-3′(下劃線處為NotⅠ識(shí)別位點(diǎn))，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為745 bp。以pET-28a-SBV-N為模板，68 ℃的退火溫度PCR擴(kuò)增N基因序列。PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化。

1.3重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)PCR回收產(chǎn)物和pFastBacTM1載體分別進(jìn)行EcoRⅠ/NotⅠ雙酶切(37 ℃，2 h)，利用T4 DNA連接酶連接兩者的回收片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5αE.coli，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落搖菌進(jìn)行測(cè)序鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒命名為pFastBac-His-SBV-N。

1.4重組桿粒的構(gòu)建

將pFastBac-His-SBV-N轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒穿梭載體(桿粒)的DH10BacE.coli，涂布于含卡那霉素(50 μg · mL-1)、四環(huán)素(10 μg · mL-1)和慶大霉素(7 μg · mL-1)、Bluo-gal(100 μg · mL-1)和IPTG(40 μg · mL-1)的LB瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，借助藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組桿粒命名為Bacmid-His-SBV-N。

1.5重組桿狀病毒的制備

按照Invitrogen Cellfectin?Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑說明書，將rBacmid-His-SBV-N轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)96 h左右，待細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、形成出芽囊泡、直至細(xì)胞發(fā)生解離甚至崩解時(shí)，離心(500×g，5 min)收集細(xì)胞上清液，即為第1代(P1)重組桿狀病毒，置4 ℃避光保存。將P1代重組桿狀病毒接種Sf9細(xì)胞獲得第2代(P2)重組桿狀病毒；以相同的方式獲得第3代(P3)重組桿狀病毒。同時(shí)設(shè)置pFastBacTM1空載體重組桿粒(rBacmid)轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6重組His-SBV-N蛋白的純化

收集P3代重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞(約9×107個(gè))，利用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心(4 ℃，12 000×g，5 min)收集蛋白質(zhì)上清液，利用Ni-NTA瓊脂糖純化其中的重組His-SBV-N蛋白，具體操作參照文獻(xiàn)[12]。

1.7重組His-SBV-N蛋白McAb的制備與純化

以純化的His-SBV-N蛋白為免疫原免疫6周齡BALB/c小鼠，采用常規(guī)的方法建立穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株，利用Protein G Sepharose從小鼠腹水中純化McAb，參考文獻(xiàn)[13]操作。

1.8McAb抗原識(shí)別位點(diǎn)的分析

將His-SBV-N蛋白以2 μg · mL-1的量包被ELISA板，經(jīng)過洗滌、封閉，將各株McAb分別稀釋至飽和稀釋度后，向每孔加入100 μL，37 ℃反應(yīng)30 min；洗滌后兩兩組合加入另一株McAb，37 ℃反應(yīng)30 min；洗滌后向每孔加入100 μL工作濃度的山羊抗小鼠IgG-HRP，37 ℃反應(yīng)30 min；洗滌后加底物顯色，測(cè)定OD450 nm值；按照文獻(xiàn)[14]給出的公式計(jì)算兩種McAb疊加后的相加指數(shù)，藉此判定McAb識(shí)別抗原位點(diǎn)的異同。

1.9McAb的亞型鑒定

利用Sigma公司的鼠McAb分型試劑對(duì)McAb進(jìn)行亞型鑒定，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.10McAb的間接免疫熒光試驗(yàn)

制備BHK-21-EGFP-SBV-N細(xì)胞爬片，以制備的McAb為一抗、山羊抗小鼠IgG-TRITC為二抗對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，利用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，操作參照文獻(xiàn)[12]。

1.11McAb的HRP標(biāo)記及效價(jià)測(cè)定

稱取5 mg HRP溶于1 mL蒸餾水，加入0.2 mL新配的0.1 mol · L-1高碘酸鈉溶液，室溫避光攪拌20 min；將溶液裝入透析袋中，置1 mmol · L-1(pH4.4)乙酸鈉緩沖液中4 ℃過夜透析；取出HRP溶液，用0.2 mol · L-1(pH9.5)碳酸鹽緩沖液將pH值調(diào)整至9.0～9.5，立即加入5 mg純化的McAb，室溫避光反應(yīng)2 h；加入0.1 mL 4 mg · mL-1的硼氫化鈉溶液，室溫避光反應(yīng)2 h；將上述液裝入透析袋，利用PBS(pH7.4)4 ℃過夜透析，透析期間換液2次。

利用間接ELISA測(cè)定McAb效價(jià)。將純化的SBV-N蛋白以2 μg · mL-1濃度包被ELISA板，100 μL · 孔-1，將HRP標(biāo)記的McAb從1∶500開始作2倍比稀釋，以免疫前的小鼠血清作為陰性對(duì)照，以P/N≥2.1的最大稀釋度作為McAb效價(jià)。

