譚詠梅　楊小軍　杜娟　趙望泓　陳曉丹　侯晉.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科；.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院衛(wèi)生監(jiān)測中心，廣州 5055；.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科，汕頭 5504

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牙齦卟啉單胞菌合成環(huán)二腺苷酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性分析

譚詠梅1楊小軍1杜娟2趙望泓1陳曉丹3侯晉1
1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科；2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院衛(wèi)生監(jiān)測中心，廣州 510515；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科，汕頭 515041

[摘要]目的定性檢測牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）是否能產(chǎn)生細(xì)菌信號分子環(huán)二腺苷酸（c-di-AMP），為探索其在P.gingivalis生命代謝以及牙周炎免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。方法以P.gingivalis標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33277為實驗菌株，抽提細(xì)菌內(nèi)核酸物質(zhì)作為樣品，配置c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）和高效液相色譜法（HPLC）對樣品進行驗證。結(jié)果HPLC-MS/MS檢出限按照信噪比（S/N）3∶1計算，c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間為7.49 min，P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82 min時有目標(biāo)峰出現(xiàn)（大于3 S/N）。HPLC檢測結(jié)果表明，P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品均在15.7 min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，且二者的紫外吸收光譜相同。結(jié)論牙齦卟啉單胞菌核酸提取物中含有c-di-AMP，牙齦卟啉單胞菌可以合成產(chǎn)生c-di-AMP。

[關(guān)鍵詞]環(huán)二腺苷酸；牙齦卟啉單胞菌；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Supported by: National Natural Science Foundation of China (81500870);President Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2013Z006, 2012C005).Correspondence: Hou Jin, E-mail: houjin@smu.edu.cn.

環(huán)二鳥苷酸[bis-（3’-5’）-cyclic dimeric guano-sine monophosphate，c-di-GMP]和環(huán)二腺苷酸[bis-（3’-5’）-cyclic dimeric adenosine monophosphate，c-di-AMP]是近年來新發(fā)現(xiàn)的，在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在的信號分子[1-2]。目前的研究結(jié)果顯示，c-di-GMP作為第二信使，在細(xì)菌的蠕動、毒力因子的表達(dá)、生物膜的形成、細(xì)胞周期、細(xì)胞間通訊以及細(xì)菌對宿主細(xì)胞的入侵等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，是細(xì)菌生存和代謝的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一[3-5]。與c-di-GMP相比，c-di-AMP的發(fā)現(xiàn)較晚，研究相對較少，因此對其功能了解十分有限?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，c-di-AMP與細(xì)菌肽聚糖穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞耐藥性、細(xì)菌大小、生物膜形成、肺炎鏈球菌菌鏈的長度以及細(xì)菌感染有著密切的關(guān)系，并且其在不同的菌種中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)功能[6]。

c-di-AMP是通過二腺苷酸環(huán)化酶（diadenylate cyclase，DAC）由兩分子的ATP或ADP合成而來，而其降解代謝與c-di-GMP一樣都是通過磷酸二酯酶來完成。2008年Witte等[7]在研究細(xì)菌的Checkpoint 蛋白DisA的過程中發(fā)現(xiàn)，該蛋白結(jié)構(gòu)中有一個未知功能的結(jié)構(gòu)域147（domain of unknown function 147，DUF147），其具有二腺苷酸環(huán)化酶的活性，能將兩分子的ATP合成一分子的環(huán)二磷酸腺苷，因此該結(jié)構(gòu)域又被命名為DAC結(jié)構(gòu)域。由于該結(jié)構(gòu)域多耦聯(lián)于DisA蛋白中，并且位于DisA蛋白的氨基端，所以又被稱為DisA_N結(jié)構(gòu)域。Pfam數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)顯示，11 352個物種中都含有DisA_N結(jié)構(gòu)域。說明c-di-AMP這個信號分子在細(xì)菌中廣泛存在。通過常規(guī)的生物學(xué)方法敲除c-di-AMP的合成蛋白基因會導(dǎo)致多種細(xì)菌死亡，提示c-di-AMP在細(xì)菌的生命代謝過程中發(fā)揮著重要作用，是細(xì)菌生長所必需的信號分子。除此之外，c-di-AMP還可以作為病原相關(guān)的分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被宿主細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）特異性識別，激活宿主的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)[2]。

雖然研究者已經(jīng)在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[8]、李斯特菌（Listeria monocytogenes）[9]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[10]以及乳酸球菌（Lactococcus lactis）[11]等細(xì)菌的核酸提取物中檢測到了c-di-AMP的存在，但有關(guān)牙周炎致病菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）中c-di-AMP的研究迄今為止未見報道。本研究的目的是通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）定性檢測P.gingivalis是否能產(chǎn)生細(xì)菌信號分子c-di-AMP，為探索c-di-AMP在P.gingivalis生命代謝以及牙周炎免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實驗細(xì)菌

P.gingivalis ATCC 33277菌株購自美國Microbiologics公司。

1.2主要試劑及儀器

胰酶大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）培養(yǎng)基、L-鹽酸半胱氨酸、氯化血紅素、維生素K3（Sigma公司，美國），無菌脫纖維綿羊血（廣州蕊特生物科技有限公司），c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品（Invivogen公司，美國），色譜純甲醇、乙腈（Merck公司，德國）。

Anoxomat Mark Ⅱ厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)（MART公司，荷蘭），電子天平（Sartorius公司，德國），正置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本），生物安全柜（上海振陽設(shè)備有限公司），離心機（Thermo公司，美國），AB4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（MDS Sciex公司，美國），氮吹儀（Organomation公司，美國），API 4000 QTrap HPLC-MS/ MS聯(lián)用儀配有Agilent1200高效液相色譜（Agilent Technologies公司，美國），Shim-pack XR-ODS色譜柱（島津公司，日本），Phenomenex C-18色譜柱（Phenomenex公司，美國）。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)

將P.gingivalis ATCC33277復(fù)蘇后接種于TSB血瓊脂培養(yǎng)基（含50 mL·L-1凍溶羊血、0.5 g·L-1L-鹽酸半胱氨酸、5 mg·L-1氯化血紅素和1 mg·L-1維生素K3），37 ℃厭氧培養(yǎng)（80%N2、10%CO2、10%H2）。

1.4樣品的提取與純化

樣品提取的方法參考文獻(xiàn)[12-13]。取5 mL對數(shù)生長期（OD690≈0.8）的細(xì)菌菌液，4 ℃、2 500 g離心20 min，棄上清，加入1 mL的培養(yǎng)基重懸細(xì)菌沉淀物，4 ℃、2 500 g離心20 min，棄上清，往沉淀中加入300 μL的提取液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1），冰上孵育15 min，放入95 ℃加熱10 min后立即在冰上冷卻，4 ℃、20 800 g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一支2 mL的離心管中。再往細(xì)菌沉淀物中加入200 μL的提取液，冰上孵育15 min，4 ℃，20 800 g離心10 min，收集上清（該步驟重復(fù)2次）。將所獲得的上清-20 ℃冷凍過夜。次日，4 ℃、20 800 g離心10 min，收集上清。將獲得的核酸提取物樣品在氮氣流中吹干，用甲醇復(fù)溶，上機檢測。

1.5c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

在c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品中加入1 mL色譜級甲醇，溶解，混勻，配置成1 mg·mL-1的儲存液。將標(biāo)準(zhǔn)品儲存液用色譜級水稀釋，配成10 ng·mL-1和100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.6HPLC-MS/MS檢測

采用HPLC-MS/MS檢測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品。1）環(huán)境條件：溫度15～30 ℃，相對濕度小于等于80%。2）色譜條件。色譜柱：島津Shim-pack XR-ODS （75 mm×2.0 mm）；流動相：甲醇作為有機相，10 mmol·L-1的醋酸銨加0.1%醋酸作為水相；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：室溫；進樣量：5 μL。質(zhì)譜條件見表1；離子源為ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式，噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度350 ℃，氣簾氣15.0 kPa，離子源氣體12.0 kPa。

表1　c-di-AMP的質(zhì)譜檢測條件Tab 1　Mass spectrometry conditions of c-di-AMP

1.7HPLC檢測

采用HPLC對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進一步驗證。1）環(huán)境條件。溫度：15～30 ℃，相對濕度小于等于80%。2）色譜條件。色譜柱：Phenomenex C-18（150 mm× 4.60 mm）；體系：采用A和B雙泵系統(tǒng)，流動相A相為10%乙腈+0.1%甲酸，B相為90%乙腈；流量：1.000 mL·min-1；低壓限值：0.00 bar；高壓限值：400.00 bar；梯度洗脫程序：0～20 min，A：20.0%，B：80.0%；21～24 min，A：0.0%B：100.0%；25～ 30 min，A：95.0%，B：5.0%。柱溫：室溫；進樣量：30.00 μL。HPLC結(jié)果以保留時間和紫外吸收光譜定性，即通過將c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間與P.gingivalis核酸提取樣品進行比對，再結(jié)合相應(yīng)的光譜曲線，對樣品進行定性分析。