1.12HRP標(biāo)記McAb的Western blot鑒定

將純化后的His-SBV-N蛋白從12% SDS-PAGE膠中轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以HRP標(biāo)記的McAb為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

2　結(jié)　果

2.1His-SBV-N目的基因的擴(kuò)增

以pET-28a-SBV-N為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物PCR擴(kuò)增目的基因。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增獲得一條約745 bp的目的片段(圖1)，與預(yù)期相符。

1．陰性對(duì)照；2．DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3．pET-28a-SBV-N重組質(zhì)粒1．Negative control；2．DL2000 DNA marker；3．The recombinant pET-28a-SBV-N plasmid圖1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1　Agarose gel electrophoresis analysis of the PCR amplification product

2.2pFastBac-His-SBV-N的構(gòu)建與鑒定

回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)EcoRⅠ/NotⅠ酶切后，將其克隆至桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacTM1中構(gòu)建pFastBac-His-SBV-N。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明，N基因序列、插入位置以及閱讀框均準(zhǔn)確無誤(圖略)。

2.3rBacmid-His-SBV-N的篩選與鑒定

將pFastBac-His-SBV-N轉(zhuǎn)化DH10BacE.coli，經(jīng)過抗性和藍(lán)白斑篩選，pFastBac-His-SBV-N與DH10BacE.coli內(nèi)含有的桿粒進(jìn)行位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座，最終形成rBacmid-His-SBV-N。抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果證實(shí)His-SBV-N基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)座至Bacmid中(圖略)，說明rBacmid-His-SBV-N構(gòu)建成功。

2.4重組桿狀病毒的制備與滴度測(cè)定

抽提rBacmid-His-SBV-N，轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9昆蟲細(xì)胞。與正常Sf9細(xì)胞對(duì)照相比(圖2A)，轉(zhuǎn)染rBacmid-His-SBV-N(圖2B)和rBacmid(圖2C)的細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞體積變大、變圓，并形成出芽囊泡，部分細(xì)胞脫落漂浮，于轉(zhuǎn)染后120 h左右出現(xiàn)細(xì)胞崩解等現(xiàn)象(圖2D)。滴度測(cè)定結(jié)果表明，P1、P2和P3代重組桿狀病毒的滴度分別為6×106、7×107和6×108空斑形成單位· mL-1。

2.5重組His-SBV-N蛋白的純化

提取P3代重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞總蛋白，利用Ni-NTA對(duì)其中的重組His-SBV-N蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，His-SBV-N蛋白得以成功純化，其純度達(dá)90%以上(圖3，泳道5)，質(zhì)量濃度約為0.1 mg · mL-1。

2.6McAb的篩選與亞型鑒定

借助ELISA疊加試驗(yàn)檢測(cè)每株McAb抗原識(shí)別位點(diǎn)的異同，最終獲得了4株識(shí)別不同抗原表位的McAb，分別命名為2A11、2E1、4H11和6E12。亞型鑒定表明，2A11為IgG1亞型，2E1、4H11和6E12均為IgG2b亞型。SDS-PAGE顯示，4株McAb的純度均在95%以上，抗體的重鏈(Mr為56 000)和輕鏈(Mr為28 000)清晰可辨(圖4)。

A.正常Sf9細(xì)胞；B.轉(zhuǎn)染rBacmid-His-SBV-N 96 h的Sf9細(xì)胞；C.轉(zhuǎn)染rBacmid 96 h的Sf9細(xì)胞；D.轉(zhuǎn)染rBacmid-His-SBV-N 120 h的Sf9細(xì)胞A.Normal Sf9 cells；B.Sf9 cells transfected with the rBacmid-His-SBV-N for 96 h；C.Sf9 cells transfected with the rBacmid for 96 h；D.Sf9 cells transfected with the rBacmid-His-SBV-N for 120 h圖2　重組桿狀病毒在Sf9昆蟲細(xì)胞中的增殖(60×)Fig.2　Proliferation of the recombinant baculoviruses in Sf9 insect cells (60×)

1．蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2．rBacmid轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞總蛋白質(zhì)；3．正常Sf9細(xì)胞總蛋白質(zhì)；4．rBacmid-His-SBV-N轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞總蛋白質(zhì)；5．經(jīng)Ni-NTA純化的重組His-SBV-N蛋白1．Prestained protein marker；2．Total cellular proteins extracted from Sf9 cells transfected with the rBacmid；3．Total cellular proteins extracted from normal Sf9 cells；4．Total cellular proteins extracted from Sf9 cells transfected with the rBacmid-His-SBV-N；5．The recombinant His-SBV-N protein purified by Ni-NTA agarose圖3　重組His-SBV-N蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis of the recombinant His-SBV-N protein