2　結(jié)果

2.1生物信息學(xué)檢索

通過生物信息檢索發(fā)現(xiàn)，在已知基因序列的P.gingivalis菌株中具有腺苷酸環(huán)化酶活性的DisA_N結(jié)構(gòu)域（表2）。已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA均包含255個氨基酸。在美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中對已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，ATCC33277、TDC60和F0569的DisA蛋白具有完全相同的氨基酸序列，而其余8個菌株的DisA的氨基酸序列完全相同（表2）。氨基酸序列之間的相似性為99%，兩者之間只是羧基末端的第252位氨基酸不同，但DisA_N結(jié)構(gòu)域的區(qū)域為8～249位氨基酸，因此該差異氨基酸并不位于DisA_N結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

表2　牙齦卟啉單胞菌不同菌株中DisA蛋白的基因位點及其所編碼的蛋白Tab 2　Locus and protein of DisA of P.gingivalis strains

2.2HPLC-MS/MS檢測

HPLC-MS/MS檢測結(jié)果見圖1。HPLC-MS/MS檢出限按照信噪比（S/N）3∶1計算，c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間為7.49 min，P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82 min時有目標(biāo)峰出現(xiàn)（大于3 S/N），而且提取物中含有與標(biāo)準(zhǔn)品分子量一致的物質(zhì)。這表明，P.gingivalis的菌體核酸提取物中含有c-di-AMP。

圖1　牙齦卟啉單胞菌提取物的HPLC-MS/MS檢測結(jié)果Fig 1　HPLC-MS/MS results of samples from P.gingivalis

2.3 HPLC檢測

HPLC檢測結(jié)果見圖2。P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品均在15.7 min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，且二者的紫外吸收光譜相同。這表明，樣品中含有與標(biāo)準(zhǔn)品為同一物質(zhì)的c-di-AMP。

圖2　c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品和牙齦卟啉單胞菌提取物樣品的高效液相色譜檢測結(jié)果Fig 2 HPLC results of c-di-AMP standard and nucleotide samples from P.gingivalis

3　討論

c-di-AMP是細(xì)菌中廣泛存在的環(huán)二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs）信號分子，由兩分子的ATP或ADP在二腺苷酸環(huán)化酶的作用下合成而來。Pfam數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)顯示，11 352個物種中的12 702種蛋白都含有具有二腺苷酸環(huán)化酶活性的DAC結(jié)構(gòu)域即DisA_N結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域常常與其他功能的結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)在一起，而且不同功能結(jié)構(gòu)域的組合方式已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有21種之多，如DNA結(jié)合功能域、跨膜信號肽、PAS功能域、蛋白激酶功能域、磷酸化功能域以及功能未知的蛋白功能域等，說明c-di-AMP在細(xì)菌的生命代謝過程中扮演著多重角色。本研究通過生物信息檢索發(fā)現(xiàn)在已知基因序列的牙齦卟啉單胞菌的菌株中皆存在DisA_N結(jié)構(gòu)域，該結(jié)果表明牙周致病菌P.gingivalis可能會合成和分泌c-di-AMP。本

研究以P.gingivalis標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33277為實驗菌株，通過HPLC-MS/MS定性檢測P.gingivalis菌體提取物中是否存在c-di-AMP。實驗結(jié)果顯示，檢出限按照信噪比（S/N）3︰1計算，濃度為10 ng·mL-1 的c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間為7.49 min，P.gingivalis提取物樣品在保留時間為8.82 min時有目標(biāo)峰出現(xiàn)（大于3 S/N）。因此，考慮P.gingivalis核酸提取物中可能含有c-di-AMP。由于樣品與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間的差異，筆者采用HPLC法對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進行進一步的驗證。本研究采用乙腈和甲酸對樣品進行等梯度洗脫，HPLC結(jié)果以保留時間和紫外吸收光譜定性，即通過將P.gingivalis核酸提取樣品的保留時間與c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品進行比對，再結(jié)合相應(yīng)的光譜曲線，對該樣品進行定性分析。結(jié)果顯示：P.gingivalis核酸提取物樣品及c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品均在15.7 min處出現(xiàn)目標(biāo)峰，而且樣品與標(biāo)準(zhǔn)品峰的紫外吸收光譜相同，因此，可以認(rèn)為P.gingivalis核酸提取物中含有c-di-AMP，即P.gingivalis可以合成和分泌c-di-AMP。

色質(zhì)聯(lián)用法在檢測分析過程中還存在色譜條件優(yōu)化的問題，在本研究中，c-di-AMP標(biāo)準(zhǔn)品及牙齦卟啉單胞菌核酸提取物樣品兩者出峰時間不同，可能是受到了基質(zhì)干擾、流動相、色譜柱以及實驗環(huán)境等多方面的影響，檢測條件還需進一步優(yōu)化。

c-di-AMP作為細(xì)菌重要的信號分子，研究顯示：過量的c-di-AMP可干擾枯草芽孢桿菌肽聚糖的合成[8]；在金黃色葡萄球菌和乳酸球菌中，菌胞內(nèi)cdi-AMP水平的升高可幫助細(xì)菌適應(yīng)極端環(huán)境[10-11]，而且菌胞內(nèi)c-di-AMP水平的升高有助于金黃色葡萄球菌的生長和分裂，這表明其在細(xì)菌的生命代謝過程中發(fā)揮著重要作用。c-di-AMP除了在細(xì)菌的生命代謝過程中扮演第二信使的角色外，還可被細(xì)胞內(nèi)的某些DNA受體類的PRRs識別，調(diào)節(jié)干擾素（interferon）-β介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的活性，引發(fā)宿主的固有免疫反應(yīng)[14-17]。入侵到宿主細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌所產(chǎn)生的c-di-AMP可以被宿主細(xì)胞胞漿內(nèi)的一類PRRs所感知，并激活宿主細(xì)胞的Ⅰ型干擾素反應(yīng)[9]。本研究證明了牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌可合成c-di-AMP，但是c-di-AMP在其生命代謝中的作用，以及入侵到宿主細(xì)胞內(nèi)的P.gingivalis所產(chǎn)生的c-di-AMP是否能激活宿主的Ⅰ型干擾素反應(yīng)，并在牙周炎的免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮作用，還有待于進一步的深入研究。

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（本文編輯 李彩）

·綜述·

Qualitative analysis of bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate of Porphyromonas gingivalis by high per-formance liquid chromatography coupled with mass spectrometry

Tan Yongmei1, Yang Xiaojun1, Du Juan2, Zhao Wanghong1, Chen Xiaodan3, Hou Jin1.(1.Dept.of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;2.Hygiene Detection Center, School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;3.Dept.of Stomatology, The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

[Key words]bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate;Porphyromonas gingivalis;high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry

[Abstract]Objective To test whether Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis) could produce bacterial signal molecule, bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate (c-di-AMP) and lay the foundation for explorations of its roles in life metabolism and periodontitis immunity of P.gingivalis.MethodsP.gingivalis standard strain ATCC33277 was used as the experimental strain to extract nucleic acids from the bacteria.Then, c-di-AMP was detected using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS/MS).Subsequently, HPLC was used to validate the sample further.ResultsBased on the signal/noise (S/N) for 3∶1, the limit of determination of HPLC-MS/MS for peak time of c-di-AMP standard substances was 7.49 min and nucleic acid extractions from P.gingivalis was 8.82 min (S/N>3).Further confirmation of HPLC showed that nucleic acid extractions from both P.gingivalis and c-di-AMP standard substances presented goal absorbent peaks at 15.7 min, with the same ultraviolet absorbent spectrum.ConclusionThe nucleic acid extractions from P.gingivalis contained c-di-AMP, which shows that P.gingivalis could produce c-di-AMP.

[中圖分類號]R 780.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.018

[收稿日期]2015-10-16； [修回日期]2016-02-18

[基金項目]國家自然科學(xué)基金（81500870）；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長基金（2013Z006，2012C005）

[作者簡介]譚詠梅，碩士，E-mail：yobecute@126.com

[通信作者]侯晉，講師，博士，E-mail：houjin@smu.edu.cn