M．蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．單抗2E1；2．單抗2A11；3．單抗4H11；4．單抗6E12M．Prestained protein marker；1．McAb 2E1；2．McAb 2A11；3．McAb 4H11；4．McAb 6E12圖4　純化后的單克隆抗體的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of the purified McAbs

2.7McAb的免疫熒光分析

分別以McAb 2A11、2E1、4H11和6E12為一抗，山羊抗小鼠IgG-TRITC為二抗對(duì)BHK-21-EGFP-SBV-N細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果表明，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的綠色點(diǎn)狀熒光信號(hào)(自發(fā)信號(hào))能夠與紅色點(diǎn)狀熒光信號(hào)(染色信號(hào))發(fā)生共定位(圖5A)，證實(shí)McAb 2A11能夠識(shí)別SBV-N蛋白；其他3株McAb亦能與BHK-21-EGFP-SBV-N細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)(圖略)。但腹腔注射SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的BALB/c小鼠的腹水與BHK-21-EGFP-SBV-N不反應(yīng)(圖5B)。

2.8HRP標(biāo)記McAb的鑒定與效價(jià)測(cè)定

利用高碘酸鈉氧化法對(duì)4株McAb進(jìn)行HRP標(biāo)記，通過Western blot檢測(cè)HRP標(biāo)記的McAb與His-SBV-N蛋白的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，HRP標(biāo)記的4株McAb均可特異性地識(shí)別His-SBV-N蛋白(圖6)。間接ELISA證實(shí)，4株HRP標(biāo)記McAb的效價(jià)均在1∶512 000以上。

A．單抗2A11與BHK-21-EGFP-SBV-N細(xì)胞反應(yīng)情況分析；B．McAb (-)與BHK-21-EGFP-SBV-N細(xì)胞反應(yīng)情況分析[McAb (-)表示腹腔注射SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的BALB/c小鼠腹水]A．The reactivity of McAb 2A11 with BHK-21-EGFP-SBV-N cell line；B．The reactivity of McAb (-) with BHK-21-EGFP-SBV-N cell line [McAb (-) indicates the ascitic fluid of a BALB/c mouse which was intraperitoneally injected with SP2/0 myemola cells]圖5　純化后的單克隆抗體的間接免疫熒光分析Fig.5　Indirect immunofluorescence assay of the purified McAbs

M．蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．HRP標(biāo)記的單抗2E1；2．HRP標(biāo)記的單抗2A11；3．HRP標(biāo)記的單抗4H11；4．HRP標(biāo)記的單抗6E12M．Prestained protein marker；1．HRP-conjugated McAb 2E1；2．HRP-conjugated McAb 2A11；3．HRP-conjugated McAb 4H11；4．HRP-conjugated McAb 6E12圖6　HRP標(biāo)記的單克隆抗體的Western blot分析Fig.6　Western blot analysis of the HRP-conjugated McAbs

3　討　論

施馬倫貝格病的暴發(fā)已經(jīng)給有關(guān)國(guó)家的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[15-17]。雖然歐盟從自身經(jīng)濟(jì)利益的考量而堅(jiān)稱該病對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)影響有限，但是有關(guān)研究表明SBV對(duì)家畜和野生動(dòng)物的危害重于藍(lán)舌病病毒[18]。2014年夏季以來，德國(guó)疫區(qū)內(nèi)的某些養(yǎng)殖場(chǎng)再度暴發(fā)施馬倫貝格病疫情[19]，說明該病對(duì)畜牧業(yè)的危害仍然不容小覷。截至目前，我國(guó)尚未出現(xiàn)相關(guān)疫情[6]，做好應(yīng)對(duì)該病的技術(shù)儲(chǔ)備意義重大。

近年來，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)憑借其高表達(dá)水平及翻譯后的良好修飾功能等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于疫病診斷抗原的制備[20]。利用該系統(tǒng)可以獲得大量抗原性、免疫原性較好，結(jié)構(gòu)與功能接近天然蛋白質(zhì)的可溶性重組蛋白質(zhì)[21]。作者成功構(gòu)建了表達(dá)SBV-N蛋白的重組桿狀病毒，通過感染Sf9昆蟲細(xì)胞獲得了重組SBV-N蛋白。為方便蛋白質(zhì)純化，在構(gòu)建重組供體質(zhì)粒時(shí)將His標(biāo)簽編碼序列引入SBV-N基因的N端，最終獲得了N端帶有6×His標(biāo)簽的SBV-N融合蛋白質(zhì)。為探索Ni-NTA瓊脂糖對(duì)該蛋白質(zhì)的純化效果，作者通過漸進(jìn)式提高洗滌緩沖液中的咪唑濃度最終獲得了高純度的重組SBV-N蛋白。并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步制備了SBV-N蛋白的McAb，借助ELISA疊加試驗(yàn)篩選了4株識(shí)別不同抗原表位的McAb，為施馬倫貝格病雙抗體夾心ELISA的建立提供了必需的生物材料。此外，作者對(duì)獲得的4株McAb進(jìn)行了HRP標(biāo)記，以進(jìn)一步提高檢測(cè)效率。

施馬倫貝格病是一種外來與新發(fā)動(dòng)物疫病，國(guó)內(nèi)缺乏病原材料而難以驗(yàn)證McAb與天然SBV-N蛋白的反應(yīng)情況。鑒于此，本研究利用間接免疫熒光分析了McAb與穩(wěn)定表達(dá)SBV-N蛋白的BHK-21細(xì)胞系的反應(yīng)性，結(jié)果表明4株McAb均能夠識(shí)別具有空間構(gòu)象的SBV-N蛋白。此外，Western blot進(jìn)一步表明4株McAb能夠與SBV-N蛋白發(fā)生反應(yīng)，說明制備的McAb具有良好的應(yīng)用潛力。

4　結(jié)　論

His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制備，為施馬倫貝格病血清學(xué)檢測(cè)方法的建立提供了有價(jià)值的生物材料。

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(編輯白永平)

Expression of the Nucleocapsid Protein of Schmallenberg Virus Using the Bac-to-Bac?Baculovirus Expression System and Preparation of Monoclonal Antibodies against This Protein

ZHANG Yong-ning#，SONG Shan-shan#，WU Shao-qiang，LIN Xiang-mei*

(InstituteofAnimalQuarantine，ChineseAcademyofInspectionandQuarantine，Beijing100029，China)

The objective of this study was to express and purify the nucleocapsid (N) protein of Schmallenberg virus (SBV) with the native conformation，and to prepare its monoclonal antibodies (McAbs).To this end，the SBV-N gene with an inserted coding sequence for an N-terminal hexahistidine (6×His) tag was cloned into the pFastBacTM1 vector.The resulting recombinant donor plasmid，pFastBac-His-SBV-N，was then transformed into DH10BacE.colicompetent cells.After selection with the blue/white screen，the recombinant bacmid，rBacmid-His-SBV-N，was transfected into Sf9 insect cells to generate recombinant baculoviruses that express the His-SBV-N fusion protein.After amplifying the recombinant baculoviral stocks on Sf9 cells，His-SBV-N fusion protein was purified using nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose.The purified protein was then used to immunize BALB/c mice to prepare SBV-N-specific McAbs，and an indirect double-antibody binding ELISA was applied to detect whether the generated McAbs recognize different antigenic sites.The screened McAbs that recognize different antigenic sites were labeled with horseradish peroxidase (HRP) using the sodium periodate oxdization method.Finally，four McAbs (2A11，2E1，4H11 and 6E12) recognizing different antigenic sites were successfully obtained and labeled with HRP.The results of isotype identification demonstrated that 2A11 belongs to IgG1，and 2E1，4H11 and 6E12 belong to IgG2b.Indirect immunofluorescence assays revealed that all of the four McAbs reacted with the BHK-21 cell line stably expressing the SBV-N protein (BHK-21-EGFP-SBV-N).Western blot analyses further showed that the four HRP-conjugated McAbs reacted positively with the His-SBV-N fusion protein.Taken together，the successful preparation of His-SBV-N fusion protein and its McAbs provide valuable biological materials that can be used in the serological diagnosis of Schmallenberg disease.

Schmallenberg virus (SBV)；nucleocapsid (N) protein；baculovirus expression vector；insect cells；monoclonal antibody (McAb)

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.06.026

2015-08-19

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAD12B01)；中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院“青年英才計(jì)劃”項(xiàng)目(CAIQ-YC-20140205)；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013IK054)

張永寧(1980-)，男，山東日照人，副研究員，博士，主要從事外來動(dòng)物疫病檢疫研究，E-mail: zhangyn@caiq.gov.cn；宋姍姍(1986-)，女，山東德州人，碩士，主要從事外來動(dòng)物疫病檢疫研究，E-mail: 2005203776@163.com。二者為共同第一作者

林祥梅，E-mail：linxm@caiq.gov.cn

S852.659.5

A

0366-6964(2016)06-1280-07